Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA: Combina la specificità degli anticorpi con la sensibilità dei dosaggi enzimatici. immunoassay techniques used for detection or quantification of a substance based on an immunological reaction. Enzyme immunoassays developed for the measurement of microamounts of substances in test samples, making them useful in routine analytical determinations. Principio: sfrutta la capacita delle superfici di plastica di adsorbire quantitita piccole ma rivelabili di proteina. Si tratta di un saggio in fase solida effettuato su piastre da microdosaggio. Ogni piastra contiene 96 pozzetti e permette di saggiare contemporaneamente un elevato numero di campioni. Limite: provvede informazioni solo sulla presenza/concentrazione di una molecola, ma non danno informazioni sulle sue proprietà biochimiche (es peso molecolare, localizzazione cellulare, ecc).

ELISA: APPLICAZIONI I tests ELISA rappresentano un mezzo fondamentale per l industria farmaceutica, con applicazioni nella scoperta di farmaci, negli studi con modelli animali, nei trials clinici. Drug discovery: nelle industrie farmaceutiche più di 100.000 molecole sono testate di routine con kit ELISA nelle fasi iniziali dello screen per identificare molecole promettenti. Food science industry: i kit ELISA vengono utilizzati per analizzare le tossine nel cibo. Negli ultimi anni l utilizzo della tecnica ELISA si è sempre più diffuso anche nei laboratori di ricerca. In particolare è utilizzata per: Determinare presenza e concentrazione di un antigene nel campione da testare; Determinare presenza e concentrazione di un anticorpo nel campione da testare; Determinare presenza e concentrazione di citochine secrete, sia in vivo nel plasma che in vitro in medium

Concentrazione Antigene Si utilizzano fondamentalmente due tecniche ELISA, chiamate sandwich ELISA e competitive ELISA. Sandwich Competitive

Concentrazione Anticorpo Si utilizza principalmente la tecnica indirect ELISA. Indirect

Sandwich ELISA Un anticorpo, detto capture antibody, viene purificato e legato alla piastra. Si aggiunge la soluzione test contenente l antigene, permettendo la formazione del complesso antigene-capture antibody. Le molecole che non si sono legate vengono eliminate tramite lavaggi. Un secondo anticorpo marcato, detto detection antibody, viene aggiunto, permettendo il suo legame all antigene ed il completamento del sandwich. La quantificazione avviene misurando la quantità di detection antibody legato, grazie all utilizzo di substrati colorimetrici.

Sandwich ELISA

Sandwich ELISA Scopo: questo ELISA viene utilizzato per determinare la presenza e la concentrazione di un antigene in un campione biologico. Caratteristiche: è veloce ed accurato; utilizzando l antigene purificato (se disponibile) come standard, permette di determinare la quantità assoluta dell antigene nel campione analizzato. richiede due anticorpi che riconoscono epitopi diversi sull antigene. Questo risultato può essere raggiunto sia utilizzando due anticorpi monoclonali con diversa specificità, o anticorpi policlonali (contengono molteplici specificità perché nella loro secrezione intervengono diverse cellule B che riconoscono regioni o epitopi diversi sull antigene). Vantaggi: L antigene non deve essere purificato. Elevato grado di specificità. Limite: non tutti gli anticorpi possono essere utlizzati.

Sensibilità del sandwich ELISA La sensibilità di questa tecnica dipende da 4 fattori: 1. numero di molecole del capture antibody legato alla fase solida; 2. avidità del capture antibody per l antigene; 3. avidità del detection antibody per l antigene; 4. attività specifica del detection antibody. Come migliorarla??? 1. Facilmente modificabile variando la concentrazione dell anticorpo. Le piastre in polyvinylchloride (PVC) legano circa 100 ng/well; se la massima capacità di legame è richiesta, si utilizzano 50 ul/well di una antibody solution concentrata 20 ug/ml (1 ug/well). 2, 3. Per l avidità si può solamente cambiare anticorpo. Più forte è l interazione anticorpo-antigene più bassa è la concentrazione di antigene che può essere rivelato. Ciò è controbilanciato dalla crossreactivity con molecole aspecifiche. Bilancio tra necessità di rivelare la molecola ed essere sicuri che sia realmente la molecola di interesse!!!. 4. Può essere modificata variando il sistema di rivelazione con cui è coniugato. Ad esempio si può sostituire l enzima con la biotina, utilizzando poi avidina/streptavidina marcata.

Competitive ELISA

Indirect ELISA L antigene viene purificato e legato alla piastra. Si aggiunge il siero/plasma da analizzare. Se presenti, le immunoglobuline specifiche per l antigene formano il complesso antigene-anticorpo. Le molecole che non si sono legate vengono eliminate tramite lavaggi. Si aggiunge un secondo anticorpo marcato, che abbia specificità per le immunoglobuline della specie da cui il siero/plasma testati derivano. Il secondo anticorpo si lega al complesso antigene-anticorpo immobilizzato sulla piastra. La quantificazione avviene misurando la quantità di anticorpo secondario legato, grazie all utilizzo di substrati colorimetrici.

Indirect ELISA

Indirect ELISA Scopo: rivelare presenza e concentrazione di anticorpi nel siero e/o plasma Caratteristiche: è veloce ed accurato; permette di determinare: - la presenza di anticorpi contro l antigene immobilizzato; - la quantità di immunoglobuline presenti, grazie all utilizzo di controlli positivi presenti in concentrazioni note. - titolo anticorpale: la più alta diluizione a cui l anticorpo è ancora in grado di dare un segnale positivo; Limite: l antigene deve essere purificato.

ELISA: enzimi e substrati Il metodo più utilizzato per la rivelazione dell avvenuto legame antigeneanticorpo consiste nella coniugazione dell anticorpo secondario con una molecola che può essere direttamente rivelata. Anticorpi coniugati ad enzimi: vengono utilizzati enzimi in grado di convertire un substrato incolore in un prodotto colorato. Alkaline phosphatase: per anticorpi coniugati alla fosfatasi alcalina si usa in genere il substrato p-nitrophenylphosphate (pnpp), che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a 405-410 nm. Peroxidase: per gli anticorpi coniugati alla perossidasi si possono scegliere diversi substrati, tra i più utilizzati: 2,2-azinodiethyl-benzthiazoline sulfonate (ABTS), colore blu-verde misurabile a 405-410 nm. che sviluppa un o-phenylene diamine (OPD), sviluppa un colore arancio scuro misurabile a 492 nm. Caratteristiche dei substrati: stabile sicuro, non tossico poco costoso

ELISA: diluizioni seriali Un comune obiettivo che si vuole raggiungere con il test ELISA è quello di stimare la concentrazione di una molecola in una preparazione test. Questo è possibile confrontando la risposta con quella ottenuta con una preparazione standard che contiene concentrazioni note della molecola. Il test viene eseguito diluendo progressivamente sia la preparazione standard (concentrazione nota) sia la preparazione test (concentrazione sconosciuta). Le diluizioni vengono tipicamente effettuate in n-fold serial manner: es 2-fold: 2-4-8-12-24-48-64-128-. Si ottiene una curva standard utilizzata per determinare la concentrazione della molecola nella preparazione test.

ELISA: quantificazione dei risultati La quantità di segnale generato dal legame del secondo anticorpo è proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione testato. La quantificazione può essere ottenuta generando una curva standard e comparando l attività ottenuta con il campione a quella ottenuta sulla curva standard Sensitivity Enhancement: un metodo frequentemente utilizzato per aumentare la sensibilità della tecnica sfrutta il legame biotina/streptavidina

Presenza delle IgG anti-tat su siero di coniglio immunizzato con la proteina Tat. Per il nostro esperimento utilizzeremo sieri di conigli prima e dopo l immunizzazione con la proteina ricombinante Tat. Preparazione sieri: dopo la formazione del coagulo, il sangue viene centrifugato a 1000 x g per 10 min. Dopo la centrifugazione il siero viene rimosso rapidamente e con cura dalle RBC. Conservazione sieri: se non analizzati immediatamente, i sieri devono essere aliquotati (per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento) e conservati a 80 C. I sieri devono essere scongelati a temperatura ambiente. Proteina Tat: espressa in Escherichia Coli e purificata tramite cromatografia di affinità heparin sepharose. La proteina purificata ha una purezza, testata in SDS-PAGE, >95%. Diluizioni sieri: utilizzeremo la diluizione seriale 2-fold Pre-immunizzazione: partire da 1:50 Post-immunizzazione: partire da 1:500

Quantificazione delle IgG anti-tat su siero di coniglio immunizzato portare tutti i reagenti a RT per 30-60 minuti prima dell uso utilizzando buffer A, preparare le diluizioni seriali dei sieri di coniglio. diluizioni iniziali: 1:50 per il pre, 1:500 per il post-immunizzazione. NB: considerare che servono 200 ul per ogni condizione. piastrare i sieri in doppio, 100 ul/well. NB: la prima lane viene lasciata vuota come bianco (non c e TAT adeso) nell ultima lane viene piastrato solo tampone incubare la piastra (coperta) 90 minuti a 37 C lavare la piastra 5 volte con buffer B diluito. aggiungere 100 ul/well goat anti rabbit IgG HRP-conjugated, diluito 1:1000 in buffer A. incubare la piastra (coperta) 60 minuti a 37 C. lavare la piastra 5 volte con buffer B diluito. ricostituire prima dell uso il color buffer, distribuire 100 ul/well. coprire la piastra, aspettare lo sviluppo del colore incubando a RT. Di solito sono necessari da 20 a 45 minuti. leggere gli assorbimenti a 405 nm usando il microplate reader.

TAMPONI NECESSARI Wash buffer: preparare 1250 ml wash buffer diluendo 1:10 con dh 2 O il wash buffer concentrate (buffer B). Se si sono formati cristalli, il buffer B deve essere tenuto a RT e gentilmente agitato per dissolvere completamente tali cristalli. Soluzione anticorpo coniugato: preparare immediatamente prima dell uso diluendo il goat anti rabbit IgG HRP-conjugated 1:1000 in buffer A. Non puo essere riutilizzato per successivi esperimenti. Color buffer: deve essere ricostituito immediatamente prima dell uso. Sciogliere la pasticca di ABTS in 12.5 ml di buffer C ed aggiungere 12.5 µl di buffer C 1. Il color buffer e light sensitive, quindi evitare prolungate esposizioni alla luce. NB: il buffer C1 contiene 30% H 2 0 2 : usare guanti!!!

Quantificazione delle IgG anti-tat su siero di coniglio immunizzato Microplate da 96 pozzetti (well), nel formato standard 8 righe x 12 colonne. La risposta di un ELISA è il cambiamento di colore della soluzione nel pozzetto, che viene misurato da uno spettrofotometro (misura la quantità di luce che passa attraverso i pozzetti del microplate). Se il colore della soluzione cambia da chiaro a scuro, la densità ottica rilevata dallo strumento aumenta proporzionalmente.

Microplate washer permette di automatizzare i lavaggi della piastra; la piastra viene posta con la prima lane verso l esterno; si imposta il programma numero 4, che esegue una serie da 5 lavaggi. Microplate reader si accende prima il microplate reader poi il computer. La piastra viene posta con la prima lane a sinistra; si apre il programma Microplate manager. Sotto File aprire New endpoint protocol. Su questa finestra impostare reading parameter e mix time; aprire Show template: cliccando sulla X selezionare le lane con i sieri piastrati, cliccando sulla B selezionare la prima lane come bianco; ritornare a endpoint protocol: cliccare RUN per ottenere i risultati. Per sottrarre automaticamente il bianco selezionare Absorbance Report sulla finestra View; i risultati possono essere esportati direttamente su foglio excel. Sotto File selezionare export to excel e creare il nuovo file. Assorbimenti superiori a 2.8 o inferiori a 0.25 sono di solito considerati fuori scala e quindi non utilizzabili. Il limite minimo varia naturalmente in base al valore del bianco.

Anti-TAT IgG Immunoassay Alle piastre viene fatta aderire la proteina Tat Utile per determinare la concentrazione di IgG anti-tat in: -topi immunizzati con proteina ricombinante Tat -conigli immunizzati con proteina ricombinante Tat -scimmie immunizzate con proteina ricombinante Tat o infette con SIV o SHIV -pazienti infetti con HIV

Anti-TAT IgG Immunoassay sandwich Alle piastre viene fatto aderire l anti-tat

Mouse immunoglobulins isotyping ELISA assay Alle piastre vengono fatte aderire anticorpi specifici per le diverse sottoclassi di immunoglobuline.

PhosphoELISA Metodo semplice, ma molto potente per misurare le proteine phosphorylation-site specifiche. Il sandwich ELISA inizia con un pan Ab (es Akt), pre-coated su una piastra a 96 pozzetti. I campioni sono aggiunti e la proteina totale viene catturata, similarmente ad una immunoprecipitazione. L Ab prediluito di detection è aggiunto subito dopo, ed è un phospho-site specific (es Akt [ps473]). Il sandwich è riconosciuto usando un secondo Ab HRP-conjugated e di seguito da un substrato colorimetrico.. La validazione viene fatta tramite confronto con Wb Vantaggi -Elevata sensibilità, (media 10.000 cellule/pozzetto) - Estremamente riproducibili nel tempo (lotto a lotto) - Semplice e rapida, i reagenti sono già ottimizzati