Il modello del Replicone Il replicone copre l intera regione di DNA replicata a partire da una singola origine di replicazione (es. il genoma di E.coli corrisponde ad un singolo replicone). Il replicone è costitutuito da : Replicatore: l intero set di sequenze di DNA in grado di dirigere l inizio della replicazione. Iniziatore: proteina che riconosce il replicatore e attiva l inizio della replicazione. Origine della Replicazione Siti ricchi in AT GATCTNTTNTTTT Sito di legame per l iniziatore (DnaA) TTATCCACA I replicatori degli eucarioti multicellulari sono ancora poco noti, ma sono più complessi e con una lunghezza maggiore di 1000 bp. 94
Proteine del Replisoma procariotico ed eucariotico Funzione E.coli Eucarioti Iniziatore DnaA complesso ORC Elicasi DnaB proteine MCM Primasi DnaG Pol-!/Primasi Sliding Clamp subunità " PCNA Posizionatore della Sliding Clamp Complesso # RF-C DNA polimerasi DNA Pol III Pol-!/Primasi Pol-$/Pol-# Topoisomerasi Topoisomerasi I Topoisomerasi I, II Il cromosoma circolare dei batteri costituisce un singolo replicone. In lievito vi sono circa 400 repliconi, ciascuna ha un origine di replicazione detta ARS (autonomous replicating sequence). I cromosomi umani contengono circa 30.000 repliconi 95
L inizio della replicazione La funzione dell Iniziatore, una volta legato al DNA è quella di reclutare le altre proteine necessarie per dare inizio al processo di replicazione. 96
Controllo della replicazione negli eucarioti E fondamentale che il il DNA cromosomico venga replicato completamente, e una e una sola volta, per ogni divisione cellulare. Questo può essere problematico per i cromosomi eucariotici, dato che contengono più di una origine di replicazione. Tutti i replicatori vengono inattivati, fino al ciclo 97 cellulare successivo dopo la replicazione
Formazione e attivazione del complesso pre-rc negli eucarioti Negli eucarioti in si forma un complesso pre-replicativo (pre-rc) in fase G1 che viene attivato solo quando la cellula entra in fase S. Nella fase S il complesso pre-rc viene attivato da due chinasi (Cdk e Ddk). La fosforilazione di proteine del complesso pre-rc avvia il processo di replicazione. 98
Terminazione della replicazione I meccanismi coinvolti nella terminazione della replicazione sono differenti a seconda che i cromosomi siano circolari o lineari. La replicazione di un cromosoma circolare crea due anelli concatenati che possono essere separati dalla Topoisomerasi II. Per i cromosomi lineari c è il problema della replicazione della estremità del filamento lagging. 99
Terminazione della replicazione Le telomerasi (enzimi con una componente a RNA) risolvono il problema della replicazione delle estremità dei cromosomi in quanto non hanno bisogno di uno stampo. Il legame tra la sequenza di RNA complementare alla sequenza telomerica genera il complesso stampo-innesco su cui agisce l enzima, la cui attività è simile a quella della trascrittasi inversa. La lunghezza del telomero viene mantenuta circa costante. Le telomerasi sono molto attive durante lo sviluppo embrionale, in cellule staminali o in riproduzione In cellule in coltura, con l insorgenza della senescenza, le telomerasi sono meno attive e i cromosomi si accorciano Al contrario in cellule tumorali le telomerasi sono attive o iperattive (causa o effetto?) Le telomerasi rappresentano un bersaglio per la terapia antitumorale. 100
Mutabilità e Riparazione del DNA La vita e la biodiversità dipendono da un giusto equilibrio tra l insorgenza di nuove mutazioni e la capacità di ripararle. La mutabilità del DNA dipende: i) dagli errori nella replicazione; ii) lesioni al DNA causate da agenti chimici o radiazioni. Se le mutazioni non vengono riparate possono essere fissate. Per mutazioni si intendono tutti i possibili cambiamenti che alterano la sequenza del DNA. L alterazione di un singolo nucleotide viene definita mutazione puntiforme. Transizioni A Trasversioni T G C Altri tipi di mutazioni sono inserzioni, delezioni (es. nei microsatelliti) o grossi riarrangiamenti del DNA (inserimento di trasposoni, retrovirus, ecc.). Le mutazioni possono essere spontanee, come gli errori nella replicazione dovute alle peculiari caratteristiche delle basi 101 azotate (tautomeria), o indotte da danno chimico o radiazioni ionizzanti.
Riparazione dei Mismatch Alcune mutazioni sfuggono il meccanismo di correzione delle bozze e creano dei misappaiamenti che se non vengono rimossi rapidamente si propagheranno nelle duplicazioni successive. In E.coli il sistema di riparazione dei mismatch utilizza le proteina MutS, MutL e MutH. Intervengono anche una elicasi, una esonucleasi, la polimerasi e la ligasi. Il filamento stampo viene riconosciuto in virtù del suo pattern di metilazione prodotto dalla DAM metilasi. 102
Alterazioni chimiche del DNA Le principali alterazioni chimiche cui va incontro il DNA sono la 1) deaminazione; 2) la depurinazione; 3) l ossidazione e 4) l alchilazione. Gli agenti mutageni più potenti sono le nitrosammine, gli agenti ossidanti (formazione di 8-oxoG), i radicali liberi, la luce ultravioletta, le radiazioni ionizzanti. HO 103
Alterazioni chimiche del DNA Altri potenti mutageni sono gli analoghi delle basi azotate, che inducono mutazioni puntiformi, e gli agenti intercalanti che inducono piccole inserzioni o delezioni. 104
Sistemi di riparazione del DNA Le alterazioni del DNA possono avere due conseguenze: i) impedimento alla replicazione o alla trascrizione (dimeri di timina, nick, rotture dello scheletro del DNA); ii) appaiamenti errati che sarebbero fissati nei successivi cicli di replicazione. E quindi fondamentale l intervento di sistemi di riparazione che identifichino e riparino il danno, prima che questo si propaghi nelle replicazioni successive. I sistemi di riparazione possono essere di diverso tipo: 1) Riparazione diretta del danno (eliminazione dei dimeri di timina, demetilazione) O 6 -metil-guanina 105
Sistemi di riparazione del DNA 2) Riparazione per escissione di basi. Vi sono glicosidasi diverse per diversi tipi di lesione. La base danneggiata viene riconosciuta dalla glicosidasi in quanto protrude fuori dalla doppia elica. 106
Sistemi di riparazione del DNA 3) Riparazione per escissione di nucleotidi. La distorsione nella catena, prodotta dalla lesione, induce la rimozione di un corto segmento a singolo filamento che include la lesione. Tale attività in E.coli dipende dall attività di 4 proteine (UvrA-B- C-D). Un sistema analogo, ma molto più complesso è attivo negli eucarioti (proteine XPA, XPC, ecc.). Lo stesso sistema è capace di recuperare le molecole di RNA polimerasi bloccate in seguito a lesione. Tale fenomeno noto come riparazione accoppiata alla trascrizione garantisce la riparazione del DNA in regioni attivamente trascritte. 107
Sistemi di riparazione del DNA 4) Riparazione per ricombinazione. Nel caso di rottura dei due filamenti non c è la disponibilità di uno stampo per effettuare la riparazione In questo caso il sistema di riparazione delle rotture del doppio filamento (double-strand break) recupera le informazioni dalla coppia di filamenti del cromosoma fratello attraverso un evento di ricombinazione. 5) Replicazione translesione. Nel caso in cui il danno non sia stato riparato (es. sito apurinico) esiste un ulteriore sistema di sicurezza che consente la sintesi del DNA - con specifiche DNA polimerasi - oltre la lesione. Anche se la sintesi translesione è poco fedele, consente di completare il processo replicativo (risposta SOS). 108