POPOLAZIONI ASININE SICILIANE: CARATTERIZZAZIONE GENETICA MEDIANTE MARCATORI MICROSATELLITI. S. Bordonaro, A.M. Guastella, A. Criscione, A. Zuccaro, D. Marletta, G. D Urso DACPA: sezione di Scienze delle Produzioni Animali, Facoltà di Agraria, Università degli studi di Catania, via Valdisavoia, 5 Catania. e-mail: s.bordonaro@ unict.it Sicilian Donkey s Populations: Genetic Characterization By Microsatellite Markers. SUMMARY The aim of this study was to assess the genetic diversity and to establish the relationship among the three autochthonous Sicilian donkey s populations (Ragusano, Pantesco and Grigio Siciliano ) using a set of microsatellite markers. A total of 105 individuals reared all over Sicily were genotyped at 11 loci generating 76 alleles. The number of alleles per locus varied from 3 to 11 in HTG4 and HTG7 respectively. According to the G st value (0.158) HMS3 was the most discriminating marker in the set, whereas HTG4 was the less one. Low genetic variability was found in Pantesco (H exp 0.499) when compared with Ragusano (H exp 0.610) and Grigio Siciliano (H exp 0.627). Genetic distances estimated by different methods (D a and D s ) and the related NJ and UPGMA dendrograms agree with the evidence that Pantesco endangered breed is more closely related to Grigio Siciliano population than to Ragusano breed. INTRODUZIONE L inventario delle razze asinine europee conta 23 razze/popolazioni, la maggior parte delle quali a rischio di estinzione (http://dad.fao.org). Per diversi anni l asino, perduta la funzione primaria di forza motrice, non ha trovato nelle attività zootecniche altri spazi se non quelli di natura affettiva ed amatoriale. Oggi si assiste ad un cambiamento di tendenza: l allevamento dell asino si va diffondendo e viene finalizzato alla produzione del latte e alla onoterapia. La Sicilia è la prima regione italiana per capi asinini allevati e detiene un interessante patrimonio di biodiversità autoctona che comprende Ragusano e Pantesco, iscritti al Registro anagrafico delle razze/popolazioni equine riconducibili a gruppi etnici locali, e il Grigio Siciliano popolazione non ancora ben caratterizzata. L asino Ragusano, il più giovane tra i tipi genetici selezionati
(ufficialmente riconosciuto nel 1953), è il risultato del ripetuto incrocio tra la cosiddetta razza siciliana con il Pantesco e il Catalano (Bonadonna, 1976). Il Pantesco, che oggi conta pochissimi capi allevati e sottoposti ad un regime di salvaguardia, era un tempo molto diffuso in provincia di Trapani e nelle isole Egadi. Secondo quanto riportato nei modelli A-ter del Vecchio Deposito Stalloni di Catania stalloni Panteschi vennero impiegati presso le stazioni di monta dal 1927 al 1972 quando quest opera di selezione, per motivi non ben noti, si interruppe. L asino Grigio siciliano, comunemente conosciuto come Ferrante, ha origini molto antiche: la presenza in Sicilia di soggetti di piccola taglia e dal mantello esclusivamente bigio è documentata già dalla fine del 1800 (Liotta e Chiofalo, 2005). Attualmente (2006) sono iscritti al Registro Anagrafico circa 1500 Asini Ragusani e 43 Asini Panteschi, mentre l asino Grigio Siciliano conta circa un centinaio di soggetti, recentemente censiti. Tutti i tipi genetici autoctoni siciliani risultano pertanto a rischio di estinzione. Il numero esiguo di capi allevati impone interventi urgenti di recupero e salvaguardia in situ: localizzazione geografica di animali iscritti al Registro anagrafico e verifica dello stato di inbreeding. Scopo dell indagine è stata la caratterizzazione della variabilità genetica interna e delle relazioni genetiche tra le 3 razze/popolazioni asinine siciliane, mediante l impiego di un set di marcatori molecolari microsatelliti. Tali marcatori, dispersi nel genoma, non soggetti a selezione diretta, altamente eterozigoti vengono impiegati nella caratterizzazione della biodiversità, nella ricostruzione dei pedigree e nella pianificazione di schemi di accoppiamento volti alla conservazione della variabilità genetica. MATERIALE E METODI Campioni di sangue sono stati prelevati da 105 capi appartenenti ai 3 tipi genetici autoctoni della Sicilia (61 Ragusano, 37 Pantesco e 7 Grigio Siciliano ) allevati in 9 aziende. Gli asini di razza Ragusana e della popolazione Grigio Siciliano sono stati selezionati tra soggetti non parenti almeno in seconda generazione, mentre per la popolazione Pantesca sono stati prelevati nel Maggio 2005 tutti i soggetti allevati presso l Azienda S. Matteo dell Ispettorato Ripartimentale delle Foreste di Erice (TP). Dai leucociti è stato estratto il DNA con metodo fenolo-cloroformio; 50 ng di DNA è stato amplificato per un set di 11 marcatori microsatelliti (HTG10, VHL20, HTG7, HTG4, AHT5, AHT4, HMS3, HMS6, HMS7, HMS2 e HTG6), localizzati su diversi cromosomi, in una reazione di PCR multiplex da 11.5 μl di volume finale. I prodotti di amplificazione sono stati
miscelati con uno standard interno per la taglia (GeneScan 350 ROX internal size standard) prima di essere caricati su un gel di poliacrilammide e analizzati su un sequenziatore Applera 377 corredato dei programmi Genescan e Genotyper. Il programma Genepop 3.3 (Raymond and Rousset, 1995) è stato usato per calcolare le frequenze alleliche, l equilibrio genetico di Hardy- Weinberg e le F statistiche in accordo con Weir e Cockeram (1984). Per ciascun locus sono state stimate l eterozigosità osservata (H oss ) e la diversità genetica, misurata quale eterozigosità attesa (H att ); il numero di alleli effettivi per locus (n e ) è stato calcolato in accordo con Hartl e Clark (1989). Il pacchetto DISPAN (Ota T., 1993) è stato impiegato per definire la diversità genetica e i parametri ad essa associati, per calcolare le distanze genetiche (D s e D a ) tra le razze/popolazioni asinine (Nei M. 1978; Nei et al., 1983) e costruire i relativi dendrogrammi. RISULTATI Nel campione testato sono stati generati un totale di 76 alleli, 6.91 alleli per locus, (tabella 1). Il numero di alleli osservati per ciascun locus su tutte le popolazioni è variato da 3 (al locus HTG4) a 11 (al locus HTG7). Tra le razze/popolazioni l Asino Ragusano conta il maggior numero di alleli (73, 6.64 per locus), il Pantesco il più basso (44 alleli, 4 per locus). Il numero medio di alleli effettivi, che è una misura meno sensibile alla dimensione della popolazione, riproduce lo stesso andamento, con i valori di 3.14, 2.95 e 2.27 per il Ragusano, il Grigio Siciliano e il Pantesco rispettivamente. In totale sono stati identificati 23 alleli privati (30% degli alleli generati) di cui solo 2 a frequenze superiori a 0.10: 20 alleli privati sono stati individuati in Ragusano (l allele 97 del VHL20 con frequenza pari a 0.120) per un massimo di 4 alleli privati al locus AHT5, 2 alleli privati sono stati osservati in Pantesco e solo 1 in Grigio Siciliano (allele 128 al locus AHT4) ma questo con una frequenza pari a 0.100. I valori di Gst calcolati per locus (tabella 1) rivelano che il coefficiente di differenziazione assume valore massimo al locus HMS3 e minimo al locus HTG4. Le tre popolazioni non risultano in equilibrio genetico, a causa del deficit di eterozigoti a diversi loci che è risultato significativo in tutte le razze/popolazioni. L eterozigosità osservata (H oss ), che è una misura della variabilità individuale è variata tra 0.39 nella razza/popolazione Pantesca e 0.50 nel Ragusano (tabella 2); mentre la diversità genetica, stimata come etozigosità attesa (H att ), è variata da 0.63 nel Grigio Siciliano a 0.50 nel Pantesco.
Il valore di Fis, che rappresenta lo scostamento dall assortimento indipendente, è risultato particolarmente elevato nel ridotto campione di Grigio Siciliano (0.26), ove ha assunto valore superiore a quello registrato in Pantesco e Ragusano. Sulla base delle distanze genetiche (tabella 3) il Pantesco conferma la propria originalità genetica (distanza genetica media 0.1129) nel set delle razze/popolazioni siciliane. Il dendrogramma UPGMA costruito sulla base delle distanze genetiche (D a ) stimate mostra come le razze/popolazioni Ragusano e Grigio Siciliano risultino molto vicine (figura 1). DISCUSSIONE Il numero medio di alleli per locus nelle razze/popolazioni asinine siciliane (6.91) è risultato inferiore a quelli osservati in cinque razze spagnole (Aranguren-Mendez et al., 2001) e in tre razze/popolazioni Croate (Ivankovic et al., 2002) e superiore a quello ottenuto nell asino Sardo (Pinna et al., 1999). L eterozigosità attesa nelle razze/popolazioni siciliane presenta valori inferiori a quanto riportato per le razze Spagnole e per le razze/popolazioni allevate in Croazia (Aranguren-Mendez et al., 2001; Ivankovic et al., 2002). La ridotta variabilità genetica osservata in Ragusano, Grigio Siciliano e Pantesco, per quanto prevista soprattutto in quest ultimo, rende urgenti gli interventi di salvaguardia e gestione di queste risorse genetiche a rischio, da realizzare attraverso opportuni piani di accoppiamento, aumentando il numero degli stalloni autorizzati alle monte e riducendo al minimo la parentela tra i riproduttori. Questi interventi vanno messi in atto prima che il livello di inbreeding possa comportare una marcata riduzione della fitness in termini di malattie genetiche, disordini riproduttivi e riduzione della produzione (Meszaros et al., 1998). I valori positivi di Fis indicano un elevato scostamento dalla panmissia e confermano la presenza di un significativo deficit di eterozigoti, sorprendentemente più elevato nel Grigio Siciliano. La ridotta distanza genetica tra le tre razze/popolazioni siciliane rivela una stretta relazione tra questi tipi genetici, in particolare tra il Ragusano ed il Grigio Siciliano, probabilmente dovuta all origine comune. Va infatti considerato che negli anni precedenti al 1953, anno di riconoscimento ufficiale del Ragusano, gli asini Siciliani presentavano indistintamente i mantelli baio e grigio. BIBLIOGRAFIA Aranguren-Mendez J., Jordana J. and Gomez M. 2001. Genet. Sel. Evol. 33: 433-442.
Bonadonna T. 1976. in Etnologia zootecnica Trattato di Scienza e Tecnica delle Produzioni Animali. Vol VI. Ed. UTET pp. 672-673. Hartl D.L. and Clark A.G. 1989 in Principles of Population Genetics. 2 ed. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Ivankovic A., Kavar T., Caput P., Mioc B., Pavic and Dovc P. 2002. Animal Genetics 33: 169-177. Liotta L. e Chiofalo L. 2005. Italian Journal of Animal Science. 4:suppl.2. p. 443. Meszaros S.A., Banks R.G., van der Werf J.H.J., 1998. Proc. 6 th WCGALP, 25: 415. Nei M. 1978 Genetics. 89: 583-590. Nei M., Tajima F., Tateno Y., 1983. J. Mol. Evol., 19: 153-170. Ota T. 1993 An. Pennsylvania State University. University Park, PA 16802, USA. Pinna W., Cosseddu G.M., Moniello G., Zimdars C., Olek K. 1999. Atti LIII Congresso SISVet, Montecatini Terme 16-18 settembre 1999, pp. 399-400. Raymond M., Rousset F., 1995. J. Heredity, 86: 248-249. Weir B.S. and Cockerham C.C., 1984. Evolution, 38: 1358-1370. RINGRAZIAMENTI Lavoro eseguito con finanziamento Progetti di Ricerca di Ateneo 2003. Si ringrazia per la collaborazione l Istituto Sperimentale Zootecnico per la Sicilia, l Ispettorato Ripartimentale delle Foreste di Trapani, l ASILAT s.r.l., l Azienda Agricola Leggio di Tumino Maria Grazia e la fattoria Cugno Lupo di Cavalieri Vincenzo. Tabella 1. Numero di alleli, Ht e Gst per locus e valori medi nelle 3 razze/popolazioni asinine siciliane. LOCUS TUTTE POPOLAZIONI RAG PAN GRI Ht Gst HTG10 7 7 5 5 0.758 0.084 VHL20 6 6 3 3 0.656 0.090 HTG7 11 11 6 7 0.796 0.067 HTG4 3 3 2 2 0.172 0.006 AHT5 10 10 6 6 0.816 0.087 AHT4 9 8 6 6 0.800 0.084 HMS3 8 7 3 4 0.602 0.158 HMS6 4 4 2 3 0.536 0.088 HMS7 6 6 3 2 0.315 0.024 HMS2 7 6 5 3 0.566 0.048 HTG6 5 5 3 4 0.700 0.117 TOTALE 76 73 44 45 MEDIA 6.91 6.64 4.00 4.09 0.611 0.077
Tabella 2. Eterozigosità media osservata (H oss ), eterozigosità media attesa (H att ) e valori di Fis nelle 3 razze/popolazioni asinine siciliane. H oss H att Fis RAGUSANO 0.50 0.61 0.19 PANTESCO 0.39 0.50 0.22 GRIGIO SICILIANO 0.48 0.63 0.26 Tabella 3. Distanze genetiche (D a ) tra le 3 razze/popolazioni asinine siciliane. RAGUSANO PANTESCO GRIGIO RAGUSANO 0.1737 0.0951 PANTESCO 0.1737 0.1648 GRIGIO 0.0951 0.1648 Media 0.0896 0.1128 0.0866 Figura 1. Dendrogramma UPGMA costruito sulla base delle distanze genetiche D a tra le 3 razze/popolazioni asinine siciliane