INTRODUZIONE 1. LE MICOSI E GLI AGENTI ANTIFUNGINI

INTRODUZIONE La parete cellulare dei lieviti e dei funghi è diventata negli ultimi anni un promettente bersaglio per lo sviluppo di nuovi antifungini ed, in particolare, quelli destinati ad uso terapeutico nell uomo. Questa tesi riguarda la caratterizzazione di un enzima attivo sulla parete, il quale potrebbe rappresentare un bersaglio molecolare interessante in questo ambito di studi. Prima di intraprendere un approccio di tipo biotecnologico volto ad identificare inibitori della biogenesi della parete, è importante esaminare le molecole terapeutiche attualmente in uso e le previsioni di sviluppo del mercato degli antifungini per i prossimi anni. 1. LE MICOSI E GLI AGENTI ANTIFUNGINI 1.1 TIPI DI MICOSI I miceti o funghi sono microrganismi eucariotici unicellulari non fotosintetici, capaci di crescere o in maniera isolata o aggregandosi, grazie alla formazione di un insieme di filamenti, detti ife, le quali, ramificandosi e intrecciandosi, costituiscono una struttura nota come micelio. Grazie alle dimensioni maggiori rispetto a quelle batteriche, i miceti sono stati scoperti quali agenti patogeni molto prima dei batteri. Oggi, circa 100 delle diverse migliaia di specie di miceti conosciute sono classificate come agenti patogeni, capaci di causare micosi. 1

Le infezioni fungine nell uomo vengono suddivise in: - micosi superficiali, causate da dermatofiti, che colonizzano la cute, i capelli e le unghie; spesso, queste micosi hanno andamento cronico e presentano resistenza alla terapia, anche se comunque non compromettono lo stato di salute generale del paziente; - micosi profonde o sistemiche, causate da organismi che vivono allo stato libero in natura come saprofiti del suolo (spore dell Aspergillus fumigatus) o appartengono al gruppo dei microrganismi commensali nell uomo (Candida albicans), capaci di provocare lesioni sistemiche in pazienti immunocompromessi, in quanto questo tipo di micosi implica trasporto per via ematica con localizzazioni diverse a seconda degli organi o apparati colpiti (miocarditi, osteomieliti, artriti, endooftalmiti, cistiti). (1). L incidenza di infezioni fungine sistemiche è aumentata significativamente durante gli ultimi dieci anni. Questo aumento è dovuto a diversi fattori quali : ampio utilizzo di antibiotici a largo-spettro, agenti immunosoppressivi, alimentazione parenterale e utilizzo di cateteri venosi, cure intensive di neonati prematuri, trapianto d organi, e, infine, l epidemia della sindrome di immunodeficienza acquisita (AIDS). La Candida è il secondo agente eziologico isolato negli ospedali in pazienti immunocompromessi, secondo solo allo Stafilococco coagulasi-negativo. Secondo studi recenti, candidemie nosocomiali al giorno d oggi rendono conto del 10-15% di tutte le infezioni sanguigne acquisite negli ospedali. Si registrano casi di candidosi sistemiche fin nel 10% di tutti i neonati sottopeso (<1kg). La mortalità per infezioni fungine profonde è ancora molto alta: dal 30% nei casi di candidemia al 50% nelle aspergillosi sistemiche, fino al 75% nei casi di infezioni da zigomiceti. La candidosi rimane sicuramente l infezione tuttora più frequente, negli anni, però, si è osservato un cambiamento epidemiologico 2

caratterizzato dalle diverse incidenze nelle varie specie di Candida (Fig.1.1). Inoltre, alcuni funghi, in precedenza ritenuti contaminanti o innocui colonizzanti, sono stati recentemente identificati come cause di gravi infezioni nei pazienti immunocompromessi. Figura 1.1: Incidenza delle infezioni causate da Candida spp. in pazienti immunocompromessi. L'incidenza delle infezioni da Aspergillus, invece, nelle varie casistiche varia dal 10 al 30 %, ma nello stesso centro si possono osservare notevoli variazioni a seconda dei periodi ed, in particolare, essendo l'aspergillus un comune contaminante dei materiali biologici in decomposizione, in caso di opere di costruzione o restauro all'interno o nei pressi dell'ospedale, per la liberazione nell'aria di un elevato numero di spore fungine (Fig.1.2). 3

Figura 1.2: Incidenza nei siti di infezione invasive causate da Aspergillus. (Eur.J.Hematol.,1999) Rilevanti terapie antifungine iniziarono nel 1903, con il trionfante utilizzo dello ioduro di potassio (KI) nel trattamento contro la sporotricosi. Negli anni seguenti non si registrarono molti progressi fin quando nel 1951 non venne lanciata sul mercato la nistatina, il primo poliene efficace. Questa fu presto seguita dall amfotericina B, nel 1956, considerata ancora oggi lo standard rispetto al quale vengono confrontati le moderne terapie antifungine. Fatta eccezione per lo sviluppo della flucitosina (1964), non ci fu fino agli anni 70 sviluppo di nuovi farmaci che vantavano come principio attivo gli azoli. Gli ultimi decenni sono stati caratterizzati principalmente dalla modificazione, mediante tecniche di High-throughput screening, della molecola di base degli azoli, portando alla nascita del miconazolo (1978), ketoconazolo (1981), fluconazolo (1990) e itraconazolo (1992), che possono essere somministrati oralmente e che sono dotati di maggior efficacia e minore tossicità, allargando anche lo spettro di azione. 4

1.2 IL MERCATO EMERGENTE DELLE TERAPIE ANTIFUNGINE Il mercato di antifungini utilizzati per infezioni sistemiche è cresciuto notevolmente dal 1999 in poi, aumentando il suo valore da 2 mila milioni di dollari a 3 mila milioni nel 2003: questa dilagante crescita è dovuta ad un aumentata severità e incidenza delle infezioni antifungine invasive combinate al lancio sul mercato di nuovi prodotti antifungini;comunque, si pensa che continuerà così fino al 2014 (www.leaddiscovery.co.uk/reports/antifungals). Sebbene gli azoli abbiano dominato fino ad ora il mercato dei farmaci antifungini, rappresentando il 52% delle vendite totali nel 2003, ci si aspetta che la nuova classe delle echinocandine, tra cui il Cancidas, diventi quella predominante: già solo nel 2003, poco dopo il loro lancio sul mercato, la loro vendita ha raggiunto il 22%, percentuale che, quindi, svela una buona accettazione da parte dei pazienti sottoposti a terapie antifungine. Attualmente, gli antifungini in generale rappresentano più del 6% dell intero mercato mondiale di agenti anti-infettivi e, con il 20% di espansione annuale, si suppone che essi raggiungeranno un valore di 15 mila milioni di dollari nel giro dei prossimi dieci anni (1). 1.3 LA CLASSIFICAZIONE DEGLI ANTIFUNGINI Un antifungino ideale dovrebbe possedere le seguenti caratteristiche: - potente attività fungicida; - specificità di target; - sinergia positiva con altri farmaci; - assenza di resistenza; - effetti collaterali trascurabili o del tutto assenti in terapie. 5

Oggi sono usati due diversi gruppi di farmaci: 1) quelli prodotti da diversi organismi e 2) quelli prodotti mediante sintesi. Nel primo gruppo, solo l amfotericina B è efficace in diverse micosi profonde sistemiche. Sebbene la sua tossicità ne limiti l uso, l amfotericina B è tuttora il farmaco più scelto. Il secondo gruppo è costituito dai farmaci sintetici, inclusi la flucitosina e gli azoli. Tra gli azoli ci sono gli imidazoli e la nuova generazione della famiglia dei triazoli, itraconazolo e fluconazolo. L amfotericina B resta, comunque, la terapia più efficace nella maggiorparte delle micosi anche se ad essa sono associati molti effetti collaterali, tra cui nefrotossicità, resistenza e scarsa biodisponibilità se somministrata oralmente in terapie a lungo termine in pazienti immunocompromessi. La flucitosina non è efficace se usata singolarmente, quindi è usata solo in combinazione con amfotericina B e fluconazolo. Il ketoconazolo è disponibile per somministrazione orale per infezioni sistemiche e rappresenta una terapia valida in candidosi orofaringee. L itraconazolo è un nuovo antifungino triazolico con una farmacocinetica migliore del ketoconazolo, ed è attualmente il farmaco di scelta in alcune micosi endemiche, utile anche in alcune micosi opportunistiche profonde. Anche il fluconazolo, nuovo antifungino triazolico, è caratterizzato da profili farmacocinetici migliori e minor effetti collaterali tra tutti gli antifungini sintetici disponibili oggi. Esso rappresenta sia una prima terapia per la cura di alcune infezioni profonde da Candida spp. o criptococco in ospiti immunocompetenti e anche immunocompromessi, sia una semplice terapia di mantenimento contro queste infezioni. Quindi, altre importanti considerazioni nella selezione di farmaci includono: - spettro di attività; - efficacia nella deduzione di una responso clinico e di una cura; 6

- facilità di somministrazione; - grado di effetti collaterali (1). 1.3.1 Polieni Il meccanismo d azione dei macrolidi polienici prevede l interazione selettiva di questa classe di antibiotici con gli ergosteroli, ovvero gli steroli della membrana cellulare dei funghi (diversi dal colesterolo delle cellule dei mammiferi): questa interazione causa indebolimento della membrana ( che non espleta più come deve la sua funzione di barriera), cambiamenti nella sua permeabilità, rilascio dei componenti cellulari, soppressione dei processi metabolici e, quindi, morte della cellula. 1.3.1.1 Amfotericina B L amfotericina B venne introdotta nel 1956 e da allora è rimasto il miglior farmaco antifungino, in quanto unico agente sistemico disponibile per diversi anni, nonostante la sua alta tossicità. È stata isolata dal processo fermentativo di Streptomyces nodosus, un attinomicete del suolo. Effetti secondari attribuibili all amfotericina B sono anche danni cellulari causati dall ossidazione del farmaco. Dal punto di vista farmacologico, l amfotericina B è scarsamente assorbita oralmente, meno del 5% di biodisponibilità, quindi è necessario somministrarla via endovena per assicurare un adeguata concentrazione nel siero. Il suo spettro d attività è piuttosto ampio, comprendendo diverse specie di funghi e anche lieviti e forme filamentose. È stato dimostrato che però esistono alcuni casi di tolleranza in alcune specie di Candida, come per esempio nella C. albicans. Invece, si registrano attività variabile nei confronti di 7

Aspergillus, e resistenza in C.lusitaniae e Trichosporon beigelii (1). 1.3.1.2 Amfotericina B liposomale È stato dimostrato che incapsulando l amfotericina B in vescicole liposomali o unendola insieme a carrier lipidici si ottiene una notevole riduzione nella tossicità, quindi un grado di tollerabilità decisamente superiore, e un possibile aumento di effetto terapeutico di questo farmaco. Così alla luce di questi promettenti risultati clinici, sono stati sviluppati tre composti industriali derivati: AmBisome, Amphocil ( Amphotericin B Colloidal Dispersion, ABCD) e Amphotericin B Lipid Coplex ( ABLC, Abelcet). Queste tre diverse formulazioni differiscono significativamente sia in composizione che in farmacocinetica; inoltre, tutti e tre hanno in comune una considerevole riduzione della nefrotossicità. Comunque, questi composti sono raccomandati solo in casi di intolleranza o di fallimento della terapia convenzionale con amfotericina B. Nel 1995 è stato approvato dalla Food & Drug Administration l uso della ABLC in pazienti affetti da aspergillosi invasiva, insensibili o intolleranti al trattamento convenzionale con amfotericina B. Inoltre, l amfotericina B liposomale sembra essere sicura, efficace e ben tollerata anche in neonati sottopeso (1). 1.3.1.3 Nistatina La nistatina è stato il primo agente antifungino introdotto in usi clinici. È stato isolato da un attinomicete, Streptomyces noursei, che produce due antifungini, l actidione e la nistatina. La maggiorparte dei funghi patogeni sono inibiti in vitro a concentazioni di nistatina pari a 1,5-13 µg/ml (2). 8

1.3.1.4 Pimaricina Isolata dallo Strepromyces natalensis, è usata principalmente per curare candidosi e aspergillosi polmonari. Ha attività particolarmente efficace nelle infezioni da Fusarium spp (2). 1.3.2 Flucitosina La flucitosina è una fluorina analoga della citosina: essa, infatti, viene trasportata nelle cellule fungine dove viene deaminata dalla citosina deaminasi a 5-fluorouracile. Questa conversione è assolutamente necessaria affinchè risulti attiva, come inibitore della sintesi di DNA/RNA. Scoperta la sua azione antifungina nel 1964, oggi questo farmaco è utile soprattutto in combinazione con l amfotericina B nei trattamenti di diverse micosi profonde. Il suo spettro di attività è limitato alle candidosi, criptococcosi e chromomicosi, e, purtroppo, è soggetta a resistenza sia congenita che acquisita durante terapie prolungate. La flucitosina è controindicata durante la gravidanza a causa del suo effetto teratogeno, nei ratti (1,2). 1.3.3 Azoli Gli azoli interferiscono con la biosintesi degli steroli e di altri componenti lipidici della membrana, compromettendone, quindi, l integrità. Essi inibiscono la 14,α-dimetilasi, enzima citocromo P-450 dipendente, responsabile della conversione del lanosterolo in ergosterolo, principale componente della membrana cellulare dei funghi. Ciò causa un aumento della permeabilità e una progressiva instabilità. Essi si dividono ulteriormente in imidazoli e triazoli (1,2). 9

1.3.3.1 Gli imidazoli Gli imidazoli sono attivi contro una grande varità di funghi patogeni, come Microsporum, Cryptococcus neoformans, Candida spp., Coccidioides immitis etc. A basse concentrazioni gli imidazoli agiscono come fungistatici, mentre ad alte come fungicidi. Il miconazolo è un imidazolo sintetico con un ampio spettro di attività, che però non risulta attivo contro alcune specie di Aspergillus e ficomiceti. Il ketoconazolo, meno costoso, risulta meno tollerato sia del fluconazolo che dell itraconazolo (classe dei triazoli), con effetti tossici più importanti, incluse epatiti e inibizioni della sintesi di ormoni steroidei. Tutti e tre questi farmaci sono efficaci alternative all amfotericina B e alla flucitosina in casi di particolari micosi sistemiche. Il ketoconazolo è efficace contro numerosi funghi patogeni, fatta eccezione per C.tropicalis e Aspergillus spp (1,2). 1.3.3.2 I triazoli Appartengono a questo sottogruppo, il fluconazolo e l itraconazolo. Il fluconazolo sembra essere ben tollerato, dal momento che gli effetti collaterali risultano abbondantemente ridotti nei pazienti. Il suo utilizzo, largamente diffuso per curare infezioni fungine, ha contribuito però ad un significante aumento di infezioni da C. krusei. Studi sperimentali hanno mostrato che in genere C. krusei è meno virulenta della C. albicans, in termini di aderenza sia alle cellule epiteliali sia a superfici prostetiche. Comunque, la risposta globale a questo farmaco, confrontata con quella all amfotericina B, è simile (66% vs 64%); inoltre, gli effetti collaterali sono sicuramente più frequenti nei pazienti trattati con amfotericina B. 10

L itraconazolo fu approvato nel 1992 per curare istoplasmosi e blastomicosi polmonari ed extra-polmonari. Uno dei suoi grandi vantaggi è la sua efficace attività contro aspergillosi, e anche contro altri funghi patogeni (1,2). 1.3.4 Allilammine La Naftifina è un nuovo composto membro di una nuova classe di antimicotici, attivi contro una ampio range di funghi patogeni. L attività è particolarmente elevata e principalmente fungicida, ma variabile nei confronti di lieviti e fungistatica contro C.albicans e C.parapsilosis. La naftifina è un inibitore specifico della squalene epossidasi fungina e mostra effetti davvero scarsi contro gli enzimi epatici murini. Inoltre, le allilammine influenzano indirettamente anche la biosintesi degli acidi grassi e dei fosfolipidi, presumibilmente come risultato di livelli alterati di squalene ed ergosterolo nelle membrane cellulari: infatti, studi condotti su cellule trattate con naftifina hanno confermato biosintesi della parete cellulare difettiva (2). 1.3.5 Morfoline L amorolfina è un nuovo farmaco antifungino appartenente alla famiglia dei fenil-propilpiperidine e morfoline derivati. Attualmente è in fase di analisi clinica per uso in infezioni umane. Il suo meccanismo d azione prevede l inibizione dell attività della C14-reduttasi e della C7-C8isomerasi, enzimi chiave del pathway biosintetico degli ergosteroli. Questo comporta l indebolimento della parete. Purtroppo, il farmaco non mostra attività rilevante in micosi sistemiche dopo somministrazione per via orale. Questa scarsa attività è 11

probabilmente dovuta al rapido metabolismo del farmaco, ipotesi fatta osservando i modelli animali (2). 1.3.6 Nuovi farmaci antifungini Nuovi farmaci antifungini sono stati ottenuti mediante uno screening di prodotti naturali e di composti sintetici, seguiti da ottimizzazione del cosiddetto best lead compound, mediante chimica combinatoriale e High-throughput screening. Gli pneumocandinici sono, ad esempio, potenti agenti antifungini in via di sviluppo per uso in terapie antimicotiche a largo spettro (2). Echinocandine Agenti fungicidi con bassa tossicità ma buona efficacia anche contro organismi finora resistenti agli altri farmaci, come Pneumocystis carinii, che infetta animali: questo microrganismo, recentemente riclassificato come fungo patogeno, è la maggior causa di morte nei pazienti affetti dal virus dell HIV nel nord America e in Europa, nonostante l avvento della terapie retrovirali (3). Dal punto di vista strutturale, essi sono dei lipopeptidi ciclici semisintetici, scoperti nel 1970, tra cui pneumocandina Ao, echinocandina B-C-D, cilofungina LY280949 e papulocandina; essi sono tutti inibitori non competitivi della sintesi dei glucani di parete, capaci di legarsi a diversi siti della β-(1,3)- glucanosintasi. Uno degli ultimi farmaci appartenente a questa classe lanciato su mercato è il CANCIDAS (Caspofungin acetato): sintetizzato a partire da un prodotto della fermentazione di Glarea iozoyensis, il Cancidas è indicato per curare pazienti affetti da neutropenia causata da infezioni fungine e per curare candidosi e aspergillosi in pazienti refrattari alle terapie classiche. Infatti, questo farmaco di nuova generazione sembra avere effetti molto più efficaci dell AmBisome o 12

dell amfotericina B, abbassando l incidenza di effetti collaterali causati da terapia dal 55% circa al 25%. Inoltre, il Cancidas è l unico agente che mostra attività contro alcune specie di Aspergillus sia in vivo che in vitro (4). Nikkomicina Le poliossine e le correlate nikkomicine sono antibiotici prodotti dagli streptomiceti e scoperti tra gli anni 60 e 70. Essi rappresentano una nuova potente classe di agenti antifungini diretti contro la sintesi della chitina: agiscono, infatti, come inibitori competitivi del substrato UDP-Nacetilglucosammina (2). In C.albicans sono stati isolati tre geni implicati nella espressione di tre chitina sintasi diverse, CHS1, CHS2 e CHS3: la chitina sintasi Chs1 è responsabile della produzione di chitina nel setto primario, la chitina sintasi Chs2 è espressa preferenzialmente nelle forme ifali, la Chs3 è responsabile della produzione di chitina nella bud scar. Questi tre enzimi sono ridondanti, come anche in Saccharomyces cerevisiae (vedi paragrafo 2.2 introduzione), lievito modello nel quale doppi mutanti in almeno due di questi geni sono vitali solo in certe condizioni. Ridondanza ancora maggiore è stata riscontrata in A.fumigatus, in cui ci sono sette chitina sintasi diverse (3). Sfortunatamente, i composti che sono in efficaci in vitro non lo sono necessariamente anche in vivo: questo probabilmente a causa del fatto che esistono diverse isoforme della chitina sintasi, che influenzano così l efficacia di un farmaco. Ceppi di S.cerevisiae esprimenti solo la Chs3 si sono dimostrati più sensibili alla nikkomicina Z, a differenza di ceppi esprimenti solo la Chs2. Questo, quindi, ha fatto ipotizzare che la chitina sintasi Chs3 è un buon target per questo tipo di agente antifungino(5). 13

Oggi sono comunque ancora in corso studi che confermino questi promettenti risultati, in quanto questi antifungini hanno un attività piuttosto limitata contro i funghi patogeni umani, a causa di profili farmacocinetici sfavorevoli (2). Sordarina Nuova classe di agenti fungicidi, scoperti dalla Glaxo- Wellcome, che agiscono selettivamente contro la sintesi di proteine del fungo, inibendo il fattore di allungamento della traduzione EF2. Per ora, comunque, pare che i funghi filamentosi siano meno suscettibili in vitro a questo farmaco rispetto ai lieviti (1,2,6). 1,3-β glucansynthase, major enzyme for fungal cell wall synthesis Tabella 1.1: Tabella riassuntiva degli agenti antifungini e dei loro target molecolari.(ind.j.chest Diseases,2000). 14

1.4 INIBITORI DELLE VIE DI SOPRAVVIVENZA CELLULARE: NUOVO FRONTE DI RICERCA Recentemente è emerso che l elevata capacità di lieviti e funghi di tollerare stress di parete o di membrana è dovuta a vie di segnalazione essenziali che la cellula utilizza per riuscire a sopravvivere. Infatti, l assenza di geni codificanti per enzimi di parete è spesso causa di gravi fenotipi che però non determinano letalità, in quanto questi organismi attivano una complessa risposta cellulare per compensare i danni prodotti nella parete e per prevenire la lisi. Il cell wall salvage pathway è un fenomeno adattativo che si basa da un lato sull esistenza di proteine che compensano i difetti nell assemblaggio della parete, dall altro su vie di trasduzione del segnale attivate dai danni alla parete da parte di proteina sensori di membrana. Strategie terapeutiche prevedono, quindi, di utilizzare combinazioni di inibitori diretti sia contro specifici target di parete rappresentati da enzimi, sia contro componenti delle vie di salvataggio (7,8,9,10). Uno di questi pathway è la via della calcineurina, una fosfatasi specifica per fosfo-serina o treonina, calcio/calmodulina dipendente, che defosforila un fattore trascrizionale (Crz1p), il quale trasloca nel nucleo e attiva la trascrizione di quei geni richiesti per la sopravvivenza. È stato dimostrato che inibitori della via della calcineurina potenziano l azione degli azoli (11). Immunosoppressivi come la ciclosporina A (CsA) e l antibiotico FK506 inibiscono la via della calcineurina e bloccano l attivazione delle cellule T, responsabili del rigetto nei trapianti. La CsA e FK506 sono tossici per numerosi funghi, purtroppo però tra questi non è presente la Candida albicans. Comunque, usando una combinazione di CsA, FK506 e fluconazolo sembra che si riesca a perturbare la sintesi dell ergosterolo di membrana, grazie ad un attività fungicida sinergica. 15