RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE a cura di Salvatore Accomando Un nuovo marker efficace di infiammazione intestinale: la proteina high mobility group-box1 (HMGB1) Protein high mobility group-box1 (HMGB1): a new marker of gastrointestinal inflammation Roberta Vitali 1 (foto) Laura Stronati 2 Salvatore Cucchiara 3 1 ENEA, Dipartimento Sostenibilità dei Sistemi Produttivi e Territoriali, Laboratorio Tecnologie Biomediche; 2 Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari e Ematologia; 3 Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Gastroenterologia, Epatologia e Endoscopia Digestiva Pediatrica Key words Marker infiammatorio Malattie infiammatorie croniche intestinali HMGB1 Abstract The fecal high mobility group box1 protein (HMGB1) is a non-invasive biomarker for Inflammatory Bowel Diseases (IBD) which helps to distinguish whether the intestinal inflammation is clinically evident or subclinical. This allows to recommend its use to control the development of the disease and evaluate the response to therapy in IBD. As a matter of fact HMGB1 is an active player in the inflammation of intestinal mucosa and consequently represents a good candidate as a target for IBD therapy. Indirizzo per la corrispondenza Salvatore Cucchiara viale Regina Elena 324, 00161 Roma E-mail: salvatore.cucchiara@uniroma1.it Nel lume intestinale sono presenti una vasta quantità di molecole immunogeniche e proinfiammatorie, con le quali il sistema immunitario è in costante interazione, di conseguenza la mucosa intestinale è in uno stato continuo di controllata reattività immunologica. Tale reattività può essere definita come una infiammazione fisiologica che deve essere mantenuta al minimo per preservare le condizioni di salute. La perdita del suo controllo porta a stati infiammatori che, se protratti, conducono a specifiche patologie. L infiammazione cronica intestinale è alla base delle malattie infiammatorie intestinali (IBD, da Inflammatory Bowel Disease ), che includono la malattia di Crohn (MC) e la colite ulcerosa (CU). Le IBD sono disordini immuno-mediati del tratto gastro-intestinale con una patogenesi derivante da un alterata interazione tra fattori genetici, immunologici e microbici 1. L ipotesi patogenetica prevalente è quella di una reazione immunologica abnorme da parte dell intestino nei confronti della normale flora intestinale. Tradizionalmente, una risposta mucosale adattativa aberrante, causata soprattutto dalle cellule T, è stata considerata la maggiore responsabile della patogenesi delle IBD. Tuttavia le recenti scoperte dei geni difettivi nel sistema immunitario innato hanno spostato l attenzione sulle fasi precoci della risposta immune 2. L attivazione della risposta immunitaria innata verso i batteri è mediata da una famiglia di recettori (PRRs, da Pattern Recognition Receptors ) che includono i recettori di superficie toll like (TLRs) e le proteine NOD (da Nucleotide Oligomerization Domain ) che mediano l attivazione del fattore di trascrizione NF-kB. Alcune mutazioni dei TLRs e delle proteine NODs producono sensori difettivi verso i patogeni e predispongono l ospite a infezioni ricorrenti e alla perpetuazione 172 Giorn Gastr Epatol Nutr Ped 2015;VII:172-176
RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE HMGB1 nell infiammazione intestinale dell infiammazione intestinale 2. In seguito all attivazione dei PRRs la risposta immunitaria innata, per essere perpetuata, si avvale di specifiche molecole endogene, chiamate allarmine o DAMPs (da Damage Associated Molecular Pattern ). Queste ultime sono normalmente presenti nella cellula e vengono rilasciate nella matrice extracellulare durante infezioni, stress cellulare o danno tissutale e in tal modo attivano il sistema immunitario. Una proteina nucleare, high mobility group-box1 (HMGB1), è stata oggetto di particolare attenzione nelle sue funzioni di allarmina essendo coinvolta nella risposta infiammatoria dovuta o meno ad infezioni. HMGB1 è una proteina di 25 kda con funzioni di citochina proinfiammatoria espressa abbondantemente in molti tipi di cellule ed altamente preservata 3. Tale proteina fu originariamente scoperta come proteina nucleare. È stato però dimostrato che in condizioni infiammatorie, ad esempio in presenza di LPS, TNFalfa, IL-1, IL-6 e IL-8, o in caso di danno tissutale, HMGB1 è attivamente rilasciata dalle cellule del sistema immunitario nella matrice extracellulare, dove si comporta come citochina proinfiammatoria 3. Dopo essere stata secreta forma complessi infiammatori con ssdna, LPS, IL-1beta e nucleosomi, che interagiscono rispettivamente con i recettori TLR9, TLR4, IL1R e TLR2 coinvolti nella risposta immunitaria innata 3. In tal modo HMGB1 extracellulare induce la produzione di mediatori dell infiammazione, amplificando quindi tale condizione (Fig. 1). Attualmente HMGB1 è considerata un potente mediatore infiammatorio ed è implicata in diverse patologie infiammatorie e di tipo auto-immune, come la sepsi, l artrite reumatoide, il lupus eritematoso, le miositi e, come dimostrato dai nostri studi, le IBD 4. Alcuni dati in letteratura riportano inoltre, sempre in riferimento al tratto gastrointestinale, che HMGB1 altera la permeabilità della barriera intestinale 5, e che, in modelli murini di coliti indotte chimicamente, il trattamento con anticorpi policlonali anti- HMGB1 è in grado di ridurre l infiammazione 6. Viste le specifiche proprietà della proteina, il nostro gruppo di ricerca, storicamente interessato allo studio della patogenesi delle IBD, ha rivolto la sua attenzione allo studio del ruolo di HMGB1 in queste patologie. Dati ottenuti nei nostri laboratori hanno mostrato per la prima volta che HMGB1 è secreta da tessuti intestinali umani infiammati prelevati da pazienti pediatrici affetti da IBD 4. HMGB1 risulta significativamente aumentata nelle feci di una coorte di pazienti pediatrici con IBD, rispetto ai controlli sani (Fig. 2). Pertanto tale proteina può essere considerata come un nuovo marker di infiammazione intestinale da valutare in campioni fecali 4. Nello studio è emerso inoltre che i livelli endogeni di HMGB1 nei tessuti dei pazienti non erano aumentati né a livello Figura 1. HMGB1 è una damage associated molecular pattern molecule (DAMP). 173
R. Vitali et al. a b Figura 2. HMGB1 è presente nelle feci di pazienti affetti da IBD. I livelli di HMGB1 risultano significativamente aumentati nelle feci di pazienti affetti da malattia di Crohn e Colite Ulcerosa rispetto ai controlli sani. (a) I campioni sono mostrati in accordo con il grado di severità di malattia. (B) L analisi densitomentrica mostra che HMGB1 è fortemente aumentata nelle feci di pazienti con IBD (p < 0.001) rispetto ai controlli sani. proteico né a livello di mrna, dimostrando che l aumento di HMGB1 fecale ritrovato nei pazienti è causato da una aumentata secrezione della stessa a carico della mucosa intestinale infiammata 4. L efficacia di HMGB1 come biomarcatore di infiammazione intestinale è stata testata attraverso l analisi di correlazione tra i livelli di HMGB1 e quelli di Calprotectina (usata di routine come marcatore di infiammazione) in campioni fecali di pazienti pediatrici e adulti affetti da IBD, che ha dimostrato l esistenza di una correlazione positiva tra i due bio-marcatori (dati non pubblicati). Studi successivi sono stati volti ad indagare se l inibizione di HMGB1 potesse essere una valida strategia per ridurre l infiammazione intestinale. L inibizione di HMGB1 è stata quindi ottenuta con il Dipotassio Glicirrizinato (DPG), una molecola naturale estratta dalla radice della liquirizia che si è dimostrata capace di inibire l attività citochinica di HMGB1 7. In un modello murino di colite indotta chimicamente mediante il destran-solfato (DSS), il trattamento con il DPG è in grado di ridurre l infiammazione intestinale conducendo ad una significativa riduzione della severità della colite (Fig. 3A) 8. In particolare, in campioni murini di mucosa colonica in cui è stata indotta la colite, il trattamento con DPG riduce considerevolmente l espressione delle principali citochine pro-infiammatorie quali: TNF-alpha, IL-1beta e IL-6 (Fig. 3B) 8, e modula lo stress ossidativo riducendo l espressione di enzimi chiave 174
RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE HMGB1 nell infiammazione intestinale a Figura 3A. IL trattamento con DPG riduce la severità delle coliti murine chimichiamente indotte. Topi del ceppo C57BL/6 in cui la colite era indotta mediante DSS, sono stati trattati con due dosi di DPG (3 e 8 mg/kg) per 7 giorni. Lo score clinico totale è stato analizzato (consistenza delle feci, presenza di sangue nelle feci e aspetto generale) e risulta notevolmente diminuito in seguito al trattamento con DPG. B Figura 3B. DPG riduce l espressione degli mrna delle seguenti citochine pro-infiammatorie: TNF-alpha, IL-1beta IL-6 nei tessuti infiammati di topi trattati con DSS. I dati rappresentano l espressione del gene target, analizzato meriante real-time PCR, normalizzato rispetto al gene di riferimento. UN, animali non trattati; DSS, destran-solfato; DPG, Dipotassio Glicirrizinato. ** p=0.001. di questa via di segnale (inos e COX-2) 9. Parallelamente, i livelli di HMGB1, che risultano elevati nelle feci di topi affetti da colite indotta mediante DSS, sono fortemente ridotti nelle feci in seguito al trattamento con DPG 8. Utilizzando dosi crescenti di DSS, per indurre coliti di diversi gradi di gravità, è emerso che HMGB1 fecale aumenta proporzionalmente all aumentare della dose di DSS, mostrando che la proteina consente di differenziare una infiammazione severa da una forma sub-clinica. Inoltre i livelli di HMGB1 fecale si normalizzano, tornando ai livelli dei controlli sani, in caso di completa guarigione della mucosa intestinale ottenuta in seguito alla sospensione del trattamento con l induttore chimico (DSS) 10. In accordo con questa evidenza, in pazienti affetti da IBD, il livello di HMGB1 fecale correla positivamente con gli indici endoscopici delle malattie ( Simple Endoscopic Score per la malattia di Crohn [SES-CD] e Mayo Score Endoscopico per la Colite Ulcerosa) 10. Gli studi sinora condotti dimostrano quindi che HMGB1 è un protagonista attivo dell infiammazione a carico della mucosa intestinale 175
R. Vitali et al. e rappresenta pertanto un buon candidato come target di terapia per le patologie infiammatorie intestinali. Inoltre l HMGB1 fecale costituisce un biomarcatore non invasivo per le IBD, in grado di distinguere tra infiammazione intestinale clinicamente evidente e subclinica, consentendo di suggerirne l uso per monitorare il decorso della malattia e valutare la risposta alla terapia nelle malattie infiammatorie intestinali. Bibliografia 1 Sartor RB. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn s disease and ulcerative colitis. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2006;3:390-407. 2 Yamamoto-Furusho JK. Genetic factors associated with the development of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2007;13:5594-7. 3 Bianchi ME. HMGB1 loves company. J Leukoc Biol 2009;86:573-6. 4 Vitali R, Stronati L, Negroni A, et al. Fecal HMGB1 is a novel marker of intestinal mucosal inflammation in pediatric inflammatory bowel disease. Am J. Gastroenterol 2011;106:2029 40. 5 Sappington PL, Yang R, Yang H, et al. HMGB1 B box increases the permeability of Caco-2 enterocytic monolayers and impairs intestinal barrier function in mice. Gastroenterol 2002;123:790-802. 6 Maeda SY, Hikiba W, Shibata T, et al. Essential roles of high-mobility group box 1 in the development of murine colitis and colitis-associated cancer. Biochem Biophys Res Commun 2007;360:394-400. 7 Mollica L, De Marchis F, Spitaleri A, et al. Glycyrrhizin binds to High-Mobility Group Box 1 protein and inhibits its cytokine activities. Chem Biol 2007;14:431-41. 8 Vitali R, Palone F, Cucchiara S, et al. Dipotassium glycyrrhizate inhibits HMGB1-dependent inflammation and ameliorates colitis in mice. PLoS One 2013;8:e66527. 9 Vitali R, Palone F, Pierdomenico M, et al. Dipotassium glycyrrhizate via HMGB1 or AMPK signaling suppresses oxidative stress during intestinal inflammation. Biochemical Pharmacol 2015;97:292-9. 10 Palone F, Vitali R, Cucchiara S, et al. Role of HMGB1 as a suitable biomarker of subclinical intestinal inflammation and mucosal healing in patients with inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 2014;20:1448-57. Le malattie infiammatorie intestinali croniche (IBD, da Inflammatory Bowel Disease ) sono disordini immuno-mediati del tratto gastro-intestinale. La proteina nucleare high mobility group-box1 (HMGB1), possiede attività di citochina proinfiammatoria, ed è attualmente considerata un potente mediatore infiammatorio implicato in diverse patologie infiammatorie e di tipo autoimmune. HMGB1 fecale costituisce un biomarcatore non invasivo per le IBD. L inibizione di HMGB1 risulta essere una valida strategia per ridurre l infiammazione intestinale in modelli murini di colite, e rappresenta pertanto un buon candidato come target di terapia per le patologie infiammatorie intestinali umane. 176