Jean-François Desaphy

Facoltà di Farmacia Dip. Farmaco-Biologico Sezione di Farmacologia Dalla relazione genotipo-fenotipo alla terapia farmacologica delle miotonie Jean-François Desaphy 2 Incontro Annuale Associazione M.I.A. onlus

Le canalopatie del muscolo scheletrico Myotonia Periodic Paralysis Myotonia Congenita Generalized Myotonia Potassium-aggravated Myotonia Paramyotonia Congenita Hyperkalemic Periodic Paralysis Hypokalemic Periodic Paralysis Andersen-Tawil Syndrome Chromosome 7 CLCN1 gene Chloride channel Chromosome 17 SCN4A gene Sodium channel Chromosome 1 CACNL1A4 gene Calcium channel Chromosome 17 KCNJ2 gene Potassium channel

CANALI e TRASPORTI IONICI CANALI IONICI 145 mm Na Na Cl - K TRASPORTATORI Na 4 mm K Na 12 mm Ca 2 ATP Ca 2 K 155 mm Na POMPE Ca 2 1.8 mm Ca 2 0.1 µm ATP Cl - 15 mm NUCLEO K 150 mm Cl - CELLULA

PROTEINE CANALI Gating Voltaggio agonista diretto stiramento proteina G Ioni calcio Più di 400 geni codificano per altrettanti canali Porta di attivazione ione K Na Ca 2 H non-selettivi Cl - Modulazione Fosforilazione Ossidazione Citoscheletro Stiramento ATP Ioni calcio altri ioni S E N S O R E Porta di inattivazione Subunità ausiliaria Siti di legame per piccole molecole

FUNZIONE DEI CANALI IONICI 5 sensi neurotrasmissione contrazione ion S E N S O R Proliferazione cellulare Differenziamento cellulare risposta immunitaria secrezione esocrina Secrezione ormonale

CANALI IONICI e MALATTIE Coinvolgimento in patogenesi aritmie cardiache disordini psichici disfunzioni cognitive sensazione del dolore ipertensione patologie renali diabete cancro 1/2500 europei affetti recessivo 1/20 portatori sani Mutazioni nel gene CFTR Difetti di un canale del cloro Canalopatie primarie Muscolo scheletrico paralisi periodica miotonia miastenia ipertermia maligna malattia central core Aritmie cardiache Sistema nervoso centrale epilessia atassia emicrania ipereplessia fibrosi cistica Malattie renali osteopetrosi diabete ipertensione eritermalgia SCID Canalopatie secondarie intossicazione distrofia miotonica malattie autoimmuni iperalgesia Più di 60 geni mutati Centinaia di mutazioni

CANALI IONICI e FARMACI ~5% dei bersagli di farmaci sono canali ionici Canali per il calcio antiangina, anti-ipertensivi, antiaritmici, antiepilettici Canali per il sodio anestetici locali, antiaritmici, antiepilettici, anti-miotonici, diuretici Canali per il cloro antiepilettici, ansiolitici, ipnotici, anestetici generali, rilassanti muscolari Canali per il potassio antidiabetici, anti-ipertensivi, antiaritmici

Farmacologi di Bari e le canalopatie Sezione di Farmacologia Facoltà di Farmacia Team leader: prof.ssa Diana Conte Camerino Canali del sodio J-F. Desaphy A. De Luca M. De Bellis T. Costanza R. Carbonara M. Dinardo Farmaci Farmaco Canali del potassio D. Tricarico A. Mele GL. Cannone G. Camerino M. Dinardo S. Calzolaro Canali del cloro ClC-1 S. Pierno J-F. Desaphy A. Liantonio M. De Bellis G. Camerino M. Dinardo G. Gramegna M. Cannone Canali del cloro ClC-K, renali A. Liantonio G. Gramegna A. Scaramuzzi G. Camerino M. Dinardo

Canalopatie Muscolari Ipertermia maligna miastenia miotonia Paralisi periodica Il difetto genetico determina una proteina alterata che funziona: poco (perdita di funzione) troppo (guadagno di funzione).

Ruolo del Farmacologo Relazione genotipo/fenotipo Alla ricerca di possibili bersagli per i farmaci Farmaco Alla ricerca del farmaco migliore

Ruolo del Farmacologo Relazione genotipo/fenotipo 1 esempio: le canalopatie da sodio muscolari 2 esempio: la miotonia da cloro Alla ricerca di possibili bersagli per i farmaci Farmaco Alla ricerca del farmaco migliore

Relazione Genotipo-Fenotipo Canalopatie muscolari da sodio 10-80 -120 30 ms, 0.1 Hz I II III IV R1448C Paramyotonia Congenita out in NH 2 A1156T Paralisi periodica ipercalemica G1306E COOH recettore LA Miotonia aggravata dal K Desaphy et al., Neurology 2001

Relazione Genotipo-Fenotipo Canalopatie muscolari da sodio 10-80 -120 30 ms, 0.1 Hz I II III IV R1448C Paramyotonia Congenita out in NH 2 A1156T Paralisi periodica ipercalemica G1306E COOH recettore LA Miotonia aggravata dal K Mutagenesi sito-diretta, espressione eterologa, patch-clamp Desaphy et al., Neurology 2001

Relazione Genotipo-Fenotipo Canalopatie muscolari da sodio 10-80 -120 30 ms, 0.1 Hz I II III IV R1448C Paramyotonia Congenita out in NH 2 A1156T Paralisi periodica ipercalemica G1306E COOH recettore LA Miotonia aggravata dal K Mutagenesi sito-diretta, espressione eterologa, patch-clamp Farmaco Farmaco Farmaco Desaphy et al., Neurology 2001

Genotype/phenotype correlation Missense mutations Impaired fast inactivation Enhanced activation Impaired slow inactivation Sarcolemma hyper-excitability Sarcolemma inexcitability Myotonia (muscle stiffness) Paralysis (muscle weakness)

Miotonia da cloro F167L Mauro LoMonaco, Anna Modoni G190S F167L AR miotonia debolezza // Current amplitude 6 4 I (na) WT F167L G190S Vm (mv) Unpublished, preliminary results 100 200 Open Probability G190S WT F167L G190S Vm (mv) La mutazione F167L riduce il passaggio degli ioni attraverso il canale La mutazione G190S modifica la dipendenza dal voltaggio Riduzione della corrente MIOTONIA

Ruolo del Farmacologo Relazione genotipo/fenotipo Alla ricerca di possibili bersagli per i farmaci Farmaco Alla ricerca del farmaco migliore

Alla ricerca del farmaco migliore Farmaco noto con meccanismo d azione ignoto (uso empirico) Meccanismo d azione dell acetazolamide nella miotonia Farmaco noto con meccanismo d azione noto Nuovi farmaci nella terapia della miotonia flecainide e propranolol Farmaci mancanti Nuovi ligandi per i canali al cloro

Alla ricerca del farmaco ideale Farmaco noto con meccanismo d azione ignoto (uso empirico) Meccanismo d azione dell acetazolamide nella miotonia Farmaco noto con meccanismo d azione noto Nuovi farmaci nella terapia della miotonia flecainide e propranolol Farmaci mancanti Nuovi ligandi per i canali al cloro

Sindromi miotoniche Paramiotonia congenita Miotonia aggravata dal K Nav1.4 ClC-1 Miotonia congenita Miotonia generalizzata sodio cloro Distrofia miotonica Miopatia miotonica prossimale aumentata attività ridotta attività Ipereccitabilità del sarcolemma SINDROMI MIOTONICHE Mexiletina Farmaco Bloccante canali al sodio Rigidità muscolare Difficoltà al rilassamento

Antimiotonico mexiletina Mexiletina, bloccante canali al sodio Farmaco antimiotonico di 1 scelta Trial clinico in corso Non tutti i pazienti rispondono Possibili effetti collaterali I canali al sodio mutati sono sensibili alla mexiletina? Quali nuovi farmaci per la miotonia?

I canali al sodio mutati sono sensibili alla mexiletina? Dipendenza dal voltaggio 1.2 1.0 WT, n=38 A1156T, n=21 G1306E, n=31 R1448C, n=42 R1448C Spostamento negativo della curva Normalized Current 0.8 0.6 0.4 G1306E Spostamento positivo della curva 0.2 0.0-160 -140-120 -100-80 -60-40 -20 Prepulse Potential (mv) Mexiletine CF 3 Flecainide O NH 2 O N H H N O CF 3 Desaphy et al., J Physiol 2004

I canali al sodio mutati sono sensibili alla mexiletina? Dipendenza dal voltaggio 1.2 WT, n=38 A1156T, n=21 G1306E, n=31 R1448C, n=42 R1448C Spostamento negativo della curva Normalized Current 1.0 0.8 0.6 0.4 G1306E Spostamento positivo della curva Meno sensibile alla mexiletina Più sensibile alla flecainide Più sensibile alla mexiletina e alla flecainide 0.2 0.0-160 -140-120 -100-80 -60-40 -20 Prepulse Potential (mv) Mexiletine GE, 300 µm Mexiletine GE, 100 µm Flecainide CF 3 Flecainide O NH 2 10 Hz 0.3 Hz 500 pa 10 Hz 0.1 Hz 500 pa O O N H H N CTRL 2 ms CTRL 2 ms CF 3 Desaphy et al., J Physiol 2004

FARMACOGENETICA: medicina personalizzata Dipendenza dal voltaggio negative shift no shift positive shift unknown PAM I141V I1160V S804F V1589M Q1633E G1306A G1306E G1306V L250P A1481D G1306E PMC I693T R1148C R1448P R1448H R1448S V445M V1293I L266V Q270K T704M A1152D F1705I T1313A T1313M L1433R F1473S M1370V R1448L V1458F M1476I L1436P G1456E R1460Q Blocco maggiore Blocco normale Blocco minore Mexiletine Flecainide O NH 2 CF 3 O O N H H N CF 3 Desaphy et al., submitted

Quali nuovi farmaci antimiotonici? Blocco dei canali Nav1.4? Farmaco β-agonista doping Farmaco β-agonista anti-asmatico SI No Farmaci β-antagonisti anti-aritmici SI No Bloccante canali al sodio anti-aritmico, antimiotonico SI

Studi pre-clinici CTRL Tempo di raddrizzamento 0.5 s 9AC ratto miotonico 4 s 9AC farmaco antimiotonico 1 s Unpublished, preliminary results % of TRR reduction 100 80 60 40 20 0 mexiletine propanolol clenbuterol nadolol salbutamol 5 15 40 [DRUG] (mg/kg) il propranololo potrebbe rappresentare una valida alternativa alla mexiletina nella terapia antimiotonica Desaphy, Costanza, Gramegna & Conte Camerino, in preparation

Studi pre-clinici SALBUTAMOL CLENBUTEROL / PROPRANOLOL Activation of Na /K pump Activation of Na /K pump Inhibition of sodium channels Anabolic action Sarcolemma hyperpolarization Sarcolemma hyperpolarization Inhibition of AP firing Hyperkalemic periodic paralysis Myotonic syndromes Including myotonic dystrophy

Conclusioni L impegno del Farmacologo nelle malattie rare elaborare solide basi scientifiche per trial clinici esplicitare i test pre-clinici di efficacia e di tossicità studiare la farmacogenetica inventare nuovi farmaci (in collaborazione con i chimici farmaceutici) individuare nuovi farmaci efficaci pronti all uso Trovare il farmaco ideale delucidare il meccanismo d azione di farmaci empirici individuare nuovi possibili bersagli per farmaci Studiare la relazione genotipo/fenotipo

Ringraziamenti Sezione di Farmacologia (2011) Diana CONTE Annamaria DE LUCA Domenico TRICARICO Jean-François DESAPHY Sabata PIERNO Antonella LIANTONIO Michela DE BELLIS Antonietta MELE Giulia CAMERINO Post-doc Gianluca GRAMEGNA Anna COZZOLI Marilena DINARDO Roberta CAPOGROSSO Dottorandi Teresa COSTANZA Valeria SBLENDORIO Gianluigi CANNONE Roberta CARBONARA Antonella SCARAMUZZI Maria CANNONE Sara CALZOLARO Chimica farmaceutica Facoltà di Farmacia Bari Carlo Franchini Fulvio Loiodice Collaborazioni esterne Alfred L. George, USA Frank Lehmann-Horn, Germania Bertrand Fontaine, Francia Ramone Latorre, Cile Patrick Delmas, Francia Michael Pusch, Genova Mauro Lomonaco, Roma Giovani Meola, Milano P I harmaceutical ndustries

Continuiamo a lavorare

Commenti Le sindromi miotoniche appartengono ad un gruppo di malattie dei muscoli scheletrici, comprendendo anche le paralisi periodiche. Tutte queste patologie hanno in comune di essere la conseguenza di mutazioni a carico di geni codificanti per i canali ionici, di cui il neologismo canalopatie. I canali e trasportatori ionici sono delle proteine presenti nelle membrane delle nostre cellule che permettono il passaggio selettivo di ioni e controllano l omeostasi cellulare. Questi ioni partecipano a molte se non tutte le funzioni cellulari. Più di 400 geni sono stati identificati nel genoma umano che codificano per le subunità dei canali ionici. Questi canali sono diversi per la specie ionica che permea, per i meccanismi di apertura/chiusura del canale, per la loro modulazione da parte di segnali fisici e biochimici, per la loro sensibilità alle tossine e ai farmaci. Questi canali sono espressi nell intero organismo e sono coinvolti in tutti i processi fisiologici, compreso i sensi, la neurotrasmissione, la contrazione muscolare, la secrezione degli ormoni, la secrezione esocrina, la risposta immunitaria, il ciclo cellulare, la proliferazione e il differenziamento cellulare.

Commenti Non è quindi sorprendente che i canali ionici contribuiscano all insorgenza di un numero elevato di malattie debilitanti o letali, che includono le aritmie cardiache, l ipertensione, le malattie renali, il diabete, il dolore cronico, i disordini cognitivi e psichici, o ancora la progressione del cancro. Le canalopatie primarie sono le malattie che originano da mutazioni nei geni codificanti per i canali ionici. Queste malattie sono rare con un incidenza che varia, dal caso pressoché unico ad 1 caso su 2500 europei come per la fibrosi cistica dovuta a mutazioni in un canale del cloro. Nell insieme, le canalopatie includono più di 60 malattie e diverse centinaia di mutazioni. Sono malattie rare monogeniche, ma il loro studio negli anni recenti ha significativamente contribuito alla comprensione di molte malattie multifattoriali. Visto il loro coinvolgimento in molte malattie, i canali ionici costituiscono degli importanti bersagli per l azione dei farmaci. Sono noti farmaci che agiscono sui canali del calcio, del sodio, del potassio, e del cloro.

Commenti I farmacologi della Facoltà di Farmacia dell Università di Bari studiano da anni i canali ionici, loro ruolo nelle canalopatie, e la loro sensibilità ai farmaci I muscoli scheletrici si contraggono in risposta ad uno stimolo proveniente dal cervello attraverso il nervo motore. Questo nervo rilascia un messaggero, l acetilcolina, che stimola il muscolo attraverso l attivazione di vari canali/trasportatori ionici presenti nelle membrane dei muscoli. Mutazioni in questi canali sono stati associati a vari patologie muscolari. In particolare, mutazioni a carico del canale al cloro o del canale al sodio sono state associate a la miotonia. La ridotta attività dei canali del cloro o l esagerata attività dei canali del sodio rendono il muscolo troppo eccitabile. In condizioni normali, il muscolo scarica potenziali d azioni in risposta ad uno stimolo proveniente del nervo, scarica che si interrompe allo cessare dello stimolo. In persone affette da miotonia, la scarica dei potenziali d azioni dura oltre lo stimolo, quindi il muscolo ha difficoltà a rilassarsi dopo la contrazione e rimane rigido: questo è la miotonia.

Commenti Quali sono i compiti del farmacologo? Studiare la relazione tra genotipo e fenotipo per Individuare possibili bersagli per i farmaci e Trovare il farmaco migliore Il primo esempio riguarda le canalopatie muscolari da sodio. Mutazioni nel gene che codifica per il canale del sodio del muscolo scheletrico sono responsabili di una serie di malattie caratterizzate da momenti di paralisi flaccida (paralisi ipercaliemica) o di rigidità muscolare (miotonia). Mediante tecnologie avanzate, abbiamo studiato in vitro l effetto di 3 mutazioni, e abbiamo potuto correlare l insorgenza di paralisi ad una corrente al sodio persistente e la miotonia al rallentamento del decadimento delle correnti al sodio. Tali difetti biofisici diventano quindi dei possibili bersagli per l azione di farmaci efficaci contro la paralisi o contro la miotonia. Il secondo esempio riguarda la miotonia congenita, che deriva da mutazioni nel gene che codifica per il canale al cloro muscolare ClC-1. In collaborazione con i dott.ri LoMonaco e Modoni, abbiamo studiato 2 mutazioni, F167L e G190S, entrambi associate a miotonia. La mutazione G190S pero è anche associata a l insorgenza di debolezza muscolare di breve durata ma che può inficiare i movimenti. Le due mutazioni riducono le correnti del cloro ma con meccanismi molecolari diversi. Studi in corso mirano a correlare il difetto molecolare ai sintomi clinici.

Commenti Quindi una volta definita la relazione genotipo/fenotipo, il farmacologo si impegna a trovare il farmaco migliore per curare la malattia rara in attesa di una terapia genica/cellulare efficace ed applicabile. Il farmacologo deve definire il meccanismo d azione dei farmaci usati in modo empirico. Il farmacologo può cercare nuovi farmaci con meccanismi d azione noti per la cura delle malattie rare. Il farmacologo, con l aiuto dei chimici farmaceutici può inventare nuovi farmaci in grado di colpire i canali ionici, ove essi mancano.

Commenti Prendiamo di nuovo l esempio delle miotonie, malattie caratterizzate da rigidità muscolare che complicano la normale funzionalità dei muscoli scheletrici. Ci sono miotonie da sodio, dovute a mutazioni nel gene del canale del sodio, e miotonie da cloro, dovute a mutazioni nel gene del canale del cloro. Il guadagno funzionale dell uno o la ridotta funzionalità dell altro inducono l ipereccitabilità muscolare che produce i sintomi clinici della malattia. Quindi, oggi si cerca di opporsi all ipereccitabilità utilizzando un farmaco bloccante dei canali del sodio, la mexiletina. La mexiletina è il farmaco di prima scelta nel trattamento delle miotonie, con alcuni limiti importanti: non tutti i pazienti rispondono alla mexiletina; il farmaco può provocare effetti avversi che ne limitano l uso Ci siamo quindi posti due domande: 1) i canali del sodio mutati sono sensibili alla mexiletina? 2) ci sono altri farmaci potenzialmente utili nel trattamento della miotonia?

Commenti Per rispondere alla prima domanda, abbiamo studiato nel dettaglio gli effetti delle mutazioni sulla funzione del canale. Abbiamo osservato che due mutazioni provocando miotonia possono alterare in modo opposto la dipendenza dal voltaggio, e abbiamo saggiato due farmaci: la mexiletina ed un altro bloccante dei canale del sodio, la flecainide. Il canale mutato con una voltaggio-dipendenza più negativa è molto sensibile a entrambi i farmaci, ed i pazienti portatori di quella mutazione rispondono bene alla mexiletina. Il canale mutato con una voltaggio-dipendenza più positiva sono meno sensibili alla mexiletina, e i pazienti traggono in effetti meno beneficio dal farmaco. Invece, per le sue specifiche proprietà, la flecainide è ancora molto efficace su questo canale mutato. Sulla base di questi risultati, abbiamo dunque definito un meccanismo farmacogenetico, cioè una risposta diversa all azione dei farmaci in funzione della mutazione. E questo il presupposto per una medicina personalizzata, che già ha riscontrato un certo successo nell ambito del trattamento delle miotonie da sodio.

Commenti Per la seconda domanda, cioè se ci sono farmaci disponibili potenzialmente utili nel trattamento della miotonia, siamo partiti da un risultato ottenuto qualche anno fa nel nostro laboratorio che dimostrava che alcuni farmaci noti come ligandi dei recettori per l adrenalina erano anche potenti bloccanti dei canali del sodio alla pari della mexiletina. Abbiamo quindi recentemente sviluppato, anche su richiesta di ditte farmaceutiche, un modello in vivo di miotonia, per potere esplicitare dei test preclinici di efficacia. Se si gira un ratto sul dorso, l animale metterà meno di un secondo per raggirarsi su se stesso. Se si somministra un bloccante dei canali del cloro muscolari, si ricrea la condizione di miotonia da cloro, e l animale impiegherà circa 4 secondi per rimettersi sulle 4 zampe. Il tempo di raddrizzamento dipenderà quindi dell effetto antimiotonico del farmaco saggiato. E abbiamo così confermato in vivo l effetto antimiotonico del propranololo, che suggeriamo poter essere utilizzato quindi dai pazienti.