ANTI-EBV EA IgM ELISA

ANTI-EBV EA IgM ELISA 96 807015 Analisi immunoenzimatica per la determinazione in vitro di anticorpi IgM contro l antigene precoce (EA) p54/p138 del virus di Epstein-Barr in siero o plasma umano

SOMMARIO 1. USO PREVISTO...51 2. PRINCIPI DELLA PROCEDURA...51 3. REAGENTI...52 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI...53 5. CAMPIONE...54 6. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO...54 7. ISTRUZIONI PER L USO...54 8. CONTROLLO QUALITÀ...56 9. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI...56 10. LIMITAZIONI DEL TEST...57 11. RISULTATI PREVISTI...58 12. CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE...58 13. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI...58 14. GUIDA PER LA RISOLUZIONE DI PROBLEMI...59 50

1. USO PREVISTO Anti-EBV EA IgM ELISA è un sistema per uso diagnostico in vitro per la determinazione di anticorpi IgM contro gli antigeni precoci (EA) p54 e p138 del virus EBV. I risultati ottenuti con questo test, congiuntamente ad altri dati clinici e relativi a pazienti, ottenuti in saggi per la ricerca di altri anticorpi specifici per il virus Epstein-Barr, quali IgG anti-ea, IgG/IgM anti- VCA e IgG anti-ebna-1, agevolano la diagnosi sierologica dell infezione da EBV. L infezione primaria da EBV può avere esito in mononucleosi infettiva (IM = morbo di Pfeiffer) (1,2). La malattia si verifica in modo predominante tra gli adolescenti più prossimi all età adulta e tra gli adulti giovani. La malattia acuta può essere caratterizzata dalla seguente sintomatologia: febbre, faringite, tonsillite, linfoadenopatia, nausea, mal di testa, mialgia, epato-splenomegalia, leucocitosi (2). Altri agenti infettivi patogeni, quali Citomegalovirus, Toxoplasma gondii, virus della Rosolia, virus dell epatite, virus dell immunodeficienza umana (HIV) possono causare sintomi simili. Anti-EBV EA IgM ELISA può essere impiegato per identificare un infezione da EBV. 2. PRINCIPI DELLA PROCEDURA Anti-EBV EA IgM ELISA è un analisi immunoenzimatica (enzyme immuno sorbent assay, ELISA) indiretta ad elevata sensibilità per la determinazione di anticorpi specifici per l EBV nel siero o nel plasma. Durante la prima fase di incubazione gli anticorpi IgM del campione si legano agli antigeni ricombinanti (rec) p54 e p138 (3-5) rivestiti per la micropiastra. Il materiale aspecifico sarà rimosso mediante lavaggio. Il complesso risultante antigene-anticorpo viene rilevato utilizzando un anticorpo monoclonale specifico marcato con enzimi, diretto contro le IgM umane. Il coniugato legato in modo non selettivo sarà rimosso in un ulteriore fase di lavaggio. Nella fase di incubazione finale, la soluzione di substrato (TMB, 3,3,5,5 -tetrametilbenzidina) viene aggiunta nei pozzetti. La reazione enzimatica viene bloccata aggiungendo acido solforico (la colorazione cambia da blu a gialla) e la densità ottica (OD) è misurata con uno spettrofotometro a 450 nm e con un filtro di riferimento di 615-690 nm. 51

3. REAGENTI Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l esecuzione di 96 testi. Tutti i reagenti sono destinati all uso esclusivo nella diagnostica in vitro. Identificazione sull etichetta Descrizione R1 Microplate Micropiastra: 12 singoli strip con 8 pozzetti ciascuno, rivestiti di antigeni ricombinanti p54/138 EA- EBV (concentrazione: 0,4 μg/ml) R2 EBV Concentrated Soluzione di Lavaggio Concentrata (x 500): Washing Solution Conservante: 2-bromo-2-nitro-1,3- (500x) propandiolo 0,01% R3 R5 EBV EA IgM Negative Control EBV EA IgM Positive Control Controllo Negativo IgM EA EBV: Siero umano negativo per anticorpi IgM anti EBV-EA e negativo per antigene HBs, anti- HIV1, anti-hiv2 e anti-hcv Conservante: gentamicina 0,005%, streptomicina 0,05%, penicillina V 0,05% Controllo Positivo IgM EA EBV: Siero umano reactivo per anticorpi IgM anti EBV-EA e negativo per antigene HBs, anti- HIV1, anti-hiv2 e anti-hcv Conservante: gentamicina 0,005%, streptomicina 0,05%, penicillina V 0,05% R6 Conjugate Anti-IgM Umane Coniugato: Anticorpo monoclonale marcato con perossidasi di rafano Conservante: penicillina V 0,025%, solfato di streptomicina 0,025%, ProClin 300 < 1,5% R7 R9 R10 EBV Sample Diluent EBV Chromogen TMB EBV Stopping Solution Diluente per campioni: Conservante: solfato di neomicina 0,01%, cloramfenicolo 0,03% Cromogeno: 3,3,5,5 Soluzione di tetramethylbenzidina (TMB) < 0,05 % in H 2O Vedere Avvertenze e Precauzioni Soluzione Bloccante: Acido solforico < 1 N H 2SO 4 Presentazione 1 Pronto per l uso 1 x 6 ml Da diluire 1 x 1,2 ml Pronto per l uso 1 x 1,2 ml Pronto per l uso 1 x 15 ml Pronto per l uso 1 x 45 ml Pronto per l uso 1 x 13 ml Pronto per l uso 1 x 15 ml Pronto per l uso 52

Identificazione sull etichetta Storage Bag Self-adhesive transparent foils Descrizione Sacchetto per Conservazione: Sacchetto in polietilene per conservare le strip per micropiastra residue Pellicole Trasparenti Adesive: Pellicole trasparenti adesive per sigillare i pozzetti della micropiastra durante l incubazione Conservanti: concentrazione totale < 0,11% Presentazione 1 4 Requisiti per la manipolazione e la conservazione I reagenti restano stabili fino alla data di scadenza indicata su ciascuna singola etichetta, a condizione che gli stessi siano conservati ad una temperatura di 2-8 C. Dopo l apertura, i reagenti devono essere utilizzati entro 30 giorni. In caso di test ripetuti, avere cura di conservare i reagenti subito dopo l utilizzo, ad una temperatura di 2-8 C. La micropiastra è sigillata in un involucro di alluminio contenente essiccante e deve essere aperta solo una volta raggiunta la temperatura ambiente. Riporre le strip non utilizzate insieme all essiccante nella busta con chiusura a zip e conservare come indicato a 2-8 C. Non toccare il bordo superiore o il fondo dei pozzetti con le dita. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Non ingerire i reagenti. Evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Tutti i campioni e i materiali utilizzati per l analisi devono essere trattati come potenzialmente infetti, adottando adeguate precauzioni di sicurezza. I controlli sono negativi per anti-hiv 1/2, anti-hcv, HBsAg, anti-sifilide e transaminasi elevate. Non pipettare con la bocca. Adottare idonee pratiche di laboratorio indossando guanti, abbigliamento e occhiali protettivi adeguati. I liquidi e i materiali non combustibili devono essere decontaminati con ipoclorito di sodio (concentrazione finale: 3%, con tempo di attività di almeno 30 minuti). I rifiuti liquidi che contengono acidi devono essere neutralizzati prima di essere eliminati. Le micropiastre e tutti i materiali da riutilizzare devono essere autoclavati per 1 ora a 121 C. Il Cromogeno (R9) è sensibile alla luce ed è quindi necessario proteggerlo dalla luce stessa. Il test deve essere eseguito da tecnici di laboratorio autorizzati ed adeguatamente addestrati. La procedura richiede condizioni asettiche e microbiologicamente controllate. Se il kit originale è danneggiato informare il produttore. AVVERTENZA: Alcuni reagenti contengono ProClin 300 < 1.5% Per i rischi e le raccomandazioni di sicurezza consultare la tabella alla fine dell inserto della confezione. 53

5. CAMPIONE È necessario utilizzare campioni di siero o di plasma freschi, privi di emolisi. Campioni di siero o plasma fortemente lipemici, itterici o microbicamente contaminati e preparati di immunoglobuline concentrati potrebbero compromettere l affidabilità dei risultati del test. Evitare di congelare e scongelare ripetutamente i campioni. Se è necessario trasportare i campioni, confezionarli conformemente alle direttive in vigore per il trasporto di materiale infetto. Non inattivare i campioni, per evitare reazioni aspecifiche. 6. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO Micropipette, spettrofotometro (450 nm, lunghezza d onda di riferimento 615-690 nm), sistema di lavaggio micropiastra (con lavaggio del fondo), incubatrice (37 C) per micropiastre. 7. ISTRUZIONI PER L USO Preparazione dei reagenti Diluire la Soluzione di Lavaggio Concentrada (R2) con acqua demineralizzata o deionizzata (1:501). La Soluzione di Lavaggio così preparata rimane stabile per 1 settimana, a condizione che sia conservata a 2-8 C. Tutti gli altri componenti per il test vengono preparati in modo da essere pronti per l uso. Tutti i reagenti sono specifici per lotto e non possono essere utilizzati con kit di lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri produttori. Preparazione dei campioni Si raccomanda di attenersi strettamente al protocollo (vedere la procedura di pipettamento). Diluizione campione 1:21 con prediluizione in provette: Diluire i Controllo Negativo (R3), Controllo Positivo (R5) e i campioni a 1:21 in una provetta (ossia 25 μl di controllo o campione + 500 μl di Diluente (R7)). Miscelare accuratamente. Diluizione del campione 1:21 con diluizione direttamente nella piastra: Pipettare 200 μl di Diluente (R7) in ciascun pozzetto. La diluizione effettuata direttamente nella micropiastra è consigliata soprattutto con l utilizzo di pipettatrici automatiche. Se la diluizione effettuata nella piastra viene eseguita manualmente, è importante evitare legami aspecifici di proteine, attenendosi alle seguenti fasi: Pipettare prima 200 μl di Diluente (R7) nel pozzetto, quindi aggiungere 10 μl di campione o controlli. Miscelare da 5 a 7 volte, aggiungendo 10 μl di campione o controllo. 54 Procedura di lavaggio La procedura di lavaggio ha un importanza primaria. Un lavaggio insufficiente potrebbe compromettere la precisione e provocare reazioni aspecifiche.

Lavare 5 volte con soluzione tampone. Per farlo, rimuovere il liquido nel pozzetto ed erogare 300μl di soluzione tampone. Ripetere la procedura di lavaggio 5 volte. A lavaggio terminato, picchiettare sulla piastra. Non lasciare che la piastra diventi secca. Procedura di pipettamento per la determinazione qualitativa delle IgM (provetta di diluizione) Consentire a tutti i reagenti di raggiungere la temperatura ambiente prima dell uso. I controlli e il bianco devono essere pipettati per ultimi. Dopo avere pipettato i controlli e i campioni, procedere immediatamente all incubazione della piastra. Fase 1 Pozzetto [µl] A1/B1 C1/D1 E1/F1 G1 Blanco 200 µl R7 - - - Doppio test Controllo Negativo (R3) - 200 µl R3 - - Doppio test Controllo Positivo (R5) - - 200 µl R5 - Campione 1:21 - - - 200 µl Campione Sigillare la piastra utilizzando le pellicole adesive (non richiesto in sistema ELISA*) Incubazione 60 ± 2 min., 37 ± 1 C Sistema*: 60 ± 2 min., 37 ± 1 C Lavaggio 5x Soluzione di Lavaggio Diluata (R2) 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Fase 2 Pozzetto [µl] Coniugato (R6) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Sigillare la piastra utilizzando le pellicole adesive (non richiesto in sistema ELISA*) Incubazione 30 ± 1 min., 37 ± 1 C Sistema*: 30 ± 1 min., 37 ± 1 C Lavaggio 5x Soluzione di Lavaggio Diluata (R2) 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Fase 3 Pozzetto [µl] Cromogeno (R9) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubazione 30 ± 1 min., a temperatura ambiente e al buio Sistema*: 15 ± 1 min., a temperatura ambiente e al buio Soluzione Bloccante (R10) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Misurare l estinzione immediatamente o entro 15 minuti dopo il bloccaggio a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro (lunghezza d onda di riferimento: 615-690 nm). * Se viene impiegato un sistema ELISA, è responsabilità dell operatore convalidare il test. 55

8. CONTROLLO QUALITÀ Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di qualità, dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è conservata presso Bio-Rad. 9- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI I campioni con un valore di estinzione al di sotto dell area grigia sono da considerarsi negativi. Un campione che presenti un valore di estinzione uguale o maggiore rispetto alla zona grigia, è da considerarsi positivo per anticorpi IgM specifici per EA-EBV. Se il valore OD del campione ritestato è compreso nella zona grigia (risultato non affidabile), si consiglia di richiedere un campione di controllo. Calcolo del valore di cut-off e dell area grigia Il valore di cut-off viene calcolato dal valore medio OD (densità ottica) del Controllo Negativo (R3 X) più 0,200: Valeur seuil = R3 X + 0,200 L area grigia si estende tra il valore di cut-off e il valore di cut-off meno 10%. Criteri di convalida della determinazione qualitativa Dopo la misurazione dei valori di estinzione a 450 nm in tutti i pozzetti (filtro di riferimento: 615-690 nm), il valore medio dei bianchi viene sottratto dai valori di estinzione dei controlli e dei campioni: Estinzione media dei bianchi 0,100 OD Dopo la sottrazione del bianco, i valori di controllo devono soddisfare i seguenti criteri di validità: Valore OD medio di R3 0,200 Valore OD medio di R5 0,400 56

Schema intepretativo del test IgM EA Stato dell infezione Tipologia di reazione Anti-EBV EA + EBNA ELISA da EBV EA IgM EA IgG EBNA IgG IgM EA soglia (DO=0,5) EBNA soglia (DO=0,5) Infezione acuta Fase precoce + 0,5 Infezione primaria + + Infezione primaria + + (+) < 0,5 Fase tardiva + Infezione acuta incerto Sieronegativo Fase precoce incerto (+) < 0,5 Fase tardiva incerto + (+) < 0,5 Riattivazione Secondaria (debole) + + 0,5 0,5 Riattivazione + + + 0,5 Infezione precedente Infezione precedente + + Infezione precedente + Infezione precedente (+) + < 0,5 10- LIMITAZIONI DEL TEST Un risultato negativo del test ottenuto con l analisi Anti-EBV EA IgM ELISA non è sufficiente per escludere completamente un infezione da EBV. I risultati dell analisi vanno interpretati congiuntamente alle informazioni disponibili sulla valutazione clinica del paziente e ad altre procedure diagnostiche. I risultati ottenuti testando campioni prelevati da pazienti immunodepressi non sono semplici da interpretare. Il test potrebbe fornire risultati falsamente positivi per individui che abbiano ricevuto trasfusioni di sangue o altri prodotti emoderivati nei mesi immediatamente precedenti. Anti-EBV EA IgM ELISA è stato impiegato con i seguenti campioni con potenziale reattività crociata: campioni con positività per gli anticorpi anti-varicella stato acuto (6), positività per gli anticorpi anti-citomegalovirus stato acuto (6), anti- Herpes simplex tipo 1 e 2 (5) e anti-toxoplasmosi (5). Nessuno dei campioni analizzati è risultato positivo con Anti-EBV EA IgM ELISA. 57

11. RISULTATI PREVISTI 99 campioni di siero prelevati da donatori di sangue sani e asintomatici, sono stati analizzati con il Bio-Rad EA IgM ELISA. Dei 99 campioni, 5 sono risultati positivi (5,05%) e 94 sono risultati negativi (94,95%), il che corrisponde alle statistiche riconosciute per la prevalenza di esposizione all EBV nella popolazione adulta. La prevalenza varia secondo una serie di fattori quali la posizione geografica, lo stato socioeconomico, la razza, il tipo di test impiegato, le procedure di prelievo e manipolazione campioni e la storia clinica e epidemiologica (5,6). Sono stati analizzati i sieri prelevati da pazienti reduci da malattie da CMV (20), Toxoplasma (20) e reumatoide. (20) Impiegando il sistema EA IgM, EA IgG e EBNA IgG ELISA, è stato possibile identificare 7, 17 e 29 campioni con infezione da EBV primaria, riattivata e precedente (4). 12. CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE Sensibilità e specificità I risultati ottenuti con il test per la determinazione delle IgM EA anti-ebv unitamente ad altre analisi quali la determinazione delle IgG anti-ea e delle IgG anti-ebna-1 agevolano la diagnosi sierologica dell infezione da EBV (3). In pazienti affetti da mononucleosi infettiva (IM), la sensibilità del sistema di test ELISA relativa a queste tre analisi è stata definita pari al 99,2%. La specificità era pari al 98,8% (4). Precisione Un testpanel di 10 sieri rappresentanti campioni con reattività scarsa, bassa ed elevata è stato testato in 11 giorni differenti. La variabilità inter-analisi di questi sieri era compresa nel range 10,0%-16,9%. I campioni dello stesso panel sono stati testati 8 volte nell ambito dello stesso ciclo di test. La variabilità intra-analisi di questi sieri era compresa nel range 2,8%-6,3%. 13. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 1. Linde, A. (1992). Rev. Med. Microbiol. 3, 43-51. 2. Straus, S., Cohen, J.I., Tosato, G. and Meier, J. (1993). Ann. Int. Med. 118, 45-58. 3. Gorgievski-Hrisoho, M., Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J., Vornhagen, R., Sonneborn, H.-H., H., Wolf, H. and Siegl, G. (1990). J. Clin. Microbiol. 26, 2305-2311. 4. Färber, I., Wutzler, P., Wohlrabe, P., Wolf, H., Hinderer, W. and Sonneborn, H. -H. (1993). J. Virol. Meth. 42, 301-108. 58

5. Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J., Vornhagen, R., Wenger-Süss, R. and Sonneborn, H. -H. (1993). Biotest Bulletin 5, 33-46. 6. Tamir, D., Benderley, A., Levy, J. et al. (1974). Pediatrics 53, 330. 14. GUIDA PER LA RISOLUZIONE DI PROBLEMI 1. Inatteso alto tasso di risultati reattivi: a. I campioni e i controlli sono stati pipettati prima di pipettare il Diluente (R7). b. La miscelazione è stata insufficiente. 2. Valore di bianco medio maggiore rispetto al criterio di validità, 0,100 OD: a. Il Cromogeno (R9) ha assunto colorazione blu a causa di ossidazione o contaminazione. b. Errore lavaggio: Eseguire la fase di 5 cicli di lavaggio. Se si utilizza un dispositivo di lavaggio manuale, eseguire una fase di 7 cicli di lavaggio. Utilizzare La Soluzione de Lavaggio (R2) Bio-Rad se contenuto nel kit. c. Errore durante l incubazione: Temperatura troppo elevata, il tempo di incubazione è stato superato o la piastra non è stata incubata direttamente dopo il pipettamento. d. Errore di lunghezza d onda: La misurazione senza un filtro di riferimento determina un aumento dei valori OD di circa + 0,120 OD. 3. Colorazione gialla in tutti i pozzetti (vedere 2a, 2b): a. Contaminazione del Soluzione de Lavaggio (R2); preparare una nuova soluzione Soluzione de Lavaggio (R2). b. Contaminazione del Diluente (R7) o del Coniugato (R6); ripetere il test con reagenti provenienti da fiale sigillate. Utilizzare i reagenti in condizioni di ridotta presenza microbica. 4. Valore medio di Controllo Positivo (R5) 0,400 OD: a. Superamento della data di scadenza. b. Temperatura troppo bassa o scesa durante l incubazione. c. Errore lavaggio: Lavaggio troppo intensivo o contatto meccanico del collettore e della fase solida del pozzetto. d. Contaminazione di Controllo Positivo (R5) o 3b. 5. Valore medio di Controllo Negativo (R3) 0,200 OD (vedere 1 e 2 a-d): a. Controllo Negativo (R3) non è stato pipettato dopo il pipettamento dei campioni; pipettare tutti i campioni prima di pipettare i bianchi e i controlli. b. Contaminazione con il coperchio del Controllo Positivo (R5). 59

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