1.1 LE AQUAPORINE: FUNZIONE E STRUTTURA L acqua è quantitativamente il componente predominante dell organismo umano: rappresenta, infatti, circa il 60% del peso di un individuo adulto. L acqua è coinvolta in una serie di funzioni: è il solvente delle reazioni metaboliche, regola il volume cellulare e la temperatura corporea, permette il trasporto dei nutrienti e la rimozione delle scorie metaboliche. Nell adulto l Acqua Totale Corporea (ATC) è distribuita per il 67% all interno delle cellule, ove costituisce il Liquido Intra Cellulare (LIC). Il rimanente 33% è esterno alle cellule e costituisce il Liquido ExtraCellulare (LEC), che comprende il liquido interstiziale (23%), il plasma (7%), la linfa (2%) ed il liquido transcellulare (1%). Il bilancio idrico dipende dal mantenimento dell equilibrio tra il volume di acqua in entrata e quello in uscita dall organismo. Tale equilibrio è regolato sia dal centro ipotalamico della sete, che regola la quantità di acqua da ingerire, che dall ormone antidiuretico (ADH), che aumenta il riassorbimento di acqua nel rene. Il rene è, infatti, il principale organo deputato alla regolazione del bilancio idrico e dell equilibrio elettrolitico. L apparato renale influenza il volume e l osmolarità del liquido extracellulare, sia modificando la quantità escreta di Na +, che alterando la quantità escreta di acqua. L unità funzionale del rene è il nefrone, costituito dal glomerulo e dal tubulo renale. Il glomerulo è una formazione sferoidale, costituita da capillari afferenti ed efferenti, da cui proviene e si diparte il sangue. Questa - 6 -
struttura capillare è a sua volta circondata dalla capsula di Bowman, destinata a raccogliere il materiale filtrato dal glomerulo. La capsula di Bowman si continua direttamente nel tubulo, una formazione canalicolare estremamente complessa, nella quale si distinguono un tubulo prossimale, un ansa di Henle, suddivisa in un tratto discendente ed in uno ascendente, un tubulo distale ed un dotto collettore renale (Martini, 2002) (Fig. 1). Fig. 1 Struttura anatomica del nefrone. Con il meccanismo di filtrazione glomerulare, riassorbimento e secrezione tubulare, il rene controlla la formazione dell urina, grazie alla quale non solo vengono escreti i prodotti di scarto del metabolismo (urea, creatinina, acido urico), ma si determina il controllo omeostatico dell acqua, che regola sia l osmolarità intorno ai 300mOsM, sia la volemia (volume del sangue) e la pressione del sangue. - 7 -
In particolare, il riassorbimento dell acqua, che si sviluppa lungo il dotto collettore renale, è mediato dalla presenza di proteine canale per l acqua. Scoperte nel 1992 dal premio Nobel Peter Agre, tali proteine, largamente distribuite in tutti i regni viventi, compreso quello batterico, delle piante e degli animali, prendono il nome di acquaporine. La struttura molecolare delle acquaporine è rappresentata dal classico modello a clessidra. Le acquaporine sono costituite da 6 domini transmembrana; i segmenti transmembrana sono uniti da 5 anse di connessione, con le terminazioni NH 2 - e COOH-terminali citoplasmatiche. In particolare, le anse B ed E (Fig. 2) possiedono due motivi amminoacidici costituiti da Asparagina, Prolina ed Alanina: esse ripiegano all interno del canale per formare il poro acquoso a livello delle due sequenze conservate. Fig. 2 Struttura molecolare dell aquaporina. Ciascuna metà, NH 2 - e COOH-terminale della proteina, ha sequenza sostanzialmente omologa ed asimmetrica rispetto all altra. Le acquaporine si assemblano nella membrana plasmatica in forma tetramerica. Molti studi suggeriscono che l organizzazione tetramerica sia importante per il passaggio dell acqua, tuttavia, ogni monomero costituisce una unità funzionale (Agre, 2000). - 8 -
1.2 REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE DELLA AQP2: IL RUOLO DELLA VASOPRESSINA L acqua viene riassorbita nei primi segmenti del tubulo renale del nefrone per diffusione passiva, attraverso i pori della membrana. Tuttavia, è nel dotto collettore renale che viene normalizzata la concentrazione finale delle urine, per la presenza, nelle cellule principali del dotto collettore renale, del canale per l acqua AQP2, la cui espressione è regolata dalla vasopressina. La vasopressina è un ormone peptidico costituito da 9 amminoacidi (Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly), secreto dai nuclei sopraottici e paraventricolari dell ipotalamo. Il rilascio della vasopressina, indotto da un incremento dell osmolarità plasmatica, o da una riduzione del volume del sangue circolante, induce il riassorbimento dell acqua grazie alla traslocazione delle vescicole contenenti l acquaporina 2 sulla membrana apicale: questo meccanismo è conosciuto come shuttle di membrana (Fig. 3). In assenza di vasopressina, infatti, la permeabilità all acqua nel dotto collettore renale è bassa e l acquaporina 2 è localizzata in vescicole intracellulari. La stimolazione mediata dalla vasopressina, invece, incrementa di 5-6 volte la permeabilità della membrana all acqua ed è dovuta alla redistribuzione dell AQP2 verso la membrana apicale (Nishimoto et al., 1999). - 9 -
Fig. 3 Meccanismo d azione della vasopressina sulla traslocazione dell AQP2. La vasopressina lega sulla membrana basolaterale il suo recettore, V2, una proteina integrale di 370 amminoacidi, del peso di 40kDa. Il recettore V2 appartiene alla famiglia dei recettori accoppiati alle proteine G eterotrimeriche (GPCR G-protein coupled receptor). Le proteine G sono costituite da 3 subunità, una α, una β ed una γ. L attivazione del recettore V2 media il distacco della subunità α dalla proteina Gs, che, dopo essersi legata al GTP, stimola l adenilato ciclasi, enzima capace di catalizzare la formazione di AMPc da ATP. L incremento dei livelli citoplasmatici di AMPc porta all attivazione di diverse proteine tra cui la PKA, una proteina multimerica, costituita da 2 subunità catalitiche e 2 regolatrici. Quando l AMPc lega le subunità regolatrici della PKA, queste si dissociano da quelle catalitiche con conseguente attivazione della stessa proteina (Valenti et al., 2005). - 10 -
La PKA attiva fosforila molte proteine cellulari, tra cui l AQP2, che trasloca verso la membrana apicale, incrementando la permeabilità della membrana all acqua. E nota, infatti, la presenza di un sito di consenso per la PKA nell AQP2, in corrispondenza della Ser-256 presente nel dominio COOH-terminale della proteina (Procino et al., 2003). In condizioni basali, l AQP2 presente nelle vescicole citoplasmatiche è in parte fosforilata, tuttavia, questo evento, in assenza di stimolazione ormonale, non è sufficiente per la sua traslocazione sulla membrana apicale. E stato dimostrato recentemente che la localizzazione apicale della AQP2 avviene quando almeno tre dei monomeri costituenti il tetrametro di AQP2 sono fosforilati in corrispondenza del residuo di serina in posizione 256 (Kamsteed JCB, 2000). La fosforilazione dell AQP2 nel rene non incrementa la permeabilità del canale all acqua ma è determinante nel processo di regolazione del traffico vescicolare verso la membrana. La fosforilazione dell AQP2 regolata dalla PKA non è, tuttavia, l unico responsabile della traslocazione del canale verso la membrana apicale delle cellule principali (Procino et al., 2003). Il processo è, infatti, ben più complesso ed a determinare la traslocazione dell AQP2, intervengono altri meccanismi che coinvolgono altre proteine (Valenti et al. 2005). - 11 -
1.3 DINAMICHE DEL CITOSCHELETRO NELLA TRASLOCAZIONE DELL AQP2: IL RUOLO DELLE PROTEINE G MONOMERICHE Il citoscheletro è una complessa rete tridimensionale di proteine che si estende dal nucleo fino alla superficie interna della membrana citoplasmatica; esso stabilizza la posizione degli organuli, controllandone il movimento, fornisce il sostegno meccanico alla cellula, determinandone la forma, e favorisce il trasporto delle molecole (Fig. 4). Il citoscheletro interviene nel controllo del metabolismo cellulare; la sua funzione diviene ancora più esplicita nelle cellule renali, in cui le modificazioni del volume cellulare sono maggiormente evidenti e frequenti. Fig. 4 La struttura del citoscheletro. Il citoscheletro è costituito da tre componenti: i microtubuli, i filamenti intermedi e i filamenti di actina. - 12 -
I microtubuli sono proteine a forma di tubo cavo, formati da subunità della proteina tubulina. I filamenti intermedi sono costituiti da subunità fibrose, associate fianco a fianco per creare una struttura a cordone. L actina è una proteina globulare a basso peso molecolare, presente in forma monomerica (G-actina solubile), in condizioni di bassa forza ionica, ph basico e a basse concentrazioni di Ca 2+ e di ATP. Con l aumento delle concentrazioni di ioni metallici, quali il Mg 2+ ed il K +, l actina globulare (G-actina), tende a polimerizzare in lunghi filamenti (F-actina), costituiti da due file di unità globulari avvolte tra loro ad elica. I filamenti di actina si intrecciano e si ramificano costituendo una fitta rete sul lato citoplasmatico della membrana cellulare, che prende il nome di corteccia cellulare. In condizioni fisiologiche il citoscheletro di actina costituisce delle strutture filamentose dette fibre da stress, che possono estendersi tra due punti focali, o tra un punto focale ed i filamenti intermedi, e che permettono alla cellula di esercitare una forza di trazione sulla matrice extracellulare. Variazioni dell osmolarità dell ambiente extracellulare, determinano alterazioni del volume e della forma cellulare; l actina, attraverso la formazione di differenti strutture citoscheletriche, partecipa attivamente al processo di regolazione della forma e del volume cellulare, in risposta a stimoli esterni ed a variazioni della composizione ionica dello spazio intra ed extracellulare. Il rimodellamento del citoscheletro partecipa a diversi processi cellulari: in particolare, la depolimerizzazione dell F-actina corticale è considerata un evento importante per facilitare il processo di esocitosi (Agre, 1999). La regolazione dello stato di polimerizzazione del - 13 -
citoscheletro di actina è mediata da specifiche proteine G monomeriche della famiglia Rho (Nagata and Inagaki, 2005). Esse comprendono RhoA, Rac e Cdc42, del peso molecolare di 20-30KDa, presenti in due diversi stati, uno associato al GTP, l altro al GDP. Quando le proteine sono legate al GTP, esse sono attive, quindi capaci di interagire con i loro effettori a valle. Le proteine della famiglia Rho partecipano alla regolazione del meccanismo di traslocazione delle vescicole del pathway esocitico, attraverso la modulazione dello stato di polimerizzazione del citoscheletro di actina. RhoA media la formazione delle fibre da stress, Rac quella dei lamellipodi e Cdc42 quella dei filopodi (Fig. 5). RhoA attiva il suo effettore a valle Rho Chinasi (ROCK), che, se overespressa, stimola la formazione delle fibre da stress (Maekawa et al., 1999). Fig. 5 Le proteine della famiglia Rho e la loro azione nella regolazione del citoscheletro di actina. Rho chinasi attiva la proteina LIMK (LIM-chinasi) la quale, mediante fosforilazione, determina l inattivazione di Cofilin, coinvolta nella regolazione del citoscheletro di actina. LIMK, fosforilando Cofilin in Ser-3, ne inibisce così l attività, inducendo un aumento del processo di - 14 -
polimerizzazione del citoscheletro di actina. La fosforilazione stabilizza il citoscheletro di actina, stimolando la formazione delle caratteristiche protrusioni di membrana; la riattivazione di Cofilin è determinata dalla defosforilazione ad opera delle proteine fosfatasi SSH (slingshot) (Endo et al., 2003). proteine: L attività delle proteine G monomeriche è controllata da diverse GEP (GDP/GTP exchange protein), che determina la stabilizzazione della forma attiva delle Rho, legate al GTP; GAP (GTPase activating protein), che induce l idrolisi del GTP legato alle proteine della famiglia Rho, favorendo l inattivazione delle proteine; GDI (GDP dissociation inhibitor), che inibisce la dissociazione del GDP. Quando le proteine G monomeriche vengono attivate dal legame con il GTP, esse traslocano dal citosol verso frazioni di membrana, dove interagiscono con altri target molecolari coinvolti nella regolazione del citoscheletro di actina. Quando la vasopressina lega il suo recettore V2 sulla membrana basolaterale, l incremento di AMPc stimola l attivazione della PKA; quest ultima fosforila diversi substrati fra cui la stessa RhoA, in corrispondenza della Ser-188. - 15 -