Analisi del rischio microbiologico associato al processo di produzione e di conservazione del mascarpone MILANO 16 OTTOBRE 2013

Analisi del rischio microbiologico associato al processo di produzione e di conservazione del mascarpone MILANO 16 OTTOBRE 2013 pag. 1 di 54

Caratteristiche Bacillus cereus Il Bacillus cereus (B.cereus) è un microrganismo gram-positivo, anaerobio facoltativo che si può trovare in forma vegetativa o in forma sporigena, è in pag. 2 di 54

grado di produrre diversi tipi di tossine dannose per l uomo. Gli alimenti dove è maggiormente rilevata la presenza del bacillo sono riso, verdure, prodotti carnei, ma anche latte e latticini (1, 2). Negli impianti di trasformazione alimentare, si possono ritrovare le spore del bacillo in quanto sopravvivano senza nutrimento o acqua per anni, sono insensibili a trattamenti termici di pastorizzazione, D 92 = 96, alle radiazioni, ai disinfettanti e ad ambienti fortemente acidi o alcalini. Le spore sono altamente idrofobe e sono in grado di aderire a qualsiasi superficie. Tali peculiarità supportano dati scientifici che riportano come l incidenza del batterio sia maggiore nel latte trattato termicamente che nel latte crudo (35-48% vs 9%) (2). Se si trovano in substrati favorevoli, le spore sono in grado di germinare e, all inizio della fase stazionaria di crescita batterica, producono tossine diarroiche o emetiche (2). Generalmente i ceppi di B.cereus sono mesofili, tuttavia, esistono ceppi del bacillo in grado di crescere a temperature inferiori a 8 C (3). In letteratura è riportato che, se il bacillo è presente nel latte pastorizzato, la sua concentrazione iniziale sia comunque contenuta, <10 ufc/ml, e che, se l alimento è mantenuto ad una temperatura inferiore a 6 C per 5 giorni, la concentrazione rimanga sotto le 10 5 ufc/ml, limite inferiore considerato dannoso all uomo (4). Tuttavia, dati dell Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emila Romagna (non ancora pubblicati) dimostrano che la concentrazione di B.cereus nella panna è maggiore rispetto a quella del latte. Le spore Le endospore di Bacillus sono strutture del batterio che gli consentono di sopravvivere in condizioni ambientali estreme. Le spore hanno uno strato esterno di cheratina che le rende estremamente resistenti al calore, alle radiazioni, alla essiccazione, ai disinfettanti e ad altre sostanze chimiche. Data la loro resistenza sono molto difficili da eliminare rappresentando una importante fonte di contaminazione degli alimenti. pag. 3 di 54

15b) Ciclo di sviluppo di un batterio sporigeno L organizzazione strutturale di base di una spora batterica può essere descritta in termini di diversi strati concentrici o di strutture. La parte centrale della spora, il core, è delimitata dalla membrana interna della prespora e contiene una copia del cromosoma batterico (Piggot et al., 1976; Driks, 1999; Henriques et al., 2000) (fig.1). Durante gli stadi intermedi del processo di sporulazione, un sottile strato di peptidoglicano simile in composizione a quello presente nella parete della cellula vegetativa, si forma al di sopra della membrana interna della prespora. Questo strato fungerà da parete per la cellula che si origina dalla germinazione della spora. Nello spazio compreso tra le membrane interna ed esterna della prespora si trova un altro sottile strato di peptidoglicano, chiamato corteccia o cortex (fig. 1). Il peptidoglicano presente nel cortex è chimicamente distinto da quello presente nella cellula vegetativa e viene formato principalmente da precursori ed enzimi che sono prodotti nella cellula madre e traslocati successivamente ai rispettivi siti di polimerizzazione attraverso la membrana esterna della prespora. La formazione del cortex è fondamentale per lo sviluppo ed il mantenimento della capacità di resistenza al calore della spora. Il cortex è circondato da un altra struttura pluristratificata di natura proteica chiamata tunica sporale o coat, il cui ruolo principale è quello di proteggere il cortex dall azione di solventi tossici, da specie reattive all ossigeno o da radiazioni UV e di garantire un appropriata risposta della spora a segnali provenienti dall ambiente esterno, come la presenza di nutrienti o di altri fattori che ne promuovono la germinazione (Setlow, 2003). Analisi per microscopia a trasmissione elettronica (TEM, Transmission Electron Microscopy) effettuate su sezioni sottili di spore di B. subtilis hanno rivelato la presenza di due strati principali all interno della tunica sporale. Uno strato più interno è formato dalla sovrapposizione di strutture lamellari che possono variare in numero da 3 a 6, allineate lungo la superficie della spora, ed uno strato più esterno che consiste di 4 o 5 strutture striate dense agli elettroni disposte anch esse parallelamente alla superficie sporale (Driks et al., 1999; Henriques et al., 2000). Entrambi questi strati della tunica appaiono strettamente associati e presentano uno spessore maggiore ai poli della spora (in queste regioni, lo strato interno e lo strato esterno della tunica hanno, rispettivamente, una larghezza di 20-30 nm e di 40-90 nm), mentre appaiono meno spessi lungo i bordi (Driks et al., 1999; Henriques et al., 2000). Non è ancora chiaro quali siano i fattori che determinano l aspetto striato o lamellare degli strati interno ed esterno della tunica pag. 4 di 54

Teoria dei trattamenti termici Blanching Pastorizzazione Sterilizzazione commerciale Ad ogni temperatura la relazione tra il numero di microrganismi sopravvissuti e il tempo è di tipo logaritmica: equazione del 1 ordine pag. 5 di 54

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I SOFTWARE CALCOLANO DIRETTAMENTE IL VALORE DI F 0 pag. 11 di 54

ANALISI DEL RISCHIO Lo studio si prefigge di analizzare il processo produttivo del mascarpone conoscendone il profilo termico durante le varie fasi di produzione (coagulazione acida, fase di calore, fase di confezionamento a caldo, fase di raffreddamento, e successiva conservazione). Conoscendo il rapporto tempo temperatura del processo e le caratteristiche della materia prima, sarà possibile individuare i microrganismi che potrebbero coinvolgere il prodotto in situazioni dannose per il consumatore e i microrganismi per i quali il rapporto tempo temperatura genera un accettabile livello di riduzione del rischio STERILIZZAZIONE DELLA LINEA CON ACQUA BOLLENTE Da una verifica in Combase predictor eseguendo un Thermal inactivation model su bacillus cereus per 10 minuti tra 90 e 95 C e sempre per 10 minuti a 95 C costanti, si evidenzia che abbiamo una inattivazione termica massima del microrganismo nel primo caso di -0,32 log nel secondo caso di -0,54 log. Tali inattivazioni sono insufficienti a garantire una adeguata sanificazione di una linea contaminata a 2 / 3 log di Bacillus cereus o sporigeni simili termoresistenti. Si conclude che la sterilizzazione con acqua bollente tra gli 85 e i 95 C per 10 minuti garantisce una inattivazione termica di altri microrganismi eventualmente presenti non termoresistenti ad esclusione del genere bacillus. La detergenza base acido è l unico mezzo chimico-fisico a garanzia della perfetta sanificazione della linea, mentre la sterilizzazione con acqua bollente non da su questo tipo di linea e lavorazione una sufficiente completa copertura. time(h) Temp.(C)conc.(Log10 cells/g) 0.00 90.00 0.00 0.00 90.00 0.00 0.00 90.00 0.00 0.01 90.00 0.00 0.01 90.00 0.00 0.01 90.00 0.00 0.01 90.00 0.00 0.01 90.00 0.00 pag. 12 di 54

0.01 90.00 0.00 0.02 90.00-0.01.. 0.15 95.00-0.25 0.15 95.00-0.26 0.15 95.00-0.26 0.15 95.00-0.27 0.16 95.00-0.27 0.16 95.00-0.28 0.16 95.00-0.29 0.16 95.00-0.29 0.16 95.00-0.30 0.16 95.00-0.31 0.17 95.00-0.31 0.17 95.00-0.32 time(h) Temp.(C)conc.(Log10 cells/g) 0.00 95.00 0.00 0.00 95.00 0.00 0.00 95.00-0.01 0.01 95.00-0.01 0.13 95.00-0.40 0.14 95.00-0.40 0.14 95.00-0.41 0.14 95.00-0.42 0.14 95.00-0.42 0.14 95.00-0.43 0.14 95.00-0.44 0.15 95.00-0.45 0.15 95.00-0.45 0.15 95.00-0.46 0.15 95.00-0.46 0.15 95.00-0.47 0.15 95.00-0.48 0.15 95.00-0.48 0.16 95.00-0.49 0.16 95.00-0.50 0.16 95.00-0.51 0.16 95.00-0.51 0.16 95.00-0.52 0.16 95.00-0.53 0.17 95.00-0.54 0.17 95.00-0.54 pag. 13 di 54

Fase coagulazione acida a caldo in serbatoio Studio della morte termica basato sull F-value (inteso come Pastorizzazione Equivalente) Con i dati ricavati di tempo temperatura si possono ipotizzare trattamenti termici equivalenti, in grado cioè di conseguire una identica distruzione batterica pur con temperature e tempi differenti, L'obiettivo di fissare un importante parametro finale, il cosiddetto F-value, che rappresenta l'effetto letale. Tabella andamento termico del prodotto in serbatoio 75 o 76 22/02/2011 4.52.00 83,9 22/02/2011 5.16.00 83,8 22/02/2011 5.34.00 82,8 22/02/2011 5.58.00 81,8 22/02/2011 6.21.00 80,8 22/02/2011 6.45.00 79,8 22/02/2011 7.17.00 78,8 22/02/2011 7.46.00 77,8 22/02/2011 8.05.00 76,8 22/02/2011 8.35.00 75,8 22/02/2011 8.52.00 74,8 22/02/2011 9.12.00 73,9 22/02/2011 9.32.00 72,9 22/02/2011 9.51.00 71,8 22/02/2011 10.11.00 70,8 22/02/2011 10.27.00 69,9 22/02/2011 10.47.00 68,8 22/02/2011 11.02.00 67,8 22/02/2011 11.17.00 66,8 22/02/2011 11.28.00 65,8 22/02/2011 11.38.00 64,8 22/02/2011 11.45.00 63,8 22/02/2011 11.52.00 62,8 max 83,90 min 62,80 media 73,8 Microrganismo Salmonella Z = 4,4 D = 0,56 Temperatura di riferimento = 65,6 C calcolo su 7 D F 65,6 = D x 7 = 3,92 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 462,56 minuti pari a 826 riduzioni decimali D= 462,56 / 0,56 = 826 riduzioni decimali ( vedi diagramma allegato ) In questa fase abbiamo 826 riduzioni decimali calcolate per il microrganismo salmonella. È stato raggiunto l obiettivo di eliminare 7D. Rischio trascurabile pag. 14 di 54

Microrganismo stafilococcus aureus Z = 9,5 D = 3 Temperatura di riferimento = 55 C calcolo su 7 D F 55 = 21 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 2391,01 minuti pari a 797 riduzioni decimali ( vedi diagramma allegato ) In questa fase abbiamo 797 riduzioni decimali calcolate per il microrganismo stafilococcus aureus. È stato raggiunto l obiettivo di eliminare 7D. Rischio trascurabile pag. 15 di 54

Microrganismo Listeria Monocytogenes Z = 5,5 D = 0,58 Temperatura di riferimento = 63,3 C calcolo su 7 D F 63,3 = 4,06 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 838,82 minuti pari a 1446 riduzioni decimali ( vedi diagramma allegato ).In questa fase abbiamo raggiunto l obiettivo di eliminare 7D. Rischio trascurabile pag. 16 di 54

Microrganismo Bacillus Cereus Z = 9,7 D = 3,1 Temperatura di riferimento = 100 C calcolo su 7 riduzioni decimali D F 100 = 3.1 x 7 = 21,70 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 0,05 minuti pari a 0,05 / 3,1 = 0,02 riduzioni decimali ( vedi diagramma allegato ) In questa fase non abbiamo raggiunto l obiettivo di eliminare 7D. Rischio non trascurabile. Microrganismo Clostridium Botulinum Z = 10 D = 0,25 Temperatura di riferimento = 121,11 C calcolo su 12 D F 121 = 3 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 0,00 minuti ( vedi diagramma allegato ) In questa fase non abbiamo raggiunto l obiettivo di eliminare 12D. Rischio non trascurabile. pag. 17 di 54

Conclusioni: nella fase coagulazione acida a caldo siamo in grado di ridurre il rischio microrganismi patogeni ad un livello accettabile fatta eccezione per gli sporigeni genere bacillus e clostridi pag. 18 di 54

Fase di confezionamento a caldo Studio della morte termica basato sull F-value Con i dati ricavati di tempo temperatura si possono ipotizzare trattamenti termici equivalenti, in grado cioè di conseguire una identica distruzione batterica pur con temperature e tempi differenti, L'obiettivo di fissare un importante parametro finale, il cosiddetto F-value, che rappresenta l'effetto letale. Tabella andamento termico (logger 2) scarico del prodotto dal serbatoio all imballaggio Rilevazioni effettuate introducendo un data logger nelle ciotole in fase di riempimento DataOra Valore 25/1/11 10.03 64,00 25/1/11 10.06 64,00 25/1/11 10.09 63,50 25/1/11 10.12 63,50 25/1/11 10.15 63,50 25/1/11 10.18 63,50 25/1/11 10.21 63,50 25/1/11 10.24 63,00 25/1/11 10.27 63,00 25/1/11 10.30 62,50 25/1/11 10.33 62,50 25/1/11 10.36 62,00 25/1/11 10.39 62,00 25/1/11 10.42 61,50 25/1/11 10.45 61,00 25/1/11 10.48 61,00 25/1/11 10.51 60,50 25/1/11 10.54 60,50 25/1/11 10.57 60,00 25/1/11 11.00 60,00 25/1/11 11.03 59,50 25/1/11 11.06 59,50 25/1/11 11.09 59,00 25/1/11 11.12 59,00 25/1/11 11.15 58,50 25/1/11 12.06 54,00 pag. 19 di 54

Microrganismo Salmonella Z = 4,4 D = 0,56 Temperatura di riferimento = 65,6 C calcolo su 7 D F 65,6 = 3,92 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 13,18 minuti pari a 23 riduzioni decimali ( vedi diagramma allegato ) In questa fase abbiamo raggiunto l obiettivo di eliminare 7D. Rischio trascurabile pag. 20 di 54

Microrganismo stafilococcus aureus Z = 9,5 D = 3 Temperatura di riferimento = 55 C calcolo su 7 D F 55 = 21 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 510,91 minuti pari a 170 riduzioni decimali ( vedi diagramma allegato ) In questa fase abbiamo raggiunto l obiettivo di eliminare 7D. Rischio trascurabile pag. 21 di 54

Microrganismo Listeria Monocytogenes Z = 5,5 D = 0,58 Temperatura di riferimento = 63,3 C calcolo su 7 D F 63,3 = 4,06 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 48,54 minuti pari a 83 riduzioni decimali ( vedi diagramma allegato ) In questa fase abbiamo raggiunto l obiettivo di eliminare 7D. Rischio trascurabile pag. 22 di 54

Microrganismo Clostridium Botulinum Z = 10 D = 0,25 Temperatura di riferimento = 121,11 C calcolo su 12 D F 121 = 3 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 0,00 minuti ( vedi diagramma allegato ) In questa fase non abbiamo raggiunto l obiettivo di eliminare 12D. Rischio non trascurabile. pag. 23 di 54

Microrganismo Bacillus Cereus Z = 9,7 D = 3,1 Temperatura di riferimento = 100 C calcolo su 7 D F 100 = 21,70 minuti F teorico F reale calcolato sulla base della curva termica = 0,00 minuti ( vedi diagramma allegato ) In questa fase non abbiamo raggiunto l obiettivo di eliminare 7D. Rischio non trascurabile. pag. 24 di 54

Fase Di Trattamento UV Ciotole Vuote In questa sperimentazione è stata verifica l efficacia del trattamento sotto lampada UV delle ciotole vuote da 250 g. La soluzione contaminante è stata ottenuta mettendo in termostato per 12 ore una bottiglia di latte pastorizzato AQ scaduto. Il metodo utilizzato prevedeva di contaminare la superficie delle ciotole con la soluzione contaminante ed il successivo recupero delle colonie tramite risospensione della carica contaminante con spugnette 3m. Il tempo di sosta delle ciotole sotto UV è stato di 4 secondi. La riduzione carica batterica dopo passaggio sotto raggi UV uguale a un logaritmo decimale CAMPIONE CBT Soluz.contaminante 5.000.000 ufc/ml ciotola pulita 1 <100 ufc ciotola pulita 2 <100 ufc ciotola contaminata 1 200.000 ufc ciotola contaminata 2 320.000 ufc ciotola Contaminata + UV 1 28.000 ufc ciotola Contaminata + UV 2 21.000 ufc ciotola Contaminata + UV 3 11.000 ufc ciotola Contaminata + UV 4 20.000 ufc 1.000.000 100.000 10.000 1.000 100 10 1 Conclusioni: nella fase confezionamento a caldo siamo in grado di ridurre il rischio microrganismi patogeni ad un livello accettabile fatta eccezione per gli sporigeni aerobi ed anaerobi. pag. 25 di 54

Fase stoccaggio refrigerato Con i dati ricavati di tempo temperatura si possono ipotizzare curve predittive di crescita dei vari microrganismi sporigeni principali patogeni (fonte ComBase predictor) Andamento di crescita Clostridium Perfrigens da ComBase Predictor Predizione in condizioni statiche di temperatura in abuso termico a 15 C in terreno di crescita da laboratorio. I 15 C sono la minima temperatura concessa da ComBase per la crescita del Cl.Perfrigens Si parte da log 2 si arriva a log 2,12 dopo 4 giorni a 15 C. Si ritiene che le condizioni di stoccaggio a 15 C in abuso termico anche per tempi notevolmente inferiori siano eccessive e fuori controllo in relazione all analisi del rischio. Celle a tali temperature sono da considerare non conformi. Modificare il processo pag. 26 di 54

Andamento crescita Clostridium Botulinum non proteolitico in condizioni statiche di temperatura Si parte da log 2 si arriva a log 2,11 dopo 4 giorni a 8 C in terreno di crescita da laboratorio Clostridium botulinum non proteolitico in condizioni statiche di temperatura 8 C Si ritiene che le condizioni di stoccaggio a 8 C in abuso termico anche per tempi notevolmente inferiori (ore) siano eccessive e fuori controllo in relazione all analisi del rischio. Celle a tali temperature sono da considerare non conformi. Modificare il processo pag. 27 di 54

Andamento crescita Clostridium Botulinum proteolitico in condizioni statiche di temperatura Si parte da log 2 si arriva a log 2,02 dopo 4 giorni a 14 C in terreno di crescita da laboratorio Clostridium botulinum proteolitico in condizioni statiche di temperatura 14 C (minima temperatura di crescita prevista da ComBase) Si ritiene che le condizioni di stoccaggio a 14 C in abuso termico anche per tempi notevolmente inferiori siano eccessive e fuori controllo in relazione all analisi del rischio. Celle a tali temperature sono da considerare non conformi. Modificare il processo pag. 28 di 54

Clotridium Botulinum non proteolitico Predizione in condizioni variabili di temperatura in abuso termico, in distribuzione frazionata in terreno di crescita da laboratorio si parte da log 2 si arriva a log 2, nessuna crescita dopo 2,4 giorni. Stoccaggio refrigerato simulando per 58 ore la distribuzione frazionata Si ritiene che le condizioni di distribuzione frazionata in temporaneo abuso termico entro i 30/40 minuti siano in controllo in relazione all analisi del rischio. pag. 29 di 54

Andamento crescita Bacillus Cereus in condizioni statiche di temperatura Predizione in condizioni statiche di temperatura in abuso termico a 8 C in terreno di crescita da laboratorio ((minima temperatura di crescita prevista da ComBase) si parte da log 2 si arriva a log 2,33 dopo 4 giorni a 8 C Si ritiene che le condizioni di stoccaggio a 8 C in abuso termico anche per tempi notevolmente inferiori siano eccessive e fuori controllo in relazione all analisi del rischio. Celle a tali temperature sono da considerare non conformi. Modificare il processo pag. 30 di 54

Bacillus Cereus Predizione in condizioni variabili di temperatura in abuso termico, in distribuzione frazionata in terreno di crescita da laboratorio si parte da log 2 si arriva a log 2,02 dopo 2,4 giorni. Stoccaggio refrigerato simulando per 58 ore la distribuzione frazionata In tale condizione il data base ComBase non definisce crescite significative di Bacillus Cereus. Segno che limitati abusi termici non favoriscono l innescarsi di crescite batteriche esponenziali. pag. 31 di 54

Studio della fase critica Raffreddamento ottimale dal confezionamento alla cella di stoccaggio (studio preddittivo ComBase) Clotridium Botulinum non proteolitico Partendo da una temperatura di 30 C arrivando ad una temperatura critica di 6,6 C, con una concentrazione di Cl.Bot. di 10 2 ufc/g dopo 50.24 ore si ha una crescita di 1,13 log. Partendo da una temperatura di 6,6 C arrivando ad una temperatura critica di 6,5 C in 16.29 ore, si ha una crescita di 0,39 log. Clotridium Botulinum non proteolitico time(h) Temp.(C) conc.(log10 cells/g) 0.00 30 2 50.24 6.6 3.13 66.53 6.5 3.52 Crescita a temperature di refrigerazione variabili da 6.5 8 C Da 2 log a 2 log in 3 giorni circa. Non c è crescita pag. 32 di 54

Bacillus Cereus Predizione in condizioni variabili di temperatura in abuso termico, in stoccaggio in cella in terreno di crescita da laboratorio Si parte da log 2 si arriva a log 3,12 dopo 3 giorni circa. Stoccaggio refrigerato in abuso termico temperatura di partenza 30 C temperatura finale 6,5. Si arriva a 6,5 C in 52 ore Secondo ComBase, con tale curva di raffreddamento di 52 ore il Bacillus Cereus cresce di più di un logaritmo (1,12). Le concetrazioni critiche per la sicurezza alimentare e per una significativa produzione di tossine è 10 5 ufc/g. Contaminazione iniziali limitate non creano un rischio, ma contaminazioni significative (10 4 ) possono generare un rischio significativo. pag. 33 di 54

ALTRE DUE CURVE CON COMBASE DI RAFFREDDAMENTO PREDITTIVO Raffreddamento ottimale (studio preddittivo) Prima curva Bacillus Cereus Fino a 50.24 ore crescita di 1 log. Da 50.24 a 66.53 ore crescita di 0,39 log time(h) Temp.(C) conc.(log10 cells/g) 0.00 30 2. 50.24 6.6 3 66.53 6.5 3.39 Bacillus Cereus Crescita a temperature di refrigerazione variabili da 6.5 8 C Da 2 log a 2,2 log in 3 giorni circa pag. 34 di 54

In questa prima curva sperimentale di raffreddamento per il controllo della crescita del bacillus cereus prevedere un raffreddamento in massimo 50,24 ore per avere una crescita di un log da log 2 a log 3 fino ad una temperatura di 6,6 C. Temperature inferiori non prevedono crescite significative Seconda curva Bacillus Cereus simulazione con maggiore velocità di raffreddamento In 16 ore si raggiungono 6 C in 41,5 ore si raggiungono i 5 C time(h) Temp.(C) conc.(log10 cells/g) 0.00 34 2. 16,00 6.00 2.06 70,36 5.00 2,17 Una seconda curva sperimentale di raffreddamento più rapida della prima prevede il raggiungimento dei 6 C in 16 ore e i 5 C in 70,36 ore. In questo caso abbiamo una crescita da 2 log iniziali a 2,17 log finali con un aumento di 0,17 log pag. 35 di 54

PARTE SPERIMENTALE Oggetto: Identificazione genetica dei principali microrganismi resistenti in 4 campioni di mascarpone della Ditta Centrale del Latte di Brescia Presso il laboratorio di Microbiologia Alimentare e Applicata del Dipartimento di Biotecnologie dell'università degli Studi di Verona è stata condotta l analisi dei campioni ricevuti dalla Ditta Centrale del Latte di Brescia allo scopo di verificare l appartenenza di genere e/o specie dei principali contaminanti microbici presenti nei suddetti campioni. Descrizione materiale ricevuto In data 25 Gennaio 2011, sono stati ricevuti 4 campioni di mascarpone, denominati rispettivamente 1, 2, 3 e 4, sui quali sono state effettuate le analisi riportate in oggetto. I campioni erano così denominati: 1. 250 g 1 pr. 6/11 2. 250 g 9/11 3. 500 g 26/11 1 4. 500 g 30/11 2 Tutti i campioni ricevuti erano sigillati. Incubazione dei campioni Allo scopo di favorire la moltiplicazione dei microrganismi eventualmente presenti, tutti i campioni, ancora sigillati e con il coperchio rivolto verso il basso, sono stati posti in termostato a 30 C per 72 ore. Dopo questo periodo di incubazione, nessuno dei 4 campioni di mascarpone mostrava gonfiore. I campioni 1, 2 e 3 mostravano una leggera separazione del siero. pag. 36 di 54

Analisi microbiologiche procedura operativa Per identificare i microrganismi presenti nei campioni di mascarpone, un aliquota di ciascun prodotto, dopo aver aperto la confezione sotto cappa in condizioni di sterilità, è stata prelevata con un ansa sterile e strisciata su 3 differenti terreni di coltura: - PCA (Plate Count Agar, Hi-Media), per la CONTA MICROBICA TOTALE; - RCM (Reinforced Clostridial Medium, Oxoid), addizionato con 1,5% agar (RCM-agar), per la conta dei CLOSTRIDI; - VRBA (Violet Red Bile Glucose Agar, Fluka), substrato selettivo per la numerazione dei COLIFORMI. Le piastre di PCA sono state incubate per 72 ore a 30 C in condizioni di aerobiosi, le piastre di RCM-agar sono state incubate per 72 ore a 27 C in condizioni di anaerobiosi, mentre le piastre di VRBA sono state incubate per 48 ore a 37 C in condizioni di aerobiosi. Sul terreno di coltura VRBA non è stata osservata crescita microbica. Dalle piastre di PCA e RCM-agar sono state selezionate alcune colonie rappresentative di ciascun campione e per ognuna di esse è stata applicata la seguente procedura: descrizione delle colonie e osservazione delle cellule al microscopio ottico (1.000 ); per le colonie cresciute su terreno PCA: inoculo in 5 ml di terreno liquido Nutrient Broth (peptone 5 g/l, estratto di carne 1 g/l, estratto di lievito 2 g/l, sodio cloruro 5 g/l) seguito da incubazione per 72 ore a 30 C in condizioni di aerobiosi; per le colonie cresciute sul terreno RCM-agar: inoculo in 5 ml di terreno liquido RCM seguito da incubazione per 72 ore a 27 C in condizioni di anaerobiosi. L identificazione degli isolati a livello di genere e/o di specie è stata ottenuta mediante sequenziamento, come descritto di seguito. Da ciascuna coltura sviluppata è stato estratto il DNA totale, applicando il protocollo messo a punto e normalmente impiegato nel nostro laboratorio. Il DNA estratto è stato utilizzato per allestire la reazione di PCR, specifica per i batteri, che prevede l amplificazione di una regione parziale (circa 700 bp) del gene codificante per l rrna 16S, seguendo le indicazioni di Rathnayake et al. (2009). Gli ampliconi ottenuti sono stati purificati tramite il kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel, Germania), quantificati e quindi inviati presso il centro di sequenziamento BMR Genomics di Padova. Con le sequenze ottenute è stata effettuata una ricerca in database per l identificazione dei microrganismi a livello di specie utilizzando i programmi disponibili per il confronto di sequenze nei database EzTaxon 2.1 (http://147.47.212.35:8080/index.jsp) e GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi). pag. 37 di 54

RISULTATI OSSERVAZIONE:Morfologia delle colonie e delle cellule ed isolamento Dopo incubazione, sulle piastre di PCA e RCM-agar sono sviluppate numerose colonie, complessivamente è stato possibile osservare 20 diverse morfologie di colonie (Tabella 1). Tabella 1: tipologie di colonie osservate e caratteri morfologici delle cellule. Campione Terreno Tipologia Descrizione colonia Descrizione cellule colonia 1. PCA 1 Colonia grande, bordo irregolare, biancastra, translucida, piatta in superficie Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, alcuni presentano un endospora, singoli e in catene 2 Colonia piccola e tonda, bordo irregolare, beige chiaro, traslucida, piatta in superficie Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, alcuni presentano un endospora, singoli e in catene RCMagar 1 Colonia media e rotonda, bordo regolare, beige, translucida, piatta in superficie Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, alcuni presentano un endospora, singoli e in catene 2 Colonia piccola e tonda, bordo regolare, beige chiaro quasi trasparente, traslucida, piatta in superficie Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, alcuni presentano un endospora, singoli e in catene 2. PCA 1 Colonia grande e rotonda, bordo regolare, beige con alone molto chiaro intorno, Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene traslucida, piatta in superficie 2 Colonia media e rotonda, bordo regolare, bianca-beige, traslucida, piatta in superficie Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene 3 Colonia piccola e tonda, bordo irregolare, giallastra, traslucida, a cupola Bacilli corti, estremità arrotondate, singoli RCMagar 1 Colonia media e tonda, bordo irregolare, beige, traslucida, a cupola Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene 2 Colonia media e tonda, bordo regolare, beige chiaro, traslucida, a cupola Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene 3 Colonia media e tonda, bordo irregolare, beige, traslucida, piatta in superficie Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene 4 Colonia piccolissima e tonda, bordo regolare, beige chiaro, traslucida, piatta in superficie Bacilli corti, estremità arrotondate, singoli pag. 38 di 54

Tabella 1: segue Campione Terreno Tipologia Descrizione colonia colonia 3. PCA 1 Colonia grande e rotonda, bordo irregolare, biancastra, traslucida, piatta in superficie 2 Colonia grande e rotonda, bordo irregolare, giallastra, traslucida, piatta in superficie RCMagar 1 Colonia piccolissima e tonda, bordo regolare, quasi trasparente, traslucida, piatta in superficie 2 Colonia piccola e tonda, bordo regolare, beige molto chiaro, traslucida, piatta in superficie 3 Colonia piccolissima e tonda, bordo regolare, bianca-beige, traslucida, piatta in superficie 4. PCA 1 Colonia molto grande e tonda, bordo irregolare, beige, traslucida, piatta in superficie 2 Colonia piccolissima e tonda, bordo regolare, bianca-beige, traslucida, piatta in superficie RCMagar 1 Colonia piccolissima e tonda, bordo regolare, quasi trasparente, traslucida, piatta in superficie 2 Colonia piccolissima e tonda, bordo regolare, bianca-beige, traslucida, piatta in superficie Descrizione cellule Bacilli abbastanza allungati, estremità piatte, alcuni presentano una spora ellissoidale, singoli e in catene di 2-4 unità Bacilli abbastanza allungati, estremità piatte, alcuni presentano una spora ellissoidale, singoli e in catene di 2-4 unità Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene Bacilli corti, estremità abbastanza piatte, singoli Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene Bacilli medi, estremità abbastanza piatte, singoli e in catene pag. 39 di 54

Identificazione: SEQUENZIAMENTO Uno, due o più isolati per ciascuno dei quattro campioni di mascarpone, provenienti dai substrati PCA e RCM-agar, e rappresentativi delle diverse morfologie di colonie, sono stati sottoposti ad analisi molecolare. Nella seguente Tabella 2 viene riportato l esito del sequenziamento per i batteri isolati dai due differenti substrati di crescita (PCA e RCM-agar). Tabella 2: identificazione dei batteri isolati tramite sequenziamento della sequenza parziale del 16S rrna. Campione Terreno Tipologia colonia Identificazione Similarità in banca dati (%) 1. PCA 1 Bacillus cereus 100 2 Bacillus cereus 100 1 Bacillus cereus 100 2 Bacillus cereus 100 2. PCA 1 Bacillus tequilensis 100 2 Bacillus tequilensis 100 3 Bacillus safensis 100 1 Bacillus tequilensis 100 2 Bacillus tequilensis 100 3 Bacillus tequilensis 100 4 Bacillus safensis 100 3. PCA 1 Bacillus sonorensis 100 2 Bacillus sonorensis 100 1 Bacillus tequilensis 100 2 Bacillus tequilensis 100 3 Bacillus tequilensis 100 4. PCA 1 Bacillus tequilensis 100 2 Microbacterium lacticum 99 RCMagar RCMagar RCMagar RCMagar 1 Bacillus tequilensis 100 2 Bacillus tequilensis 100 pag. 40 di 54