Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

2 Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica Società Italiana di Genetica Medica Revisione del gruppo di lavoro: dicembre 2004 Data di aggiornamento: 24 ottobre 2005

AUTORI Massimo Gennarelli, Università di Brescia e Ospedale Fatebenfratelli IRCCS, Brescia Giuseppe Novelli, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata Annalisa Botta, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata Leila Baghernajad Salehi, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata Emanuela Bonifazi, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata Laura Vallo, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata Cecilia Garré, Università di Genova Redazione Laura Perrotta, Zadig, Milano Impaginazione Giovanna Smiriglia 2

Indice Riassunto Pag. 5 Test postnatale per DM1 e DM2» 5 Analisi molecolare» 5 Indicazione all indagine» 5 Test prenatale per DM1» 5 Analisi molecolare» 5 Indicazione all indagine» 5 La malattia: mutazioni e fenotipo» 6 Diagnosi» 6 Genetica» 6 Analisi genetico-molecolare della malattia di Steinert, Dystrophia myotonica 1 (DM1)» 8 Analisi genetico-molecolare della miopatia miotonica prossimale o Promm, sindrome di Ricker (DM2)» 9 Indicazioni per i test» 10 Indicazioni per l analisi molecolare della DM1» 10 Test di conferma nei pazienti sintomatici» 10 Test presintomatico in soggetti asintomatici» 10 Test sui minori» 10 Test prenatale» 11 Indicazioni per l analisi molecolare della DM2» 11 Test di conferma nei pazienti sintomatici DM1 negativi» 11 Test preclinico in soggetti asintomatici» 12 Diagnosi differenziale» 12 Riservatezza» 13 Informazioni al paziente» 13 Bibliografia essenziale» 14 Indice 3

Riassunto Test postnatale per DM1 e DM2 Analisi molecolare E consigliato il protocollo diagnostico basato sulla long PCR (reazione polimerasica a catena lunga) che permette di quantificare l entità dell espansione al locus DM1 in tutti i casi (anche nelle forme congenite) e dell espansione al locus DM2 in circa il 70% dei casi. La metodica permette di rilevare sempre la presenza di espansioni CTG e CCTG con un accuratezza del 100%. Indicazione all indagine Test di conferma della diagnosi clinica nei pazienti con quadro clinico compatibile con DM1 o DM2, DM1 negativi: la predizione prognostica in base alla grandezza dell espansione è sconsigliata per l assenza di una correlazione tra genotipo e fenotipo, in particolare nella DM2. Test presintomatico in soggetti asintomatici e consanguinei di pazienti DM, a scopo clinico e predittivo per identificare la provenienza della mutazione nella famiglia e per modificare il rischio a priori di avere ereditato la mutazione DM: si raccomanda la consulenza genetica a conclusione dell indagine molecolare poiché quest ultima non può dare informazioni sull età di insorgenza, né sul tipo di sintomi e sulla loro progressione. Test prenatale per DM1 Analisi molecolare E consigliato il protocollo diagnostico per l analisi postnatale integrato con lo studio di segregazione del polimorfismo intragenico Alu. In termini predittivi, è possibile escludere le forme cliniche più gravi solo per espansioni inferiori a 150 CTG. Indicazione all indagine Qualora uno dei genitori abbia un rischio del 50% di essere portatore della malattia va sottoposto al test genetico e solo in seguito si procede all analisi prenatale, se si ritiene necessaria. Riassunto 5

La malattia: mutazioni e fenotipo La distrofia miotonica (DM) è la malattia muscolare più comune dell adulto (circa 1/8.000 individui) è caratterizzata da espressività variabile e si presenta in forme congenite, forme con esordio in età infantile o, più spesso, forme con esordio in età adulta. La sintomatologia clinica comprende, in diversa associazione, miotonia, distrofia, aritmie cardiache, cataratta, calvizie, ipogonadismo, alterazioni della tiroide e intolleranza al glucosio. Diagnosi La diagnosi è prioritariamente clinica e strumentale. L elettromiografia rileva scariche miotoniche caratteristiche e l analisi dell occhio mediante lampada a fessura rileva le peculiari opacità nel cristallino. Alla biopsia muscolare non ci sono alterazioni istologiche peculiari, anche se a volte si osserva la centralizzazione dei nuclei nelle fibrocellule muscolari. Genetica Al momento sono conosciuti due geni-malattia che mutati sono responsabili del fenotipo: il gene DMPK e il gene ZNF9, rispettivamente associati alla DM1 e alla DM2. La mutazione DM1 (OMIM n. 160900) coinvolge la tripletta nucleotidica CTG normalmente presente nella regione non tradotta all estremità 3 del gene DMPK (DM proteina chinasi) localizzato sul braccio lungo del cromosoma 19 (19q13.3) ed è presente nel 98% circa dei pazienti. La DM2 (OMIM n. 602668) coinvolge la sequenza ripetuta CCTG contenuta nell introne 1 del gene ZNF9 (zinc finger protein 9). Un terzo locus è stato identificato sul cromosoma 16 in alcune famiglie negative alle mutazioni DM1 e DM2, mentre un altro locus, originariamente mappato sul cromosoma 15 da uno studio di una sola famiglia nella quale i soggetti affetti manifestano oltre alla sintomatologia tipica anche una demenza frontotemporale, si è rivelato infondato e pertanto non esiste. 1,2 Il numero di ripetizioni CTG nel locus DM1 è molto variabile nella popolazione. Gli individui sani hanno alleli contenenti da 5 a 35 ripetizioni e in questo intervallo gli alleli sono stabili e non vanno incontro ad amplificazione. Gli alleli con un numero di ripetizioni compreso fra 36 e 49 devono essere considerati come alleli premutati potenzialmente instabili. Quando la tripletta supera le 50 ripetizioni gli alleli diventano instabili e si ha l espressione della patologia: i pazienti con fenotipo lieve hanno alleli con 50-150 duplicazioni di CTG, i pazienti con la forma classica della malattia hanno alleli con 150-1.000 copie e nei pazienti con la forma grave (congenita) la tripletta può essere ripetuta più di 2.000 volte. 6 La malattia: mutazioni e fenotipo

In generale, più è grave la malattia e maggiore è l espansione CTG; inoltre c è una correlazione significativa fra l età d insorgenza della malattia e l aumento delle ripetizioni. Questa evidenza spiega le basi molecolari della cosiddetta anticipazione della DM nelle generazioni successive, cioè l aumento della gravità clinica associato alla più precoce età di insorgenza. Il livello d instabilità intergenerazionale dovuto al numero delle triplette dipende anche dal sesso del genitore affetto: l incremento è maggiore quando la trasmissione è materna piuttosto che paterna. Questo spiega la predominante trasmissione materna delle forme congenite, che sono le più gravi dal punto di vista clinico. Per quanto riguarda la DM2 3 è stato osservato che l ampiezza dell espansione CCTG nel gene ZNF9 nei figli affetti è generalmente inferiore a quella presente nei genitori, tuttavia il notevole mosaicismo somatico (presenza di espansioni diverse nei diversi tessuti) rende difficile la conferma di questo risultato. Non è stata invece osservata alcuna correlazione significativa fra l età di esordio della DM2 e l ampiezza dell espansione CCTG. La proteina ZNF9, che contiene 7 domini zinc finger, si ritiene leghi l RNA. Viene espressa in molti tessuti e i livelli di espressione più alti si trovano nel cuore e nel muscolo scheletrico, che sono i tessuti prevalentemente coinvolti nella DM2. Il trascritto mutante del gene ZNF9 si accumula in foci nucleari in maniera del tutto simile a quello che si osserva per il trascritto mutato del gene DMPK nella DM1. Questa osservazione avvalora l ipotesi corrente di un ruolo patogenetico dell RNA espanso che sequestrerebbe le proteine che legano la ripetizione CUG/CCUG, necessarie per il processamento nucleare dell RNA, sottraendole ad altri trascritti e inibendo così importanti funzioni cellulari. La malattia: mutazioni e fenotipo 7

Analisi genetico-molecolare della malattia di Steinert, Dystrophia myotonica 1 (DM1) L analisi diretta dell espansione della ripetizione CTG mediante la combinazione delle tecniche della PCR e del Southern blot permette un accurata caratterizzazione di tutte le mutazioni DM1. Il Southern blot condotto su DNA genomico trattato con un enzima di restrizione (come EcoRI, BamHI, NcoI, o BgII) è la procedura di base per l analisi dei frammenti contenenti da 100 a oltre 2.000 duplicazioni di CTG. Fra le numerose sonde per l ibridazione disponibili presso i laboratori di ricerca ci sono cdna25, pgb2.6, p5b1.4 e pmdy1. Ma il Southern blot non permette di distinguere gli alleli con piccole espansioni: in questo caso l approccio migliore è l analisi mediante PCR. Alleli con un numero di ripetizioni compreso fra 5 e 200 possono essere facilmente identificati con la PCR, che prevede l utilizzo come primer di oligonucleotidi sintetici complementari alle regioni vicine alla sequenza ripetuta. Un ulteriore approccio diagnostico molecolare è rappresentato dalla long PCR che consente di amplificare frammenti contenenti da 5 a 3.700 copie di CTG, che includono quindi tutti gli alleli normali e mutati. 4 Questa tecnica prevede una reazione polimerasica a catena seguita da due fasi, una per la caratterizzazione degli alleli normali o di quelli con piccole espansioni e un altra per l identificazione delle espansioni più grandi. Nella prima fase il prodotto di PCR viene sottoposto a elettroforesi capillare per mezzo di un sequenziatore automatico. Qualora vengano individuati due alleli distinti di dimensioni normali, il soggetto analizzato è da considerare sano. Se è visibile invece un solo segnale, il campione può essere un omozigote sano oppure un portatore di un allele espanso e uno normale. In questo caso il prodotto della PCR passa alla seconda fase di analisi in cui viene caricato su un gel di agarosio, trasferito su filtro di nylon e ibridato con una oligo-sonda [CTG] 5. Le tecniche di PCR e di Southern blot per l analisi diretta delle mutazioni/espansioni DM richiedono una competenza specifica e devono essere condotte in laboratori che rispondano a rigorosi criteri di accuratezza. 8 Analisi genetico-molecolare della malattia di Steinert, Dystrophia myotonica 1 (DM1)

Analisi genetico-molecolare della miopatia miotonica prossimale o Promm, sindrome di Ricker (DM2) L espansione della sequenza CCTG del locus DM2 viene analizzata mediante long PCR alla quale è necessario affiancare il Southern blot secondo il protocollo descritto in Liquori et al. 2 La procedura consente l analisi di frammenti contenenti un numero di ripetizioni CCTG compreso tra 75 e 1.100 ma, a causa della elevatissima instabilità ed eterogeneità somatica, la tecnica fallisce nell evidenziare la mutazione nel 20% dei pazienti DM2. 3 Per questa ragione sono stati sviluppati metodi diagnostici alternativi che, pur essendo incapaci di caratterizzare le espansioni più grandi, riescono però a individuarne sempre la presenza. La metodica della long PCR descritta nel paragrafo precedente ha una sensibilità del 100% per le espansioni comprese tra 5 e 3.700 ripetizioni. La recente caratterizzazione 5 di un polimorfismo localizzato nel primo introne del gene ZNF9 fornisce uno strumento in più nell analisi genetico-molecolare della DM2. Questo polimorfismo consiste in una sostituzione nucleotidica C/A che crea o distrugge un sito di restrizione ApaI. Tale polimorfismo è risultato essere in linkage disequilibrium con la mutazione DM2. Le tecniche di PCR e/o Southern blot per l analisi diretta delle mutazioni/espansioni DM richiedono una competenza specifica e devono essere quindi condotte in laboratori che rispondono a rigorosi criteri di accuratezza. Recentemente alcuni autori 6 hanno proposto l impiego dell ibridazione in situ per visualizzare i trascritti abnormi del gene DM2 in sezioni istologiche di biopsie muscolari. A nostro parere, il test può essere utilizzato in alcuni casi come integrazione degli altri metodi. Analisi genetico-molecolare della miopatia miotonica prossimale o Promm, sindrome di Ricker (DM2) 9

Indicazioni per i test Indicazioni per l analisi molecolare della DM1 Test di conferma nei pazienti sintomatici Conferma della diagnosi clinica: il test è la conferma definitiva per il medico che sta conducendo la diagnosi in un paziente con sintomi clinici tipici. Definizione di diagnosi clinica incerta: il test genetico è utile nei casi in cui il paziente abbia un quadro clinico compatibile sia con DM sia con altre patologie. Commenti Dal momento che la correlazione fra l ampiezza dell espansione e la gravità della malattia non è assoluta, non è appropriato fare una predizione della prognosi della malattia sulla base del numero di triplette risultate dall analisi molecolare. Poiché i risultati del test genetico hanno conseguenze dirette anche su altri membri della famiglia del probando, la consulenza genetica deve essere disponibile sia per il probando sia per qualsiasi altro membro della famiglia. Recentemente sono stati descritti casi di pazienti con mutazione DM1 con un fenotipo associato alla malattia facio-scapolo-omerale (FSH), in alcuni di questi erano presenti entrambe le mutazioni DM1 e FSH (B. Eymard, comunicazione personale). Test presintomatico in soggetti asintomatici Viene condotto per identificare pazienti asintomatici e consanguinei dei pazienti a scopo clinico e predittivo, oppure per conoscere il rischio a priori di avere ereditato la mutazione DM, che viene ridotto a zero in caso di esito negativo. Commenti Al momento attuale non è possibile dare informazioni certe sull età d insorgenza della malattia o sul tipo di sintomi e sulla loro progressione. Per questo motivo il test su pazienti asintomatici deve sempre comprendere la consulenza genetica condotta da personale qualificato ed esperto. Test sui minori A meno che non sussistano ragioni mediche pressanti, i minori non dovrebbero essere sottoposti a test genetico. Questa decisione è volta alla tutela dell individuo che si sottopone al test, che deve essere in grado di comprendere pienamente le conseguenze del risultato di tale analisi. Un eccezione appropriata viene fatta nel caso in cui il minore presenti i sintomi clinici della malattia: il test genetico in questo caso viene infatti condotto per avere la conferma diagnostica della presenza della malattia oppure per monitorare adeguatamete eventuali gravidanze successive della coppia. 10 Indicazioni per i test

Test prenatale In caso di diagnosi certa di distrofia miotonica in uno dei genitori, il test prenatale può essere usato per stabilire il rischio del feto di aver ereditato l allele mutato. Nel caso in cui uno dei genitori abbia un rischio del 50% di essere portatore della malattia si procede in due fasi: prima viene sottoposto al test il genitore a rischio e poi si esegue l analisi prenatale solo se è ancora necessaria. Si raccomanda l esecuzione durante il monitoraggio prenatale anche del test di segregazione del polimorfismo Alu di inserzione/delezione del gene DMPK. Questo polimorfismo è in disequilibrio con la mutazione DM e quindi di grande aiuto diagnostico, specie durante l accertamento di espansioni di grandi dimensioni non facilmente analizzabili. A causa degli intervalli di sovrapposizione delle dimensioni dell espansione nelle diverse forme della malattia, dell incertezza riguardo al mosaicismo somatico e all instabilità dell amplificazione delle triplette nella vita fetale non è possibile predire se il feto svilupperà la forma congenita di DM o quella a esordio più tardivo. E possibile escludere con una buona attendibilità statistica le forme più gravi in presenza di espansioni al di sotto delle 150 CTG. Benché la diagnosi prenatale sia basata sull analisi diretta della mutazione, è consigliabile effettuare contestualmente l analisi molecolare in entrambi i genitori. Tabella 1. Test genetico per la distrofia miotonica Tipo di test Mutazione Accuratezza Disponibilità analizzata del test di un kit commerciale DM1 - Analisi diretta Espansione della mutazione trinucleotidica [CTG] n 100% No DM2 - Analisi diretta Espansione della mutazione tetranucleotidica [CCTG] n 80-100% No Indicazioni per l analisi molecolare della DM2 Test di conferma nei pazienti sintomatici DM1 negativi Il test è la conferma definitiva della diagnosi clinica in un paziente con sintomi clinici tipici. Il test genetico è utile anche in tutti i casi in cui la diagnosi clinica è incerta e cioè ogni qual volta il paziente mostri un quadro clinico compatibile sia con DM sia con altre patologie. Indicazioni per i test 11

Commenti Ampiezza dell espansione, gravità della malattia ed età di esordio della malattia non sono correlate in modo assoluto e pertanto non è possibile fare una predizione della prognosi della malattia sulla base del numero delle ripetizioni risultate all analisi molecolare. I risultati del test genetico hanno senza dubbio ripercussioni su altri membri della famiglia del probando, per questo motivo deve essere sempre disponibile la consulenza genetica sia per il probando sia per qualsiasi altro familiare. Alcuni autori 7 raccomandano di prendere in considerazione il test DM2 in pazienti asintomatici che presentano un incremento della creatin chinasi sierica come sola manifestazione clinica presente. Recentemente sono stati riportati casi di pazienti con mutazione DM2 e un fenotipo caratteristico della camptocormia. Anche in questi casi si ritiene utile analizzare il gene DM2. Test preclinico in soggetti asintomatici Viene condotto per determinare quale dei due genitori abbia l allele mutato in modo da identificare altri possibili portatori nel ramo familiare di provenienza del genitore. Il test preclinico nei soggetti asintomatici viene eseguito allo scopo di conoscere il rischio a priori di avere ereditato la mutazione DM2. Commenti Dal momento che, come detto in precedenza, il dato molecolare non può dare informazioni sull età di insorgenza o sul tipo di sintomi e sulla loro progressione, il test sui pazienti asintomatici deve sempre comprendere la consulenza genetica condotta da personale qualificato ed esperto. Diagnosi differenziale Talvolta la distrofia miotonica non è clinicamente diagnosticabile soprattutto alla nascita e spesso richiede la necessità di procedere a una diagnosi differenziale per distinguerla da altre patologie come la miosite da corpi inclusi (inclusion body myositis, IBM), la miopatia ereditaria miofibrillare (hereditary myofibrillar myopathy, MFM), la distrofia muscolare distale e alcune distrofie dei cingoli. Inoltre, è opportuno in alcuni casi procedere alla diagnosi differenziale nei confronti di altre miotonie dovute a difetti dei canali ionici come la miotonia o miotonia congenita di Thomsen o di Becker, data da mutazioni nel gene CLCN1, la paramiotonia congenita e le sue varianti, data da mutazioni nel gene SCN4A, e la paralisi periodica ipercaliemica data da mutazioni del gene SCN4A. Occasionalmente sono stati riportati in letteratura casi di diagnosi errate, soprattutto per la forma congenita di DM1, confusa con l atrofia muscolare spinale di tipo I (SMA). In tutte queste situazioni la diagnosi molecolare genetica è non solo opportuna ma anche necessaria. 12 Indicazioni per i test

Riservatezza Mantenere la riservatezza riguardo ai risultati delle analisi molecolari dei soggetti che si sottopongono al test è una responsabilità etica e legale del laboratorio di analisi e di chi esegue il test. La riservatezza è molto importante per prevenire la discriminazione nei riguardi dei soggetti sottoposti alla valutazione. Informazioni al paziente Il paziente deve essere informato riguardo al test genetico e deve essere messo a conoscenza di tutte le caratteristiche della malattia e della sua variabilità fenotipica, soprattutto nel caso del test presintomatico. Deve conoscere le modalità di esecuzione dell analisi e deve essere consapevole delle conseguenze che il risultato del test può avere sulla sua persona e sui suoi familiari. Deve, inoltre, essere messo a conoscenza di tutti i supporti di natura medica, genetica, psicologica ed etica messi a sua disposizione dalla struttura di riferimento durante e dopo la fase diagnostica. Prima di iniziare qualsiasi genere di indagine, il paziente deve fornire il consenso informato che va sempre formalizzato in forma scritta. Dal momento che i campioni di DNA utilizzati a scopo di ricerca e per la diagnosi appartengono all individuo da cui sono stati ottenuti, si raccomanda che ogni laboratorio elabori un modulo per il consenso informato in cui si richiedano anche le indicazioni per la conservazione del campione di DNA dopo l esecuzione del test. Le indicazioni richieste riguardano: il permesso di conservare il DNA dopo l esecuzione del test; il permesso di utilizzare il DNA per futuri test a scopo diagnostico senza bisogno di ulteriore consenso; la possibilità di utilizzare il campione di DNA per scopi di ricerca. Indicazioni per i test 13

Bibliografia essenziale 1. Le Ber I, Martinez M, Campion D, Laquerriere A, Betard C, Bassez G, Girard C, Saugier-Veber P, Raux G, Sergeant N, Magnier P, Maisonobe T, Eymard B, Duyckaerts C, Delacourte A, Frebourg T, Hannequin D. A non- DM1, non-dm2 multisystem myotonic disorder with frontotemporal dementia: phenotype and suggestive mapping of the DM3 locus to chromosome 15q21-24. Brain 2004; 127: 1979-92. 2. Liquori CL, Ricker K, Moseley ML, Jacobsen JF, Kress W, Naylor SL, Day JW, Ranum LP. Myotonic dystrophy type 2 caused by a CCTG expansion in intron 1 of ZNF9. Science 2001; 293: 864-7. 3. Day JW, Ricker K, Jacobsen JF, Rasmussen LJ, Dick KA, Kress W, Schneider C, Koch MC, Beilman GJ, Harrison AR, Dalton JC, Ranum LPW. Myotonic dystrophy type 2: molecular, diagnostic and clinical spectrum. Neurology 2003; 60: 657-64. 4. Bonifazi E, Vallo L, Giardina E, Botta A, Novelli G. A long PCR-based molecular protocol for detecting normal and expanded ZNF9 alleles in myotonic dystrophy type 2. Diagn Mol Pathol 2004; 13: 164-6. 5 Vallo L, Bonifazi E, Borgiani P, Novelli G, Botta A. Characterization of a single nucleotide polymorphism in the ZNF9 gene and analysis of association with myotonic dystrophy type II (DM2) in the Italian population. Mol Cell Probes 2005; 19: 71-4. 6. Sallinen R, Vihola A, Bachinski LL, Huoponen K, Haapasalo H, Hackman P, Zhang S, Sirito M, Kalimo H, Meola G, Horelli-Kuitunen N, Wessman M, Krahe R, Udd B. New methods for molecular diagnosis and demonstration of the (CCTG)n mutation in myotonic dystrophy type 2 (DM2). Neuromuscul Disord 2004; 14: 274-83. 7. Merlini L, Sabatelli P, Columbaro M, Bonifazi E, Pisani V, Massa R, Novelli G. Hyper-CK-emia as the sole manifestation of myotonic dystrophy type 2. Muscle Nerve 2005; 31: 764-7. 14 Bibliografia essenziale

Finito di stampare nel mese di novembre 2005 presso Geca - Cesano Boscone, Milano