1133 pag.1348: 1134 pag.1348: 1136 pag.1351: 1137 pag.1354: 1140 pag.1356:

Argomenti trattati in: Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts, Watson BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA III edizione italiana Zanichelli Le proprietà delle cellule del sangue possono essere preparate sul: Capitolo 22: Cellule differenziate e mantenimento dello stato differenziato in tessuti 1133 pag.1348: 1134 pag.1348: 1136 pag.1351: 1137 pag.1354: 1140 pag.1356: Rinnovamento mediante cellule staminali multipotenti: formazione delle cellule ematiche. Ci sono tre categorie principali di globuli bianchi La produzione di ciascun tipo di cellula ematica nel midollo osseo è controllata in modo indipendente. La cellula staminale pluripotente da origine a tutti i tipi di cellule ematiche. L eritropoiesi dipende dall ormone eritropoietina. Le principali proprietà del sistema immunitario possono essere studiate nel: Capitolo 23: Il sistema immunitario 1167 pag.1392: Il sistema immunitario funziona in base ad eventi di selezione clonale (escluso 3 periodo, commento della figura 23.6) 1173 pag.1400: Le caratteristiche funzionali degli anticorpi 1174 pag.1400: I recettori specifici per l antigene presenti sulle cellule B sono molecole anticorpali. 1176 pag.1401: Gli anticorpi sono dotati di due siti di legame per l antigene identici. 1177 pag.1402: Una molecola anticorpale è composta da due identiche catene leggere e da due identiche catene pesanti. 1178 pag.1404: Esistono 5 classi di catene pesanti : solo il commento alla figura 23.20 1186 pag.1414: Le catene leggere e pesanti si ripiegano in domini proteici simili e ripetuti (esclusa la figura 23.33) 1187 pag.1415: Studi di diffrazione ai raggi X hanno rivelato la struttura tridimensionale dei domini delle Ig Dettagliare la disposizione dei filamenti β nella figura 23.34 1195 pag.1424: Una volta stimolata da un antigene, una cellula B passa 1198 pag.1427: I recettori per le cellule T e loro sottoclassi 1200 pag.1428: Risposte diverse delle cellule T vengono mediate da classi diverse di cellule T. 1202 pag.1429: Le molecole MHC e la esposizione dell antigene alle cellule T. 1203 pag.1430: Esistono due classi principali di MHC 1204 pag.1431: Studi di diffrazione dei raggi X mettono in evidenza il sito di legame per l antigene delle proteine MHC 1205 pag.1433: Le molecole MHC I e MHC II possiedono funzioni differenti. 1208 pag.1436: Cellule T citotossiche. 1210 pag.1437: I trasportatori ABC codificati dall MHC trasferiscono i frammenti peptidici dal citosol al lume dell ER. 1211 pag.1438: Le cellule T citotossiche inducono le cellule bersaglio infettate a suicidarsi. Solo cenni dal 1213 al 1221. In pratica solo commento della figura 23.57 265

Citochine e loro recettori Possiamo riferirci alla seguente definizione di citochina: Con citochina si intende una proteina di secrezione, con funzione REGOLATORIA, che controlla la SOPRAVVIVENZA, la CRESCITA e la DIFFERENZIAZIONE di cellule. Citiamo alcune proteine, delle quali ci siamo già occupati, che sono citochine: PDGF - EGF - IL1 - Interferone - Eritropoietina Occorre distinguere tra gli ormoni classici, e le citochine. Infatti l ormone (per esempio l insulina) è prodotto da un determinato organo (cellula β del pancreas, nel caso dell insulina), è riversato nel circolo sanguigno ed influenza il metabolismo di molte cellule, disposte anche in siti distanti. Invece la citochina, p. e. PDGF, è prodotta da alcuni tipi di cellule, ha delimitati target cellulari e, di norma, non è presente in circolo. Possiamo riassumere nella tabella seguente le differenze più marcate: Proprietà ormone citochina Siti di produzione limitati molti Target cellulari molti pochi Ruolo biologico Ridondanza (esistenza di più specie molecolari con risposte simili, per esempio le interleuchine) Pleiotropia (varietà di risposte da organi diversi) omeostasi no Lotta alle infezioni, Riparo tissutale Presenza in circolo si no no Induttori variazioni fisiologiche insulti esterni E nota la struttura di più di 100 citochine e dei loro recettori; alcune agiscono sul sistema immunoemopoietico, altre su tessuti ed organi. Viene qui di seguito presentata una classificazione delle citochine, associate ai rispettivi recettori. Caratteristiche comuni delle citochine: 1) Sono molecole che si trovano nel mezzo extra-cellulare, ed interagiscono con specifici recettori su cellule terget. 2) Servono per comunicare informazioni sullo stato dell organismo. 3) Provocano una risposta biologica appropriata nel tessuto target, connessa a: sopravvivenza, crescita (e proliferazione), differenziazione cellulare (come specificato all inizio del presente paragrafo). si si 266

Le citochine presentano una molteplicità di funzioni. Tra esse si evidenzia la funzione di SENSORI BIOLOGICI DELLE CONDIZIONI DELL ORGANISMO. Infatti esistono citochine che sono: Sensori di po 2 per la produzione di RBC [per esempio alcuni organi -sostanzialmente il renein carenza di ossigeno, producono la citochina eritropoietina (EPO), che determina la produzione di globuli rossi (eritropoiesi) da parte del midollo osseo]. Sensori (molecole prodotte in risposta) di microorganismi, o prodotti da essi derivati, per la proliferazione di leucociti (B e T). Per esempio, un infezione batterica porta alla formazione del lipopolisaccaride o saccaride (LPS, vedi pag.175), derivante dalle membrane batteriche, che attiva i macrofagi a produrre GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor). I macrofagi producono anche Interleuchina-1, che attiva le cellule T, che a loro volta producono Interleuchina- 2, che stimola ulteriormente la proliferazione delle stesse cellule T. Anche le cellule T producono GM-CSF. Quest importante citochina può essere prodotta anche da cellule endoteliali (sempre per stimolo di LPS), o da fibroblasti. Quindi il GM-CSF può essere prodotto da almeno 4 sorgenti differenti (vedi tabella della pagina precedente, 1 a riga) Proprietà più rilevante: GM-CSF stimola la proliferazione di granulociti neutrofili ed eosinofili, che accompagna, di norma, un infezione. IL-1 (vedi pag.274) inibisce la crescita di cellule endoteliali; TNF stimola Sensori (avvertono cioè la presenza) di microorganismi, o prodotti da essi derivati, per la chemiotassi. Per esempio, alcuni tipi di cellule avvertono la presenza di prodotti di degradazione di batteri producendo chemiochine (una di esse è IL8), che a loro volta richiamano neutrofili verso il sito di produzione della chemiochina (chemiotassi). Sensori di reazioni immunitarie (è inserito nell insieme di reazioni che portano alla risposta immunitaria). Sensori di danno tissutale. Quindi le citochine generano una grande varietà di attività biologiche. Riprendendo quanto riportato nella tabella di pag.266, le citochine sono caratterizzate da: ridondanza: la stessa risposta cellulare può essere mediata da più di una citochina (si tratta di un meccanismo di salvataggio per assicurare la risposta). 267

pleiotropia: le citochine possono agire su diversificati organi target. Proprio a causa della pleiotropia, si rende necessaria la: compartimentazione delle citochine, caratterizzata dalle seguenti proprietà: I produttori di citochine sono cellule situate nelle immediate vicinanze dei loro targets (paracrinia); Inoltre esiste la capacità autocrina: per esempio, le cellule T attivate producono IL2 che promuove la proliferazione di altre cellule T (vedi figura di pag.267); Le cellule responsive rimuovono le citochine mediante il fenomeno della endocitosi mediata da recettori; La rimozione può anche avvenire in circolo, essendo presenti nel siero dei recettori solubili, dotati di azione tampone. Classificazione strutturale delle citochine Si accenna solo brevemente alle proprietà strutturali delle citochine, anticipando che vengono di fatto studiate tenendo presente i recettori ai quali si legano (vedi dopo). Una citochina appartiene ad uno dei seguenti 4 gruppi (o superfamiglie): GRUPPO 1: con un fascio di 4 α-eliche antiparallele, distinto in due sottogruppi: SC-4α (4 α-eliche Short Chain; vedi struttura pagina seguente); per esempio il GM-CSF (vedi funzione pagina precedente). LC-4α (4 α-eliche Long Chain; vedi struttura pagina seguente), per esempio il G-CSF (Granulocyte -Colony Stimulating Factor). GRUPPO 2: struttura a fogli-β a lunga catena Questo gruppo si divide in 3 sottogruppi: cystine knot ( nodo di cistina, vedi struttura pagina seguente). Esempio: il TGF-β, che inizialmente fu scoperto come fattore che induce trasformazione a tumore in cellule in vitro). β-jellyroll (letteramente: anello gelatinoso; vedi struttura pagina seguente). Esempio: TNF, Tumor Necrosis Factor, già visto a pag.50). β-trefoil. Trifoglio-β, perché la citochina (IL1β- vedi pag.49) si aggrega a formare una struttura trimerica (nella pagina seguente è indicato un monomero). GRUPPO 3: citochine a corta catena α/β Si divide pure esso in 3 sottogruppi: Chemiochine, che attivano cioè la chemiotassi, per esempio IL-8 (vedi struttura pagina seguente). Coesistenza di struttura-β ed una α-elica (al C-terminale). Meandro-β, per esempio TGF-α ed EGF (vedi struttura pagina seguente). Tale struttura era già stata citata a pag.1). Tipo insulina (vedi struttura pagina seguente). L insulina è in realtà un ormone, e quindi in questa sede non fa testo; tuttavia l IGF-1, che appartiene a questa famiglia, è una citochina con struttura simile a quella dell insulina. GRUPPO 4: citochine con struttura a mosaico E suddivisibile in 3 sottogruppi (non riportati nella figura di questa pagina). Per semplicità, citiamo solo l HGF (Hepatocyte Grow Factor). Si parla di struttura a mosaico perché le citochine appartenenti a questa famiglia risultano dalla riunione di più moduli. Per esempio l HGF contiene 4 moduli di tipo Kringle - (vedi struttura modulo di tipo plug-in pag.2), che sono presenti anche nel plasminogeno (si era già parlato del TPA, vedi pag.55). 268

SC-4α BUNDLE (GM-CSF) LC-4α BUNDLE (G-CSF) GRUPPO 1 GRUPPO 1 β-trefoil (IL-1β) CYSTINE KNOT (TGF-β) GRUPPO 2 GRUPPO 2 β-jellyroll (TNF-α) CHEMOKINES (IL-8) β-meander (TGF-α) INSULIN (IGF-1) GRUPPO 3 GRUPPO 3 269

Classificazione dei recettori di citochine Alcuni di questi recettori sono stati già trattati. Qui di seguito si parla nuovamente delle risposte generate da citochine, ma queste (qui di seguito) sono già inquadrate in insiemi (di citochine) che si legano a recettori con proprietà comuni. Con questa importante premessa analizziamo ora le principali proprietà biologiche di alcune citochine. Saranno ripartite secondo i gruppi della precedente classificazione, quando è possibile.. Iniziamo dai due sottogruppi del gruppo 1 (vedi pag.268): Cenni alle proprietà biologiche delle citochine del sottogruppo SC-4α Le IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 inducono risposte assimilabili e si legano ad una comune classe di recettori, detta Recettore del tipo Emopoietina/Interferone (vedi pag.271) IL-2 (vedi pag.267) è una glicoproteina secreta da linfociti-t attivati, che stimola, a sua volta, la proliferazione degli stessi T (effetto autrocrino). IL-4, secreta da linfociti T, induce l isotype switching, determina cioè la produzione di varie classi di Ig (IgG, IgA, IgE) derivanti da IgM iniziali, da parte di cellule T-Helper. IL-7, stimola la proliferazione di cellule pre-b e pro-b, senza influenzarne la differenziazione. IL-9, stimola la proliferazione di un certo numero di cellule T-helper. IL-13, controlla l attività dei macrofagi, riduce la produzione di citochine infiammatorie in risposta all IFN-γ o al lipopolisaccaride batterico (LPS). L argomento delle proprietà biologiche delle interleuchine è vastissimo, ed in questa sede ne sono state citate solo alcune proprietà. Questi recettori tipo Emopoietina/Interferone legano anche GM-CSF (vedi pag.267 per le modalità di produzione di GM-CSF). Infine citiamo il legame agli interferoni. Quest importante classe di citochine è stata introdotta a pag.259. Gli interferoni sono citochine, ad attività antivirale non-specifica, prodotte da cellule superiori. Conferiscono a molte cellule proprietà antiproliferative e immunomodulanti. Gli interferoni sono sintetizzati da cellule infettate da virus, e queste citochine conferiscono ad altre cellule una certa resistenza all infezione da virus (inibendo la replicazione del DNA virale). Gli interferoni possiedono anche capacità antiproliferative e citostatiche o citotossiche per un certo numero di cellule tumorali, per cui hanno trovato impiego nella terapia dei tumori. Gli interferoni sono sostanzialmente 3: IFN-α, IFN-β, IFN-γ. Di questi 3, solo IFN-γ fa parte delle citochine di questo sottogruppo. IFN-γ ha proprietà antivirali e antiparassitarie, con capacità più pronunciate degli altri interferoni. Rispetto agli altri due, IFN-γ ha più pronunciate attività immunomodulatorie, mentre gli altri sono più antivirali. Nelle cellule T-helper, l IFN-γ è prodotto per stimolazione da IL-2. Cenni alle proprietà biologiche delle citochine del sottogruppo LC-4α L interleuchina-6 (IL-6) umana è attiva in scimmie, ratti e topi. Produce una pletora di risposte. E uno dei maggiori mediatori fisiologici dell infiammazione. IL-6, in combinazione con glucocorticoidi, induce la sintesi di metallotioneine ed incrementa i livelli endocellulari di zinco, contrastando l epatotossicità del tetracloruro di carbonio. E un fattore neurotrofico, in quanto promuove la sopravvivenza in coltura dei neuroni colinergici. L eritropoietina (EPO) è già stata introdotta a pag.237. Ricordiamo che EPO è prodotta da molte cellule in condizioni di ipossia. E quindi recepita dalle cellule del midollo osseo, dove induce la proliferazione dei globuli rossi. Vedi pag.1438 Alberts. Soprattutto le cellule T stimolate producono γ-interferone, che induce, nelle cellule infettate, sintesi MHC I e II, proteosoma, trasportatore ABC. 270

L ormone della crescita (GH-growth hormone). E un ormone prodotto dall adenoipofisi. Promuove la crescita dell osso, della cartilagine e del tessuto molle. La sua produzione declina dopo i 30 anni di età, ed è inibita da somatostatina. L interferone α e β appartengono a questo sottogruppo LC-4α. Si conoscono almeno 23 varianti del solo interferone α. E un potente antivirale. Ha applicazioni terapeutiche in alcuni casi di tumore. Abbiamo già visto il meccanismo di azione a pag.258: arruolamento da parte del recettore delle JAK, quindi delle STAT con conseguente attivazione, sul DNA, di ISRE (Interferon-α- Stimulated Response Elements). RECETTORI DEL TIPO: EMOPOIETINA/INTERFERONE Questi recettori sono comunemente denominati del tipo Emopoietina/interferone. Illustriamo la struttura di 2 recettori (per IL-2 e GH, ed EPO) tipici di questo gruppo: Recettore per l interleuchina 2-4-7, GH ed EPO Partendo dall N-terminale (extracellulare) presenta: SD 100 Sub-Dominio tipo Hemopoietina di 100 amminoacidi ciascuno (SD 100) SD 100 Un esempio importante ci è offerto dall Ormone della Crescita umano e dal suo recettore (GH e GHR): qui sotto è illustrato tale recettore GHR che lega il GH (quest ultimo è riportato con tratto più scuro, e si può verificare che ha una struttura LC-4α, vedi pag.269). Il recettore è formato da due molecole, ciascuna contenente 2 domini SD 100, che formano una specie di barile di 7 tratti β, che sono riconducibili ai moduli di Fibronettina di tipo III (vedi pag.67) 271

Possiamo citare, ancora, la struttura del recettore per l interleuchina 2, che è formata da 3 subunità, α, β,γ. In particolare la β, nella zona citoplasmatica, presenta una regione acida, che interagisce con tirosin-cinasi del tipo Src e nella zona extra-citoplasmatica contiene 2 domini SD 100. Inoltre la zona citoplasmatica della subunità γ presenta un dominio SH2. Le modalità di trasmissione del segnale sono ancora da definire. Il recettore per l ormone della crescita (GH-R), è stato studiato in dettaglio (è assai simile a quello per la prolattina). A lato è riportato il complesso formato da 2 monomeri di recettore, con 1 molecola di ormone (che sta al centro). Il legame di hgh (h=human) al GH-R porta alla dimerizzazione del recettore, e all arruolamento di JAK2. Interessante è il meccanismo d inibizione da eccesso di ormone. Infatti alzando la concentrazione di h-gh si ha inattivazione del recettore per monomerizzazione dello stesso. Questo interessante fenomeno è stato spiegato dalla presenza di 2 siti distinti sulla molecola di ormone: sito 1 e sito 2, che si legano però al medesimo sito sul recettore. Solo una certa concentrazione (bassa) di ormone consente la formazione ideale del complesso ternario attivo (1 molecola di ormone e 2 di recettore). Con la concentrazione di h-gh che sale, più molecole di h-gh sono disponibili per il legame al recettore, per cui compaiono complessi 1 h-gh/ 1 recettore, annullando la struttura dimerica -attiva!- del recettore. Qui a lato è illustrato questo processo di monomerizzazione del recettore da eccesso di ormone. Prendiamo in considerazione la struttura generale del recettore per G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factorstruttura pag.270). 272

Recettore per G-CSF Partendo dall N-terminale (extracellulare) presenta: Dominio tipo immunoglobulina (uno solo) Sub-Domini tipo Hemopoietina di 100 amminoacidi ciascuno (2 domini SD 100, del tipo già illustrato per GHR) Sub-Domini Fibronettina di tipo-iii G-CSF stimola la proliferazione e la differenziazione di cellule progenitrici ematopoietiche verso la linea neutrofili-granulociti Si può immediatamente constatare che si ripresentano domini (o muduli) già individuati in molte altre strutture. Per i domini tipo Immunoglobulina e Fibronettina (vedi pagg.1-2 e 67). Proseguiamo ora nel tentativo di classificazione dei recettori di citochine. Si può notare che esiste una buona corrispondenza tra alcuni gruppi di citochine ed la comune classe di recettore. Esistono, tuttavia, alcune eccezioni. Nel complesso possiamo dire che le citochine del gruppo 1 (SC-4α e LC-4α) si legano a recettori del tipo emopoietina-interferone. Vediamo ora gli altri gruppi di recettori. RECETTORI DELLE INTERLEUCHINE di tipo 1 La denominazione Interleuchina deriva da molecola d interazione tra leucociti. In realtà riguarda interazioni tra tanti tipi cellulari oltre, naturalmente, i leucociti. I recettori per le importanti Interleuchine-1 (IL-1) sono marcatamente diversi da altri recettori, per cui sono trattati a parte. Vediamo prima le proprietà principali delle interleuchine di tipo 1. Sono note 2 forme di interleuchina 1: la α e la β. Sono fattori più o meno equivalenti, ridondanti, pleiotropici. (IL-1 α = 153 AA; IL-1β = 159 AA). La forma umana predominante è la β, mentre nel topo è la α. Curiosamente l omologia di sequenza è alquanto bassa: solo 27 %, e si ritrova solo al C-terminale. Perciò la denominazione fa intendere una similitudine di struttura che in realtà è assai modesta. Sono infatti codificate da 2 geni distinti. Queste due interleuchine sono trattate insieme perché assai simile è la risposta biologica da esse generata. Ambedue si legano infatti allo stesso recettore. Vediamo ora solo le proprietà dell IL-1β, più importante per l uomo. Se ne era già parlato a proposito delle caspasi (vedi pag.47). Infatti l Interleukin- Converting Enzime (ICE) è la caspasi-1. Si tratta di un enzima proteolitico che processa il precursore di IL-1β, eseguendo una scissione proteolitica in corrispondenza dell acido aspartico (D) (le Caspasi sono fondamentali nel processo apoptotico). 273

Vista che le risposte all IL-1α e all IL-1β sono analoghe, d ora in poi, per semplicità, parleremo solo di IL-1. Cenni all attività biologica dell IL-1 Vediamo di richiamare prima proprietà già menzionate. La più importante proprietà di IL-1 è di stimolare le cellule T-helper a produrre IL-2 (vedi pag.269), unitamente ai recettori sensibili a IL-2 (processo autocrino). IL-1 stimola la proliferazione delle cellule B, inducendole a produrre immunoglobuline. IL-1 inibisce la crescita di cellule endoteliali in vivo ed in vitro. Inibisce anche la crescita di epatociti di ratto in coltura. IL-1 determina molte alterazioni delle funzioni endoteliali in vivo promuove processi trombotici attenua meccanismi anticoagulanti IL-1 promuove l adesione di neutrofili, monociti, cellule T e B innalzando l espressione di molecole di adesione come le CAM (vedi pagg.73-74). IL-1, insieme ad altre citochine, è un importante mediatore di reazioni infiammatorie. Aumenta il metabolismo dell acido arachidonico, con produzione, p.es., di prostaglandina-2 (attenzione: PGI-2 è una prostaglandina, cioè una molecola non-proteica, e quindi non va confusa con le citochine, che sono tutte proteine). IL-1, attiva la produzione dell attivatore tissutale del plasminogeno (TPA, vedi pag.55). IL-1 è anche un potente chemio-attraente per i leucociti. L iniezione in vivo di IL-1 porta all accumulo di neutrofili al sito di iniezione. Inoltre IL-1 ha una fortissima influenza sullo sviluppo degli osteociti e sul sistema nervoso centrale. Presenta importanti sinergie con altre citochine. Recettore per l interleuchina 1 Esiste il recettore di tipo I e di tipo II. Qui è riportata solo la struttura del recettore di tipo I, che sembra il più importante. L N-terminale è nella parte extra-cellulare, e contiene 3 domini tipo immunoglobulina [è quindi simile al PDGF-R, che ne contiene 5 (vedi pag.117)]. Il recettore per IL-1 è analogo al recettore Toll. Non è noto il meccanismo di trasmissione del messaggio. E stato tuttavia accertato che si ottengono due risposte: 1) legame di NF- κb (vedi pagg.256-257) al DNA. 2) aumento dell attività MAPcinasi. E interessante che la regione citoplasmatica del recettore di tipo I per IL-1 presenta omologia di sequenza con il recettore Toll per la proteina legante di Toll di Drosophila (vedi pag.257). Quindi il punto 1) [legame di NF- κb al DNA] trova un plausibile riferimento. 274

INSERTO: attivazione di NF- κb da parte di IL-1 e TNF [da Curr. Biol.8 (1) R19 (1998)] Alcuni disordini infiammatori, come l artrite reumatoide, l asma e alcune infiammazioni intestinali derivano da un attivazione aberrante di un programma genetico pro-infiammatorio. La infiammazione deriva principalmente da due citochine: TNF (Tumor Necrosis Factor) ed IL-1 (Interleuchina-1). Ovvero la produzione di queste due citochine caratterizzano lo stato proinfiammatorio, mentre lo stato infiammatorio è scatenato principalmente da esse (TNF ed IL-1). E stato dimostrato che anticorpi anti-tnf sono efficaci nella terapia dell artrite reumatoide e delle infiammazioni intestinali. E stato dimostrato che TNF ed IL-1 determinano in ultima analisi l attivazione di NF-κB, che è un particolare fattore di trascrizione già preso in considerazione (vedi pag.256). E stata anche riconosciuta un omologia di sequenza con il fattore di trascrizione Dorsal (dl) in Drosophila (vedi pag.257). NF-κB attivo (cioè le proteine p65/p50, privo di I-κB che viene degradato per ubiquitinazione) si lega ai promotori o agli enhancer di più di 50 geni che sono noti per essere attivati durante l infiammazione. Uno dei ruoli fisiologici di NF-κB è quello di indurre rapidamente l espressione di geni difensivi in risposta ad insulti di varia natura, come infezioni virali o batteriche, o stress fisiologici. Abbiamo già visto che NF-κB viene liberato in forma attiva in seguito a fosforilazione di I-κB, che è successivamente poliubiquitinato e quindi degradato per proteolisi ATP dipendente. Tale processo dipende da TNF e/o IL-1. Sino a pochi anni fa non erano ben conosciuti i processi che collegavano tali citochine ubicate in siti extracellulari con la fosforilazione di I-κB. Oggi questa connessione è stata quasi completamente decifrata. Infatti (vedi pag.267) non erano note le proteine umane omologhe di Tub e Pelle. La via che da TNF porta al complesso inattivo NF-κB (che comprende cioè anche I-κB) è diversa da quella che collega IL-1 a tale complesso. Si tratta di due vie distinte, convergenti tuttavia verso elementi comuni. Infatti tutte e due le vie convergono su NIK (NF-κB Inducing Kinase), che è una proteina cinasi appartenente alla classe delle MAPKKK. Analizziamo prima la via caratteristica per TNF (vedi figura pagina seguente). A tal fine è utile far riferimento al paragrafo delle caspasi (vedi pagg.49-50). Si era già detto che TNF si lega al recettore per TNF. In particolare è coinvolto un particolare recettore, il TNFR1 che, nella porzione citoplasmatica, contiene i domini DD (Death Domain). L aggregazione di 3 molecole di TNFR1 crea la concentrazione di domini DD, che, a loro volta, arruolano (richiamano) almeno 3 altre proteine: TRADD (TNFR, Associated Death Domain), che possiede essa stessa dei domini DD che si associano ai domini DD di TNFR1. Potremmo chiamare tali interazioni di tipo omotipico, anche se tale terminologia potrebbe essere confusa con omofilico, che caratterizza le interazioni cellulacellula, che sono mediate generalmente da CAM. TRAF2 (TNFR, Associated Factor 2); interagisce con la porzione N-terminale di TRADD. RIP (Receprot Interacting Protein), che reagisce con i propri domini DD con i domini DD di TRADD. Tra queste proteine, solo RIP possiede attività enzimatica: infatti all N-terminale presenta il classico dominio cinasico. Trattasi si una Ser/Thr cinasi. Non sembra, tuttavia, che tale attività cinasica sia implicata nell induzione di NF-κB. TRAF2 è membro di una nuova famiglia di molecole segnale che sono caratterizzate dalla presenza di una dominio (di 230 AA circa) conservato alla porzione C-terminale, che è denominato Dominio TRAFF. All N-terminale tali molecole presentano zinc-finger multipli. I domini TRAF mediano interazioni omotipiche ed eterotipiche. Sino ad oggi sono state identificate 6 proteine appartenenti alla famiglia delle proteine TRAFF. 275

Analizziamo ora la via caratteristica per IL-1. La IL-1 determina aggregazione del recettore IL- 1R. La completa attivazione richiede la partecipazione di una proteina accessoria transmembrana, la ACP (ACcessory membrane spanning Protein). Il complesso IL-1R/ACP richiama su di se altre due proteine: TRAF6, che appartiene alla famiglia delle proteina TRAF; IRAK (IL-1R Activated Kinase) (per TNF è arruolata un altra proteina cinasi, la RIP). Quindi TRAF2/RIP caratterizza la risposta a TNF, mentre TRAF6/IRAK caratterizza la risposta ad IL-1. Poichè queste proteine sono diverse e la fosforilazione di I-κB è identica, occorre che intervenga un altro elemento. Infatti esiste: NIK (NF-κB Inducing Kinase), che è una proteina cinasi appartenente alla classe delle MAPKKK, che è stata identifata mediante uno screening in lievito per la ricerca delle proteine che legano TRAF2. E stato visto che NIK lega anche TRAF6, e quindi è un plausibile candidato a fare da anello di congiunzione tra le due vie attivate, rispettivamente, da TNF ed IL- 1.Ma NIK da sola non fosforila I-κB. L ultimo anello della catena, che consente la fosforilazione di I-κB, è stato identificato nelle proteine: IKK -α ed IKK-β (I-κB Kinase). Sia IKK -α che IKK-β sono in grado di fosforilare I-κB. Per prima fu scoperta IKK-α, che contiene motivi tipici dei fattori di trascrizione, ovvero un dominio di tipo HLH, ma la sua funzione era ignota, sino a quando fu dimostrato che fosforila specificamente le serine note di I-κB. Dopo l identificazione di IKK -α fu scoperta anche IKK-β, che presenta più del 50% di omologia di sequenza con IKK -α. Quindi esiste un complesso eterotrimerico NIK / IKK -α / IKK-β formato da 3 proteine cinasi, una delle quali, la NIK, che in apparenza non presenta specifici substrati. Le due proteine IKK sono quindi specifiche del processo pre-infiammatorio e la messa a punto di farmaci che blocchino la loro attività risulterebbe ricca di prospettive per una terapia antinfiammatoria mirata. 276

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RECETTORI DEL GRUPPO: NGF / TNF Questi recettori hanno ricevuto una soddisfacente delucidazione solo in tempi recenti. Riferiamoci alle corrispondenti citochine del gruppo 2 (vedi pag.269). Iniziamo con: TGF (Trasforming Growth Factor). Esistono due TGF: α e β; questi inducono la trasformazione a tumore in cellule in vitro. Tali fattori di crescita furono inizialmente identificati come proteine secrete da cellule di topo trasformate da virus, che inducevano un fenotipo trasformato reversibile in fibroblasti non-neoplastici. Infatti tali fibroblasti (esposti al TGF) non presentavano più la inibizione da contatto. Il TGF-β (una citochina del gruppo 2 -vedi pag.268- con cystine knot vedi struttura pag.269) si lega ad una classe di recettori caratterizzata da attività intracellulare di tipo Serin/Treonin cinasico CHE NON APPARTIENE ALLA CLASSE DEI RECETTORI NGF/TNF. Li prenderemo in considerazione successivamente, tra i recettori con attività cinasica. Invece il recettore per TNF (Tumor Necrosis Factor) appartiene a questo gruppo di recettori (detti di tipo NGF/TNF) non è dotato d attività cinasica, e svolge un ruolo fondamentale nel processo di apoptosi cellulare. Questo argomento è già stato trattato a pag.50 e, in modo particolareggiato, nell inserto di pag.275-276. Il TNF, di per sé, è una citochina (nonché fattore di crescita), appartenente al gruppo 2 delle citochine, vedi pag.269). Analizziamo ora la famiglia dei fattori tipo Nerve Growth Factor (NGF), detta anche delle Neurotrofine. Sono note 4 proteine appartenenti a questa famiglia: l NGF (vedi dopo), il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), la nurotrofina-3 (NT-3) e la neurotrofina-4 (NT-4). Parliamo ora in dettaglio dell NGF, Nerve Growth Factor (NGF) Il sistema nervoso periferico comprende 3 tipi di neuroni: neuroni sensitivi afferenti neuroni motori efferenti neuroni del SN autonomo simpatici parasimpatici I neuroni sensitivi ed alcuni neuroni simpatici sono organizzati in GANGLI PARAVERTEBRALI. Grazie alla loro accessibilità, questi gangli sono stato oggetto di studio, per cercare di comprendere come le fibre nervose dei due tipi prendano contatto con i loro organi target. Negli anni 40 Victor Hamburger studiò l innervazione con embrioni di pollo, da parte delle fibre sensoriali e simpatiche, di abbozzi di arti trapiantati in embrioni in stadi precoci dello sviluppo. Nel 1948 Bueker modificò l approccio sperimentale precedente, che aveva dato risposte condradditorie, rimpiazzando un abbozzo di arto di un embrione di pollo con 3 tipi di tumori di mammifero. Un sarcoma di topo (180) diede risultati interessanti: crebbe e fu invaso da fibre provenienti dai gangli sensibili adiacenti. I gangli stessi erano più grandi (del 33%) rispetto a quelli normali. Fu inizialmente concluso (erroneamente) che il tumore fosse un campo più favorevole all innervazione per la sua rapidità di crescita. In realtà il gruppo di lavoro di Rita Levi Montalcini riesaminò criticamente tale conclusione. Ella trovò infatti che i gangli sensitivi e quelli simpatici erano aumentati di ben 6 volte di volume, e che gli embrioni erano invasi da fibre simpatiche che addirittura ostruivano il flusso del sangue molto prima che gli embrioni di controllo mostrassero fibre. Si pensò (e tale ipotesi si dimostrò corretta) che il tumore rilasciasse un fattore X responsabile del fenomeno. Ciò fu dimostrato in un esperimento nel quale il sarcoma 180 fu impiantato fuori dall embrione in modo tale che il torrente sanguigno fosse il medesimo (nelle membrane respiratorie). Si ottenne lo stesso risultato di prima. In seguito, anche su gangli simpatici (provenienti da embrioni di pollo in coltura) si osservò un alone di fibre nervose in presenza del sarcoma 180. 278

Stanley Cohen cercò di isolare il fattore e i suoi studi furono favoriti dal caso. Infatti per comprendere la natura del fattore X, si usava trattare il componente incognito con veleno di serpente, che contiene una elevata concentrazione di enzima fosfodiesterasi che degrada gli acidi nucleici. Ovvero, se per trattamento con veleno di serpente si aveva scomparsa delle proprietà osservate del fattore X, si poteva concludere che il fattore X era un acido nucleico. Per verificarne, invece, la natura proteica, si trattava con un enzima proteolitico, per esempio tripsina: se sparivano le capacità del fattore X si poteva ragionevolmente concludere che tale fattore era una proteina. Con tripsina effettivamente sparivano le capacità di stimolatore della crescita dei nervi del Fattore X (che pertanto fu considerato di natura proteica, come si dimostrò con mezzi più raffinati con esperienze successive). Il trattamento con veleno di serpente riservò invece una sorpresa: anziché scomparire, la capacità di indurre la crescita delle fibre nervose nel ganglio di pollo aumentava in maniera drammatica. Cohen riuscì però a indurre questo vistoso fenomeno anche in assenza di tumore, per azione del solo veleno di serpente. In realtà il veleno di serpente era una sorgente ricchissima di fattore-x (oltre che di fosfodiesterasi), e quindi da solo poteva indurre la crescita dei nervi. Cohen purificò pertanto il fattore X (denominato Nerve Growth Factor-NGF) direttamente dal veleno di serpente. In seguito si dimostrò che dalle ghiandole salivari dei roditori (soprattutto maschi) si può ottenere NGF, 10.000 volte più attivo del sarcoma 180 e 10 volte più attivo del veleno di serpente. Qui sotto è riportata la struttura dell hngf (h=human), insieme ad altre neurotrofine. L NGF è formato da 120 amminoacidi. E riportata anche la struttura terziaria, e si può facilmente riscontrare che l NGF appartiene (come il TNF) alla struttura tipo β-jellyroll (letteralmente: anello gelatinoso; struttura vedi 269). 279

Cellule bersaglio dell NGF Anche in fasi diverse del loro sviluppo, le cellule che rispondono all NGF sono: -cellule simpatiche durante tutta la vita dell animale. -cellule dei gangli sensitivi } solo nel periodo embrionale -cellule cromoaffini Poiché tutte queste cellule originano delle creste neurali, si può ipotizzare che lo spettro di cellule potenzialmente rispondenti a questo fattore sia più ampio. La suscettibilità all azione dell NGF potrebbe essere inversamente proporzionale al grado di differenziazione. Proprietà importante per lo studio della coltivazione di tessuti nervosi: si è scoperto che l NGF è essenziale per la sopravvivenza dei neuroni simpatici in coltura. Dopo 24 ore di coltura, i neuroni dei gangli vanno incontro a massiva degenerazione (mentre fibroblasti e cellule gliali sopravvivono), a meno che non siano aggiunte anche piccole quantità di NGF, che consente a tali neuroni di sopravvivere anche per un periodo indefinito. L NGF esercita tre tipi di azioni: TROFICA - TROPICA (neurotropismo mediato da NGF) - DIFFERENZIANTE TROFICA: le cellule simpatiche in vivo ed in vitro hanno assoluta necessità di NGF per la loro sopravvivenza e crescita dei neuriti. TROPICA: si è visto che le fibre nervose crescono dirigendosi verso la sorgente di NGF, seguendone il gradiente di concentrazione. DIFFERENZIANTE: l NGF induce la differenziazione a cellula nervosa di feocromocitoma normali e di feocromocitomi di cellule simpatico-simili. Recettore del Gruppo per TNF e per NGF dominio a 6 cisteine dominio citoplasmatico apoptotico (DD = Death Domain, vedi pag.50) Recettore per TNF (tipo I) Recettore per NGF p75 a bassa affinità 280

Sono stati identificati due tipi di recettore per NGF, che presentano una differente affinità per lo stesso. Low-affinity Receptor (Kd 10-8 10-9 ). Sono i recettori p75 L NGFR a bassa affinità. High-affinity Receptor (Kd 10-10 10-11 ). Questi sono i recettori: p140 trka ; p140 trkb p145 trk ad alta affinità. Il recettore p75 L NGFR a bassa affinità, dalla funzione non completamente caratterizzata, è una glicoproteina transmembrana da 75 kda, con 3,5 domini extracellulari ricchi di cisteine, ed uno intracellulare del titpo DD= Death Domain (vedi pag.50). I recettori p140 trka ; p140 trkb p145 trkc sono di tipo tirosin-cinasico, e ne riporteremo lo schema più avanti, nell ambito dei recettori con attività cinasica. Presentano analogia con il recettore per il PDGF, e possiedono l importante proprietà, come PDGFR ed altri, di avere attività tirosin cinasica (TRK) con autofosforilazione ed arruolamento di altre proteine tramite SH2. Per esempio trka attiva la PI3K e la fosfolipasi-c. Con tutta probabilità sono i recettori ad alta affinità (trk A -B-C) ad essere più importanti nella risposta all NGF. Infatti, cellule mancanti del recettore p75 L NGFR rispondono normalmente all NGF. Si ritiene che i recettori di tipo trk trasducano i segnali per sopravvivenza e differenziazione. Non è noto il ruolo del recettore p75 L NGFR a bassa affinità, ma si pensa che sia simile a quella dei recettori per il TNF (cioè apoptotico). Infatti si è osservato che l espressione di p75 L NGFR induce morte cellulare in neuroni, anche in assenza di NGF. TRK deriva da Tyrosin Receptor Kinase, cioè attività tirosin cinasica associata a recettori. Tuttavia tali recettori sono più comunemente contraddistinti con la sigla RTK. 281

RECETTORI CON ATTIVITA CINASICA Occupiamoci ora dei recettori che presentano accertata attività cinasica intrinseca. Perché intrinseca? Abbiamo visto che alcuni recettori non avevano attività cinasica intrinseca, bensì l acquisivano, come il recettore per l interferone α e β che chiamava a sé le Janus Kinase, che a loro volta fosforilavano (su tirosina) le STAT (vedi pag.258 e 272). Questa attività cinasica può essere diretta contro i residui di tirosina di altre proteine, ed in tal caso abbiamo recettori di tipo RTK (Receptor Tyrosine Kinase), che abbiamo già preso in considerazione (EGFR, PDGFR, InsulineR). Esiste poi un solo tipo di recettore con attività serin-cinasica (recettore per TGF-β). Come nei paragrafi precedenti, analizziamo le proprietà delle citochine specifiche per questo tipo di recettori, e vediamo contestualmente le caratteristiche dei relativi recettori. Ci renderemo conto che i vari sottogruppi di citochine si legano a recettori comuni, nell ambito del medesimo sottogruppo. Epidermal Growth Factor (EGF) Questa citochina appartiene al gruppo 3 delle citochine, β-meander (vedi pag.269). L EGF è un proteina di basso peso molecolare (PM = 6400) formata da 53 amminoacidi. Contiene 3 ponti disolfuro essenziali per l attività biologica. Degno di nota è il suo precursore, formato da ben 1207 AA, che genera l EGF biologicamente attivo per taglio proteolitico. Deve il suo nome alla sua proprietà di indurre lo sviluppo dei tessuti epiteliali negli animali ai quali è somministrato. In vitro è un forte mitogeno per molti tipi di cellule. Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) E già stato analizzato in dettaglio (vedi pag.117). Ora lo confrontiamo con altri recettori della famiglia RTK, che nella pagina seguente (311) sono illustrati in forma schematica. L EGFR è caratterizzato dal possedere: - 2 domini extra-cellulari cysteine rich; - 1 dominio tirosin-cinasico nella parte citoplasmatica. Occorre citare i proto-oncogeni correlati con EGFR. Sono erba ed erbb, trovati nel virus trasformante acuto dell eritroblastosi aviaria (vedi oncogeni pag.113). - c-erba codifica per un recettore che lega gli ormoni tiroidei. v-erba non lega tali ormoni. - c-erbb codifica per il normale EGFR, mentre v-erbb codifica per una forma aberrante del recettore, mancante di tutta la parte extra-cellulare che di norma legherebbe l EGF. Anche la parte citoplasmatica (C-terminale) è leggermente accorciata. Tale parte citoplasmatica contiene lo stesso dominio tirosin-cinasico di EGFR con attività cinasica sempre espressa, ovviamente senza che esista l attivazione da parte del ligando esterno. A tale attività non controllata è dovuta la capacità trasformante della proteina virale. I meccanismi di trasmissione dei messaggi da parte di EGFR sono stati già analizzati. Ricordiamo brevemente che è essenziale l autofosforilazione, che segue in genere la dimerizzazione del recettore stesso. Con l autofosforilazione si ha l arruolamento di varie proteine tramite i domini SH2 presenti su di esse, che si legano specificamente alle tirosine dei recettori, solo se tali residui sono fosforilati. Ricordiamo che anche il dominio PTB può consentire l arruolamento della proteina Shc (vedi pag.260). Inserto: NiceProt View of SWISS-PROT: P01133 (EGF human) Il precursore dell EGF è una glicoproteine transmembrana che contiene 8 9 moduli EGF. Per taglio proteolitico si ottengono ben 8 (9) molecole di EGF da una molecola di precursore. Tale modulo EGF (vedi modulo dominio G pag.1) è presente in moltissime proteine. 282

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Recettore per l insulina (Insulin-R) e per IGF Vediamo prima i possibili ligandi di questo recettore. Oltre alla nota insulina, è importante l Insulinlike Growth Factor (IGF), che si lega ad un recettore assai simile a quello dell insulina. L IGF è prodotto soprattutto dal fegato dove ha una funzione paracrina/autocrina. E tuttavia sintetizzato anche da altri tessuti. Esistono due IGF: IGF-I e IGF-II. Presentano una generica attività mitogena. Presentano anche attività differenziante; per esempio, trasformano dei fibroblasti in adipociti. Il recettore per insulina e per IGF sono assai simili, anche se distinti. Il recettore per l Insulina è già stato analizzato a pag.116. Tale recettore contiene 1 residuo ricco in cisteina per monomero di recettore. In realtà il recettore è un dimero, tenuto insieme da un legame disolfuro intercatena. Ogni recettore monomerico ha inoltre 2 domini tirosin-cinasici. PDGF e suo recettore (PDGFR) Proprietà del fattore di crescita PDGF: il fattore di crescita prodotto dalle cellule piastriniche (PDGF) è già stato descritto (vedi pag.110). Presenta una struttura a nodo di cistina (vedi pag.269) con due ponti disolfuro (vedi schema di questa pagina). Occorre ricordare che questo fattore di crescita è importante in quanto un tumore virale delle scimmie (Simian Sarcoma Virus - SSV) codifica per una proteina (p28 sis - Sis= simian sarcoma) che è omologa al PDGF. Questa scoperta fu storicamente importante, in quanto per la prima volta fu dimostrato che l alterazione di un fattore di crescita determina tumore. Il PDGF ha la caratteristica di legarsi a molte proteine plasmatiche ed anche a proteine della matrice extracellulare, facilitando la CONCENTRAZIONE LOCALE di tale citochina. E un agente proliferante. Il PDGF è coinvolto nella cicatrizzazione delle ferite. La biosintesi del PDGF è complessa. In breve il PDGF è la riunione (attraverso due ponti disolfuro) di due catene A oppure B. Esiste un PDGF-AA, un PDGF-BB ed un PDGF AB. Ciascuna delle tre forme si lega al PDGFR con affinità differente, generando attività biologiche differenti. La catena A è formata da 124 AA. La catena B è formata da 140 AA. Comunque le risposte biologiche, specifiche delle tre forme di PDGF, sono in gran parte sconoisciute. Il PDGF presenta anche capacità chemiotattiche (proprietà già vista per IL1 ed IL8, che sono denominate anche chemiochine; vedi pag.268). Proprietà del recettore per PDGF (PDGFR): trattasi di un recettore del tipo RTK (vedi pag.117). Esiste un recettore di tipo α ed uno di tipo β. Il recettore dimerizza, come altri recettori [vedi per esempio recettore per ormone della crescita (GH) pagg.271-272]. Possiamo confermare che la dimerizzazione del recettore sembra essere un meccanismo generale. Per questo recettore del PDGF vediamo alcuni riscontri molecolari. A pag.287 è riportata la sequenza completa del PDGFR-α e PDGFR-β. Partendo dall N-terminale sono indicati ( ) i siti di taglio da parte di peptidasi che rimuovono il peptide segnale. Trattasi di una modifica posttraduzionale. Dopo l AA 522 è contrassegnata la sequenza idrofobica (lo si può verificare direttamente) che caratterizza il tratto transmembrana del recettore. Quindi, con la doppia linea, è indicato il dominio tirosin-cinasico, che è ripartito in due tronconi. La Glicina 600 della catena α è la prima del Rossmann motiv, (G-X-G-X-X-G). Quindi, proseguendo, è possibile identificare i subdomini secondo la classificazione di Hans Quin Hunter. Si può identificare all 822 i residui RNV del subdominio VI, che caratterizzano l attività tirosin-cinasica [vedi discussione a pag.81; le serin cinasi presentano Glu (E) al posto di Arg (R)]. Si riconosce anche il subdominio VII (ansa che lega Mg++), con i residui invarianti DFG. 284

La sequenza APE del subdominio VIII è preceduta (9 residui prima) da S e T, possibili ma poco probabili siti di autofosforilazione (corrisponderebbe alla T-197 di PKA) visto che il recettore presenta attività tirosin-cinasica, e non serin/treonin cinasica. Il sito di autofosforilazione è probabilmente Y-857 di β, che non richiama domini SH2. Vediamo ora i siti Y di autofosforilazione, che arruolano varie proteine (c-src, PI3K, GAP, Syp e PLCγ1). E possibile verificare una corrispondenza con il PDGFR di pag.121. E identificabile una Y in posizione 573 di α e 581 di β. Tale Y e la prima Y della sequenza YIYV che lega c-src. In effetti esiste uno scarto di 2-3 AA, dovuto, molto probabilmente, al fatto che i recettori potrebbero essere di specie diverse. La sequenza YMDM è contrassegnata con (a circa metà dello spezzone che inizia con 702/709); esiste anche la sequenza YVPML (contrassegnata con *). Tali sequenze legano due domini SH2 della subunità 85 di PI3K. E possibile ritrovare anche le altre sequenze riportate a pag.117. Circa l eterogeinetà del recettore, si è visto che vari tessuti possiedono diverse combinazioni di PDGFR α o β. Per esempio cellule mesenchimali e cellule endoteliali del fegato presentano solo recettori di tipo α, mentre i neuroni possiedono solo il tipo β. Inoltre esistono varie combinazioni tra tipo di PDGF (A A, AB oppure BB) e recettore. Per esempio il PDGF BB reagisce solo con PDGFR ββ. 285

Colony Stimulating Factor-1 (CSF-1 o M-CSF) E una citochina appartenente al gruppo 1 SC-4α, come il GM-CSF (vedi pag.269). CSF-1 è denominato anche M-CSF. CSF-1 è sintetizzato da una varietà di cellule (fibroblasti, cellule endoteliali, osteoblasti, cheratinociti, astrociti, mioblasti e cellule epiteliali dell utero durante la gravidanza). E presente in circolo come glicoproteina. Presenta infatti la caratteristica di legare covalentemente un glucosamminoglicano, in particolare il condroitin-solfato. CSF-1 presenta, nei confronti delle cellule target, un generale effetto trofico. Può essere indotto nella progressione di malattie mielo-proliferative e in neoplasie alle ovaie, per cui livelli elevati di CSF-1 possono essere marker di tumore. Proprietà del recettore CSF-1R Il recettore per CSF-1 è codificato dal gene fms; somiglia molto al recettore per il PDGF. I geni che codificano questi due recettori sono contigui sul medesimo cromosoma umano e distano solo 800 paia di basi. Possiede (come il PDGFR) la tipica attività RTK. In generale ha una struttura simile a quella del PDGFR (vedi pag.283). A titolo di esempio, prendiamo in considerazione l importante azione stimolatoria di CSF-1 (detto anche M-CSF): Plasticità delle cellule progenitrici linfoidi B, che sotto stimolo di M-CSF su cellule arricchite in vitro del recettore per M-CSF (ovvero c-fms) evolvono a precursori dei macrofagi e quindi a macrofagi. Questa differenziazione è bloccata da IL-7 (vedi pag.270) che stimola, di norma, verso cellule B. Anche l introduzione di raf + myc genera lo stesso effetto di c-fms + M-CSF. Fibroblast Growth Factor (FGF) Proprietà delle citochine FGF: sono note, sino ad oggi, 9 citochine diverse appartenenti alla famiglia dei Fattori di Crescita dei Fibroblasti. Sono fattori di crescita appartenenti al gruppo 2 (βtrefoil vedi pag.269). Sono proteine formate da ~ 200-250 AA. I Fattori di Crescita dei Fibroblasti generano una grande varietà di risposte biologiche: crescita cellulare, differenziazione, angiogenesi, riparazione dei tessuti e trasformazione. Alcuni di essi stimolano la crescita di neuriti in cellule di feocromocitoma (PC 12). Alcune di queste citochine legano eparan-solfato, e questo legame è necessario per l espressione della loro attività biologica. Queste citochine hanno importanti funzioni nello sviluppo dell embrione. Proprietà dei recettori per FGF (FGFR): presentano una struttura caratteristica (vedi pag.283), con solo 3 domini extracellulari tipo Ig, possiedono inoltre un dominio intracellulare tirosin-cinasico, diviso in due tronconi. Quindi è simile al PDGFR. 286

Trasforming Growth Factor (TGF) Proprietà delle citochine TGF: ne sono note due (α e β). Questi fattori sono capaci di indurre un fenotipo trasformato reversibile in cellule bersaglio (fibroblasti non-trasformati). I due TGF noti presentano struttura sensibilmente diversa; infatti: - TGFα presenta una struttura β-meander (gruppo 3, vedi pag.269). - TGFβ presenta una struttura cistine-knot (gruppo 2, vedi pag.269). Occorre quindi esaminarli separatamente. Il TGFα genera risposte simili a quelle dell EGF (le due citochine presentano strutture simili), ma il TGFα genera risposte più forti dell EGF. Le due citochine possono legarsi allo stesso recettore (EGFR). Il TGFβ ha ruoli importanti nella funzionalità e differenziazione del sistema immunitario. Il TGFβ interviene nella riparazione dei danni tissutali. Infatti è rilasciato dalle piastrine nei siti dove è necessaria la cicatrizzazione delle ferite. Esiste una vasta distribuzione del TGFβ (e dei suoi recettori) durante lo sviluppo, per cui è probabile che svolga un ruolo nell embriogenesi. Proprietà dei recettori per TGF (TGFR): si è già detto che TGFα ha affinità con EGF. Per TGFβ esistono tre tipi di recettori: TGFR di tipo I, II e III. Presentano una struttura tipica, essendo presente, nella parte citoplasmatica, un dominio serin/treonin cinasico, differenziandosi quindi nettamente dagli altri recettori della stessa famiglia, che presentano attività tirosin-cinasica. Si conosce poco dei meccanismi di trasmissione del segnale da parte di questi recettori. 287