Federica Nigro Di Gregorio

Foggia, 7-8 febbraio 2012 Aggiornamento di procedure di campionamento e test in situ, implementazione di sistemi analitici per la determinazione di tossine acquatiche e cianotossine Sviluppo e Ottimizzazione di un metodo LC-MS/MS applicato alla determinazione di cianotossine in campioni d acqua destinata e da destinare al consumo umano Federica Nigro Di Gregorio Reparto Igiene delle Acque Interne Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria

\ LC- MS

Conforme ai criteri normativi \ -limite di rivelazione < 0.1 µg/l -accuratezza e precisione idonei allo scopo -rapido -automatizzabile

Analiti selezionati (6) D-Glu (7) N-metildeidroalanina (Mdha) H H COOH 3 C O (5) Adda H 3 C H O H H 3 C H H HN O O N H CH 2 H 3 C NH O (1) D-Ala MCs R1 R2 Dem-MC-RR Arginina Arginina H 3 C H H 3 C H NH H CH 3 NH R 1 MC-RR Arginina Arginina R 2 O H COOH MC-YR Tirosina Arginina \ (3) D-eritro- -metilasp Dem-MC-LR Leucina Arginina MC-LR Leucina Arginina MC-LA Leucina Alanina MC-LY Leucina Tirosina MC-LF Leucina Fenilalanina Nodularina (STANDARD INTERNO) MC-LW Leucina Triptofano

\ LC- MS

Conservazione e pretrattamento del campione -bottiglie di polietilene o vetro scuro -temperatura 1-10º -conservazione al buio Tossine intracellulari isolamento delle cellule (filtrazione) estrazione previa lisi cellulare (congelamento-scongelamento, ultrasuoni) in presenza di solvente organico Tossine extracellulari o libere isolamento degli analiti in soluzione acquosa: SPE filtri 0.45 mm Tossine totali intracellulari + libere Filtri a fascia nera Congelamento scongelamento

\ 1) 0,5 L campione di acqua +1µg/L di Nodularina 2) PRECONCENTRAZIONE DEGLI ANALITI Cartucce SPE (Carbograph 4) 3) RI-ESTRAZIONE DEGLI ANALITI Eluizione: 1 ml CH 3 OH + 6 ml CH 2 Cl 2 /CH 3 OH (80:20 v/v) 10 mmol/l TFA 4)- evaporazione a 50 C -ricostituzione del residuo -iniezione 50/1000 estratto finale

0,5 L campione di acqua +1µg/L di Nodularina Filtrazione del campione di acqua (filtri a fascia nera) Iniezione diretta (100 µl di campione)

Tossine di origine algale e da cianobatteri Metodo di conferma: fornisce informazioni per l identificazione e la quantificazione di tossine in esame sviluppo di sistemi API alla fine degli anni 80 sistema estremamente sensibile (limite inferiore di rivelabilità intorno al picogrammo) utilizzo nel settore analitico ambientale nell ultimo decennio:

Campione Sistema di separazione cromatografica Sorgente di ioni Analizzator e di massa Rivelatore m/z A B C Presentazione del segnale Elaboratore di segnale

\ LC- MS

Informazioni strutturali e proprietà chimiche della molecola

Cella di collisione Q2 Filtro Q1 Filtro Q3

Spettrometro di massa: API 3000 triplo quadrupolo (AB-Sciex) Sorgente: Atmospheric Pressure Ionization (API) Interfaccia: Turbo IonSpray (TIS)

Turbo V Source: ESI Nebulizer Gas LC Atmospheric pressure Vacuum TurboV heaters High Voltage Curtain Gas Evaporation (TurboV heaters) Mass Analyzer Exhaust Formation of charged droplets Coulomb- Explosion Orifice Curtain Gas 15 2009 Applied Biosystems

Curtain Gas Interface CUR DP SK Atmospheric pressure Vacuum Q 0 N 2

+ + + + + + Curtain Gas Interface CUR DP SK Atmospheric pressure Vacuum Q 0 N 2

+ Curtain Gas Interface CUR DP SK Atmospheric pressure Vacuum Q 0 N 2

IONIZZAZIONE

Identificazione certa con MS_ Identification point (Ips) \

Q1 scan: full scan (Start Stop) Soluzione standard di MC-dem-RR 5 ng/µl Ione molecolare protonato

Analisi LC-MS/MS di microcistine

Production Ion Scan (MS/MS)- Frammentazione Continuous Ion Flow Q1= Resolving Q3 = Scanning Utilizzato per l identificazione di ioni prodotti Dopo l identificazione lo ione precursore viene inviato nella cella di collisione e viene frammentato. Q1 è fisso, filtra lo ione prursore selezionato Q3 seleziona in range di masse stabilito, gli ioni prodotti

Production Ion Scan (MS/MS)- Frammentazione Continuous Ion Flow Q1= Resolving Q3 = Scanning Ione frammento Ione frammento CE=30 CE=60

MRM ( Multiple Reaction Monitoring) DP, volt

Precursor Ion Scan Q 1 Collision cell Q 3 + O C H 3 + O C H 3 N 2 + O C H 3 N 2 N 2 IDENTIFICAZIONE MCs IN FULL-SCAN

\ LC- MS

Colonna Alltima C18 (2.1x250 mm, ID 5µm) Temperatura 40 Flusso 200 µl/min Fase mobili ACN 10 mm HCOOH H 2 O 10 mm HCOOH Volume iniettato 50 µl

Cromatogramma LC-MS/MS in modalità MRM risultante da un iniezione di 0,5 L di un campione di acqua deionizzata contaminato con 0,1 µg/l di una miscela degli analiti oggetto di studio e 1 µg/l dello standard di processo

Cromatogramma LC-MS/MS in modalità MRM risultante da un iniezione di 0,5 L di un campione di acqua deionizzata contaminato con 0,1 µg/l di una miscela degli analiti oggetto di studio e 1 µg/l dello standard di processo MC-dem-RR>135 (quantifying TRANSITION) MC-dem-RR>213 (diagnostic TRANSITION)

Composto Massa esatta, (m/z) Transizioni, (m/z) e abbondanze relative 166 91 166 107 166 131 166 149 Phe 165.191 2.2% 34.4% 50% 13.4% Ana-a 165.234 9.7% 10.5% 27% 52.8% O NH 2 OH Fenilalanina (amminoacido) O CH 3 NH Anatoxin-a (neurotossina algale)

Conclusioni Sviluppo e validazione di un metodo analitico di conferma per la valutazione del rischio da esposizione a microcistine in acque potabili in distribuzione Determinazione di 12 congeneri di Cianotossine LOD :0.002-0.013 µg/l Modello di approccio generale per la gestione delle emergenze correlate a proliferazione di cianobatteri potenzialmente tossici nella filiera di produzione di acque destinate a consumo umano Controllo Ricerca (studi ambientali, efficienza dei trattamenti, prevenzione dei fenomeni)