Protocolli analitici (sostanze organiche)

Protocolli analitici (sostanze organiche) 1. Acido perfluoroottanoico (PFOA) e perfluoroottansolfonato (PFOS) nel biota acquatico. Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, Reparto di Chimica Tossicologica 2. Acido perfluoroottanoico (PFOA) e perfluoroottansolfonato (PFOS) in campioni di pesce. Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Dipartimento Ambiente e Salute 3. Pesticidi organo clorurati nei prodotti ittici. Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Dipartimento di Chimica e Sostanze Biologicamente Attive 4. Polibromodifenil eteri (PBDE), policlorobifenili (PCB), policlorodibenzodiossine (PCDD) e policlorodibenzofurani (PCDF) in campioni di pesce e di molluschi bivalvi. Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, Reparto di Chimica Tossicologica 5. Policlorobifenili (PCB), policlorodibenzodiossine (PCDD), policlorodibenzofurani (PCDF), polibromodibenzodiossine (PBDD) e polibromodibenzofurani (PBDF) in campioni di omogeneizzato di pesce. Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Dipartimento Ambiente e Salute 6. Policlorobifenili (PCB) in campioni di pesce e di molluschi bivalvi. CNR. Istituto per la Dinamica dei Processi Ambientali. Sede Venezia 7. Policlorobifenili idrossilati (HO-PCB) in campioni di siero ematico. Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, Reparto di Chimica Tossicologica

1. Acido perfluoroottanoico (PFOA) e perfluoroottansolfonato (PFOS) nel biota acquatico Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, Reparto di Chimica Tossicologica Avvertenze Il metodo analitico in oggetto è un adattamento derivante dalla letteratura internazionale, dalle linee guida proposte nel workshop preparatorio al III studio interlaboratorio per l analisi dei composti alchilici perfluorurati (Università Vrije, Amsterdam 1920/03/2007) e dalla esperienza di reparto derivante dalla partecipazione al I studio interlaboratorio (marzo 2005). Tale metodo deve essere ancora testato e validato. Al riguardo, si fa presente quanto segue: I risultati del I (2005) e II (2006) studio interlaboratorio per l analisi dei composti organici perfluorurati nel biota acquatico e nel sangue umano hanno rilevato un inadeguato accordo tra i risultati analitici tale da non consentire la definizione e la disponibilità di metodi e materiali di riferimento; prodotti consumabili o strumenti identificati commercialmente nel testo, e portati come esempi, possono essere sostituiti con prodotti o strumentazione equivalenti di differente origine; i contaminanti in oggetto sono tossici e idonee misure protettive devono essere presenti nel laboratorio per evitare contaminazioni ambientali e rischi occupazionali; Acronimi CRM materiale di riferimento certificato

FR FRR LOQ fattore di risposta fattore di risposta relativo limite di quantificazione N noise, o rumore di fondo (N = 4 SD N ) PFOA PFOS SE SI MRM SRM HPLC acido perfluoroottanoico perfluoroottano solfonato standard esterno standard interno multiple reaction monitoring single reaction monitoring high performance liquid cromatography Introduzione Il composto acido perfluoroottanoico (PFOA, C7F15COOH) e il composto anionico perfluoroottano solfonato (PFOS, C8F17SO3 ) sono ampiamente dispersi nell ambiente e bio-accumulati a diversi livelli della catena alimentare e sono il prodotto di degradazione ambientale di una più ampia famiglia di composti organici fluorurati ampiamente utilizzati in diversi prodotti industriali. Le caratteristiche chimico-fisiche di questi composti sono notevolmente diverse da quelle che caratterizzano gli inquinanti organici persistenti clorurati. In particolar modo le caratteristiche ioniche rendono questi composti solubili in acqua. Da ciò ne consegue un comportamento metabolico non vincolato al compartimento lipidico. 1.1 Scopo e applicazione 1.1.1 Il metodo è proposto per la quantificazione di PFOA e PFOS nelle matrici biologiche solide.

1.2 Principio del metodo 1.2.1 La Figura 1.1 sintetizza le fasi di preparazione, estrazione, purificazione e quantificazione utilizzate nel presente metodo. 1.2.2 Il metodo implica l uso di standard interni (SI) marcati con quattro 13C vicinali compreso il C funzionalizzato (C1). 1.2.3 L estratto è soggetto a purificazione SPE per mezzo di scambiatore anionico debole (Oasis WAX 150 mg). 1.2.4 La quantificazione può essere ottenuta o per confronto con una retta di calibrazione (anche non in matrice) o per singolo punto da standard esterni. La seconda procedura è attuabile solo dopo attenta verifica del campo di linearità. 1.2.5 La procedura per la stima dei recuperi può essere eseguita o fortificando matrici prive dei contaminanti in esame o direttamente dalle fortificazioni con analiti marcati del campione in esame. Nella seconda evenienza la retta di calibrazione deve essere costruita in matrice per ovviare al possibile effetto matrice che renderebbe non accurata la risposta strumentale dello standard di quantificazione. 1.2.6 La separazione cromatografia è ottenuta con cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). La quantificazione strumentale è affidata a spettrometri di massa con configurazione a doppio quadrupolo con cella collisionale con cui è possibile effettuare acquisizioni SRM (single reaction monitoring) e MRM (multiple reaction monitoring). 1.2.7 A ciascun batch di campioni è abbinata l analisi di un bianco procedurale per verificare l eventuale contributo al fondo (background) procedurale. 1.3 Reattivi impiegati 1.3.1 Reagenti e materiale cromatografico Argon 5.0; azoto per gas cromatografia, ultrapuro; Oasis WAX 6 cc, 150 mg, 30 um (Waters, USA); potassio idrossido (85 %); sodio idrossido; sodio acetato (98.5 %) ; acido acetico (99.9 %).

1.3.2 Solventi Acetone, grado tecnico; n-esano per LC, purezza > 98.0 %; metanolo per HPLC, purezza 99.9 %. 1.3.3 Standard PFOA, standard naturale, purezza > 99 % (lineare) (Wellington Laboratories) ; PFOS (sale sodico), standard naturale, purezza > 99 % (lineare) (Wellington Laboratories); PFOA, standard 13 C 4 -marcato, purezza > 99 % (lineare) (Wellington Laboratories); PFOS (sale sodico), standard 13 C 4 -marcato, purezza > 99 % (lineare) (Wellington Laboratories); PFDA, standard 13 C 2 -marcato, purezza > 99 % (lineare) (Wellington Laboratories). 1.4 Interferenze e cause d errore 1.4.1 Solo un laboratorio adeguatamente costruito ed equipaggiato può ritenersi idoneo all esecuzione delle analisi d interesse. All interno del medesimo, dovrà essere mantenuta la massima pulizia, eventualmente in pressione positiva per evitare apporti di contaminazione atmosferica dall esterno. Gli operatori, tutti esperti, dovranno attenersi rigorosamente ai protocolli di buone pratiche e alle procedure operative standard dedicate d accreditamento in vigore nel laboratorio. 1.4.2 Le contaminazioni derivanti dalla presenza di materiale teflonato o simile sono tra le maggiori cause di interferenza analitica riscontrabile in queste procedure. Sono quindi da evitare setti teflonati o alternativamente è possibile porre del foglio di alluminio sotto il setto direttamente a contatto con le soluzioni di lavoro. 1.4.3 Le contaminazioni derivanti dall apparecchiatura HPLC non possono essere completamente eliminate ma devono essere continuamente monitorate e pertanto l applicazione di una accurata procedura per il bianco analitico risulta di fondamentale importanza. 1.4.4 Poiché la vetreria, i solventi, i reagenti, e ogni tipo di strumentazione utilizzata durante l analisi possono essere fonte di interferenti, è necessario dimostrare che tutti i materiali impiegati ne siano virtualmente privi.

1.4.5 La vetreria, tutta di Pyrex, viene preventivamente lavata con detersivo e acqua, risciacquata accuratamente con acqua distillata, e poi tenuta in stufa a 170 C per 12 24 h (la vetreria tarata, di Classe A ove opportuno, non viene sottoposta al trattamento termico). Prima dell uso la vetreria è ulteriormente e ripetutamente risciacquata con acetone seguito da metanolo. Tutti i contenitori in polipropilene utilizzati per il campionamento, la conservazione e l analisi dei campioni devono essere preventivamente lavati con metanolo. 1.4.6 Tutti i solventi utilizzati in quantità relativamente rilevanti, che subiscono sensibili processi di concentrazione durante il percorso dell analisi, devono essere sottoposti a un controllo di congruità analitica preventiva per verificarne l eventuale contributo al background procedurale. Per tale accertamento, volumi operativi dei solventi d interesse, presi singolarmente, vengono concentrati a piccolo volume secondo quanto si verifica nell applicazione del metodo e sottoposti a rilevamento strumentale. Qualora questo background procedurale sia troppo elevato, occorre purificare i solventi non idonei, o effettuarne la sostituzione. 1.4.7 Tutti gli standard acquisiti da ditte specializzate devono essere certificati all origine in merito alle identità dei composti ed isomeri forniti, al grado della loro purezza, e al loro titolo effettivo. In genere, è opportuno verificare tali parametri direttamente mediante rilevamento strumentale: qualora si rilevi un incongruenza sensibile tra il dichiarato e il risultato del rilevamento, il prodotto dovrà essere sostituito. Delle soluzioni di riferimento derivate dagli standard commerciali se ne deve accertare la stabilità nel tempo. 1.4.8 Le soluzioni acquose dei composti organici perfluorurati non possono essere poste in contenitori di vetro in quanto è possibile l adsorbimento di questi composti da parte dei materiali vetrosi. 1.4.9 Le miscele tecniche dei composti in esame sono miscele di isomeri lineari e ramificati (gruppi diperfluorometilici geminali e perfluorometilici). Gli standard (Wellington) attualmente in commercio sono certificati al 98 % di purezza sull isomero lineare. I fattori di risposta strumentale sono diversi tra isomeri di diversa ramificazione da ciò ne deriva la difficoltà intrinseca di una quantificazione accurata. Dovendo valutare la presenza totale dei composti in esame è opportuno integrare completamente il segnale cromatografico. Aggiustamenti della cromatografia, tali da rendere coeluenti i vari isomeri, devono essere ben vagliati in relazione al rischio di incrementare l effetto matrice. 1.5 Conservazione del campione 1.5.1 Il campione è conservato a 20 ºC fino all analisi.

1.6 Procedura analitica 1.6.1 Preparazione del campione. Il dimensionamento del campione da sottoporre all analisi è funzione dei livelli di contaminazione presunti. In fase preliminare è possibile utilizzare 1 g di campione omogeneizzato ed eventualmente modificare il volume di ripresa finale per ottenere un LOQ analitico accettabile. Sulla base dei livelli di contaminazione presunti è possibile stimare la quantità di SI da addizionare al campione prima dell estrazione. Il campione omogeneizzato è pesato e addizionato con gli SI. Il campione così preparato è lasciato riposare per 16 h a 4 C prima dell estrazione. 1.6.2 Estrazione. Un grammo del campione viene addizionato a 10 ml di soluzione metanolica di potassio idrossido 0.05 N in una Falcon di polipropilene e agitato per 16 h a temperatura ambiente. Un ml dell estratto viene diluito con 100 ml di acqua in opportuno contenitore di polipropilene prima della fase di purificazione. 1.6.3 Purificazione. L estratto è purificato mediante cartuccia SPE Oasis WAX. Questa viene condizionata prima con 5 ml soluzione metanolica di sodio idrossido 5 mm, poi con 4 ml di acqua. Dopo caricamento del campione, vengono raccolte tre frazioni: frazione 1 (4 ml di tampone acetato 25 mm (ph 4), frazione 2 (4 ml metanolo), frazione 3 (4 ml soluzione metanolica di sodio idrossido 5 mm). La velocità di eluizione della cartuccia è di circa 1 ml ogni 10 secondi. La frazione 3 concentrata a volume opportuno sotto leggero flusso di azoto a 40 C. Nel caso si volesse procedere ad una quantificazione dei recuperi degli analiti marcati è necessario aggiungere un volume noto della soluzione metanolica di PFDA (standard d iniezione). 1.6.4 Determinazione strumentale. Il PFOA e il PFOS vengono determinati mediante LC-MS con triplo quadrupolo utilizzando le condizioni operative descritte nell Allegato 1.1. 1.6.5 Calcoli e risultati. La quantificazione degli analiti di interesse viene eseguita applicando l Equazione 1, avendo determinato i fattori di risposta (FR) e i fattori di risposta relativi (FRR). Questi vengono stimati dalle aree dei segnali relativi alle masse. A Q X AN SI AN = (1) FRRAN ASI dove X AN è la quantità assoluta dell analita nel campione; A AN è l area del segnale analitico nel campione; Q SI è la quantità assoluta dello SI 13 C-marcato;

A SI è l area corrispondente al segnale dello SI 13 C-marcato; FRR AN è il fattore di risposta relativo calcolato mediante l Equazione (2): FR AN FRR AN = (2) FRSI dove FRAN e FRSI sono rispettivamente i fattori di risposta determinati per l analita e per lo standard interno nello standard di quantificazione. I risultati analitici relativi a PFOA e PFOS sono generalmente espressi in ng/g ww (peso fresco). 1.7 Verifica della qualità dei dati 1.7.1 Il laboratorio che usa il presente metodo è invitato a operare seguendo un programma di assicurazione di qualità i cui requisiti sono riportati di seguito. 1.7.2 RIPRODUCIBILITÀ INTRA-LABORATORIO DEL METODO. Questo controllo è eseguito con misurazioni indipendenti, ripetute su una medesima matrice omogenea predisposta dal laboratorio (blank fortificato). Devianze accettate sui valori singoli o cumulativi delle concentrazione degli analiti, < ±20 %. Valori al difuori di tale intervallo comportano una specifica valutazione di congruenza e una conseguente azione a livello operativo. 1.7.3 ACCURATEZZA INTRA-LABORATORIO DEL METODO. Questo controllo è eseguito con misurazioni ripetute su appropriati materiali di riferimento (CRM) o, in loro mancanza, su blanks propriamente fortificati nel laboratorio. Devianze accettate sui valori singoli o cumulativi delle concentrazione degli analiti, < ±30 %. Valori non congruenti a tale intervallo comportano una specifica valutazione di congruenza e una conseguente azione a livello operativo. 1.7.4 RECUPERO DI STANDARD INTERNI MARCATI. Sono accettabili recuperi compresi nel range 50 120 %. Valori al di fuori di tale intervallo comportano una specifica valutazione di congruenza, ed eventualmente il rigetto e la ripetizione dell analisi. 1.7.5 LIMITE DI QUANTIFICAZIONE DEL METODO (LOQ). La determinazione del LOQ viene eseguita sul campione reale, calcolando per ciascun analita la concentrazione che produce una risposta strumentale pari a quattro volte il noise (N), con N 4 SDN (SDN, deviazione standard associata al noise). 1.7.6 CONTAMINAZIONE LEGATA AD INTERFERENZE NEI BIANCHI PROCEDURALI. A ciascun batch di campioni è abbinato un bianco procedurale il cui contributo potrebbe influenzare il valore di un segnale analitico (X). Il seguente sistema di

contrassegni o flags viene utilizzato nel laboratorio per qualificare e gestire il contributo di X B nei registri interni ed eventualmente nei rapporti di prova: X B / X 0.05: l interferenza è considerate trascurabile nessuna correzione; 0.05 < X B / X 0.25: l interferenza è considerata modesta nessuna correzione (flag, o contrassegno su X, * ); 0.25 < X B / X 0.75: l interferenza è considerata sensibile correzione richiesta: X[valore corretto] = X X B (flag ** ); 0.75 < X B / X 1.25: l interferenza è considerate marcata il segnale analitico è paragonabile al LOQ e sostituito da <LOQ (flag *** ); 1.25 < X B / X: l interferenza è considerata eccessiva e non correggibile il valore di X è sostituito da ND ( non determinabile ). 1.7.7 RIPETIBILITÀ DEI TEMPI DI RITENZIONE. Livelli di devianza accettati, < ±2 %. 1.7.8 RIPETIBILITÀ DEI FATTORI DI RISPOSTA RELATIVI (RRF). Livelli di devianza accettati per (RF ANALYTE ) (RF 13C-IS ) 1, < ±15 % (con segnali > LOQ). 1.7.9 EFFICIENZA DI RECUPERO DEGLI STANDARD INTERNI 13 C-MARCATI. Intervallo d accettabilità, 50 120 %. Valori al difuori di tale intervallo comportano una specifica valutazione di congruenza, ed eventualmente il rigetto e la ripetizione dell analisi. 1.7.10 CONTROLLO DELLA LINEARITÀ DI RISPOSTA. La linearità di risposta è controllata regolarmente con soluzioni standard di PFOA e PFOS su un intervallo di circa due ordini di grandezza, che includono i valori LOQ. Il LOQ strumentale non dovrebbe essere superiore a 2 3 pg iniettati in colonna per ottenere prestazioni analitiche compatibili ad un LOQ analitico nell ordine di 1 ppb (ng/g) 1.7.11 RIPRODUCIBILITÀ INTRA-LABORATORIO NEL TEMPO. Questo controllo è basato sulla ripetizione di determinazioni eseguite a intervalli di tempo (es., semestrale) su una matrice omogenea stabile idonea. Devianze accettate sui valori singoli o cumulativi delle concentrazione degli analiti, a differenti momenti temporali, maggiori di ±30 % comportano una specifica valutazione di congruenza e una conseguente azione a livello operativo. 1.7.12 RIPRODUCIBILITÀ E ACCURATEZZA INTER-LABORATORIO. Valutazione basata sulle determinazioni dei congeneri d interesse, indipendenti e ripetute su matrici omogenee e CRM distribuite da un ente organizzatore. I criteri di valutazione/accettazione in funzione del sistema di controllo utilizzato dall ente organizzatore.

Omogeneizzazione campione Spike del campione con SI 1 g del campione più 10 ml metanolo/koh 0.05 N 1 ml dell estratto diluito in 100 ml di H 2 O Condizionamento Oasis WAX (vedi testo) Caricamento campione su OASIS WAX Frazione 1: lavaggio con 4 ml tampone acetato 25 mm (ph 4) Frazione 2: lavaggio con 4 ml metanolo Frazione 3 (raccolta analiti): 4 ml metanolo/naoh 5 mm (evaporazione) Iniezione (10 µl) in HPLC/MS/MS Figura 1.1 Schema della procedura analitica adottata dal presente metodo.

ALLEGATO 1.1 Condizioni operative suggerite per la determinazione strumentale degli analiti di interesse LC-MS HPLC Agilent HP1100 o equivalente. Colonna cromatografica proposta Thermo Betasil C18 (2.1 mm i.d., 50 mm length, 5 µm ps) o equivalente. Possibile uso di precolonna. Fasi mobili 2 mm acetato d ammonio in soluzione acquosa (fase A), metanolo (fase B). È proponibile anche l uso di fasi addizionate ad acido formico o acetico all 1%. Iniettare 10 µl; flusso 300 µl/min; gradiente fase B: 10 % per 30 s e al 75 % a 7 min, al 100 % a 10 s, isocratica fino a 12 min. A 20 min si ritorna al 10 %. Spettrometro a doppio quadrupolo con cella collisionale (Waters Premiere o equivalente). Analisi eseguite in Multiple Reaction Monitoring (MRM) in acq negativa. MRM Analita [M-H] Prodotto PFOA 413 369 PFOS 499 80/99 PFOA 13 C 4 417 372 PFOS 13 C 4 503 80/99

ALLEGATO 1.2 Laboratorio Carta di controllo a uso interno per PFOA e PFOS Caratteristica strumentale Variabilità dei tempi di ritenzione relativi Variabilità dei fattori di risposta relativa Valore o intervallo di riferimento < ±2 % < ±15 % Si / No / Commento Data Firma Efficienza di recupero 50 120 % Determinazione delle interferenze di background Devianza dell accuratezza (da analisi intra-laboratorio) Variabilità dei singoli analiti o di valori cumulativi Linearità di risposta Variabilità della performance di laboratorio nel tempo < ±30 % < ±20 % LOQs 2 3 pg, su due ordini di grandezza < ±30 %

2. Acido perfluoroottanoico (PFOA) e perfluoroottansolfonato (PFOS) in campioni di pesce Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Dipartimento Ambiente e Salute Acronimi ESI HPLC MS PFOA PFOS SI SPE SRM electrospray ionization high performance liquid chromatography, o cromatografia liquida ad alta prestazione spettrometria di massa acido perfluoroottanoico perfluoroottansulfonato standard interno solid phase extraction selected reaction monitoring 2.1 Scopo e applicazione 2.1.1 Il presente metodo è utilizzabile per la quantificazione dell acido perfluoroottanoico (PFOA, C 7 F 15 COOH) e del perfluoroottano solfonato (PFOS, C 8 F 17 SO 3 ) mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata a spetrtrometria di massa (HPLC-MS/MS).

2.2 Principio del metodo 2.2.1 Il rilevamento degli analiti di interesse è basato sull impiego di standard interni (SI) marcati con 13 C. Gli SI vengono aggiunti al campione prima di qualsiasi operazione analitica. 2.2.2 Dopo estrazione con solvente, i campioni sono sottoposti a una procedura di purificazione mediante cartuccia SPE e quantificati mediante HPLC-MS/MS per la determinazione di PFOS a PFOA. 2.2.3 A ciascun batch di campioni è abbinata l analisi di un bianco procedurale per verificare l eventuale contributo dovuto al fondo ambientale e procedurale. 2.3 Strumentazione 2.3.1 Strumentazione per l estrazione del campione Estrattore automatico Aspec GX-274 (Gilson); contenitori Falcon di polipropilene da 50 ml; cartucce per estrazione SPE di tipo Evolute ABN (50 mg); provette coniche da 6 ml. 2.3.2 Strumentazione per la determinazione strumentale del campione HPLC Perkin-Elmer Series 200 (autocampionatore e due pompe analitiche); Spettrometro di massa Applied Biosystems API 3000, con sorgente electrospray ionization ESI.

2.4 Reagenti e standard 2.4.1 Solventi Acetonitrile (Riedel-de-Haen, per LC-MS); acqua ultrapura MilliQ per HPLC (Millipore). 2.4.2 Standard Perfluoro-n-octanoic acid (PFOA), 50 µg/ml in metanolo (Wellington Laboratories); perfluoro-n-[1,2,3,4-13c4]octanoic acid (PFOA- 13 C 4 ), 50 µg/ml in metanolo (Wellington Laboratories); sodio perfluoro-1-octansolfonato (L-PFOS), 50 µg/ml in metanolo (Wellington Laboratories); sodio perfluoro-1-[1,2,3,4-13 C 4 ]octansolfonato (L-PFOS- 13 C 4 ), 50 µg/ml in metanolo (Wellington Laboratories). 2.5 Conservazione del campione 2.5.1 I campioni sono stati conservati 20 C fino all analisi. 2.6 Procedura analitica 2.6.1 Estrazione del campione. Dopo scongelamento, vengono pesati circa 5 g di omogenato di pesce e trasferiti in Falcon da 50 ml. Al campione vengono aggiunti 40 ml di MilliQ e il tutto viene accuratamente miscelato. Dopo aver portato il ph a 8.5 tramite aggiunta di 70 µl di idrossido di ammonio, vengono aggiunti gli SI di PFOS e PFOA (1 ng totale). Il campione viene quindi mescolato su Vortex per permettere la diffusione dello standard interno e successivamente centrifugato per 10 minuti a 2800 rpm. Il surnatante viene quindi trasferito in una Falcon da 50 ml e sottoposto a purificazione. 2.6.2 Purificazione. La purificazione avviene tramite utilizzo di cartucce SPE del tipo EVOLUTE ABN mediante un estrattore automatico. La metodica prevede i seguenti passaggi: condizionamento della cartuccia SPE con 3 ml di metanolo, seguiti da 3 ml di acqua MilliQ; essiccazione della cartuccia tramite flusso di azoto; caricamento del campione a velocità di 30 ml/min; eluizione della cartuccia con 3 ml di metanolo.

Dopo eluizione, il solvente viene evaporato e il campione ripreso in 100 µl di una miscela di acetonitrile al 20 % in acqua. 50 µl del campione così diluito vengono trasferiti in vial di vetro con microinserti in plastica per l analisi strumentale. 6.2 determinazione strumentale. Gli standard di PFOA e PFOS e i relativi standard marcati con 13C sono diluiti alle concentrazioni di lavoro (10 ng/µl, 100 pg/µl e 10 pg/µl) in acetonitrile. In fase di sviluppo del metodo per ogni sostanza è stata eseguita una ottimizzazione delle condizioni analitiche in MS e in MS/MS, mediante infusione continua di una soluzione standard (1 ng/µl). Tale procedura ha permesso di stabilire le migliori condizioni di ionizzazione e di frammentazione degli ioni pseudo-molecolari (Tabella 1). Le condizioni gascromatografiche di analisi (Allegato 1) sono state ottimizzate usando standard analitici alla concentrazione di 10 pg/µl. I tempi di ritenzione di PFOA e PFOS sono risultati rispettivamente: 7.7 min e 9.4 min. La sensibilità strumentale ottenuta è dell ordine di pochi pg di sostanza iniettata in colonna.

Tabella 2.1. Condizioni di ionizzazione (ioni negativi) e di frammentazione per le sostanze indicate. Sostanza Orifice voltage (V) Ring voltage (V) Ione precursore (m/z) Ione prodotto I (m/z) ed energia di collisione Ione prodotto II (m/z) ed energia di collisione (ev) (ev) PFOA 20 100 413 169 (26) 369 (16) PFOA- 13 C 4 20 100 417 172 (26) 372 (16) PFOS 40 180 499 80 (86) 99 (68) PFOS- 13 C 4 40 180 503 80 (86) 99 (68)

ALLEGATO 2.1 Condizioni operative utilizzate per la determinazione strumentale degli analiti di interesse colonna: XTerra MS C18 2.1x100 mm, 3.5 µm; loop di iniezione: 20 µl; eluente A: acido acetico 0.05 % in acqua; eluente B: acetonitrile; flusso: 200 µl/min; gradiente: dal 20 al 70 % di B in 10 min, dal 70 al 100 % di B in 2 min, 100 % di B per 2 min, ritorno al 20 % di B in 2 min, 20 % di B per 7 min (riequilibrio della colonna).

3. Pesticidi organoclorurati nei prodotti ittici Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, Dipartimento di Chimica e Sostanze Biologicamente Attive Acronimi DCB 2,4 -DDD 4,4 -DDD 2,4 -DDE 4,4 -DDE 2,4 -DDT 4,4 -DDT GC MS OCP SPE decaclorobifenile 1,1-dicloro-2-(2-clorofenil)-2-(4-clorofenil)-2,2-dicloroetano, noto anche come o,p-ddd 1,1-bis(4-clorofenil)-2,2-dicloroetano, noto anche come p,p -DDD 1,1-dicloro-2-(2-clorofenil)-2-(4-clorofenil)-etene, noto anche come o,p-dde 1,1-dicloro-2,2-bis(4-clorofenil)-etene, noto anche come p,p - DDE 1,1,1-tricloro-2-(2-clorofenil)-2-(4-clorofenil)-etano, noto anche come o,p-ddt 1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)-etano, noto anche come p,p - DDT gas cromatografia spettrometria di massa pesticidi organoclorurati estrazione su fase solida

3.1 Scopo e applicazione 3.1.1 Il metodo è proposto per la quantificazione dei pesticidi organoclorurati in campioni di pesce mediante gascromatografia con rivelazione a selezione di massa (GC-MS/MS). 3.1.2 Il metodo consente la determinazione dei pesticidi clorurati indicati in Tabella 3.1. 3.2 Principio del metodo 3.2.1 Il campione è sottoposto ad estrazione con etere di petrolio per ottenere la sua componente lipidica. Da questa i pesticidi organoclorurati vengono estratti con acetonitrile. 3.2.2 L estratto è purificato mediante cartucce SPE Florisil e gli analiti sono quantificati mediante gascromatografia con rivelazione a selezione di massa (GC- MS/MS). 3.3 Strumentazione Evaporatore rotante; bilancia di precisione ± 1 mg; bilancia analitica ± 0.01 mg; sistema per l eluizione sotto vuoto di cartucce SPE; centrifuga refrigerata; sistema riscaldato per l evaporazione sotto corrente di N 2 ; gascromatografo Thermo-Finnigan mod. Trace GC dotato di rivelatore a selezione di massa a trappola ionica (MS/ITD) mod. PolarisQ ed autocampionatore Thermo-Finnigan AS 3000; normale vetreria da laboratorio; beute da 250 ml con tappo smeriglio; bagno ad ultrasuoni; palloncini da evaporazione a fondo conico (capacità almeno 250 ml); provettoni Falcon in polipropilene con tappo a vite da 50 ml; vials a tappo a vite da circa 12 ml con tappo teflonato; vials a tappo a vite da circa 2 ml per gascromatografia; 3.4 Reagenti e standard 3.4.1 Reagenti e materiale cromatografico SPE-Florisil 2000 mg 12 ml; colonna capillare con fase RTX 5sil MS (RESTEK) 30 m 0.25 mm 0.25 µm df, o di analoga selettività a basso spurgo per GC/MS.

3.4.2 Solventi Etere di petrolio per pesticidi, p. eb. 40 60 C; sodio solfato anidro; acetonitrile per pesticidi; n-esano per pesticidi; acetone per pesticidi; soluzione di estrazione: 400 ml di acetonitrile per pesticidi vengono miscelati con 100 ml di n-esano in un imbuto separatore. Una volta separate le due fasi, la fase sottostante (acetonitrile) viene recuperata e conservata in un contenitore idoneo. 3.4.3 Standard certificati Standard di pesticidi clorurati certificati 10 ng/µl (miscela); standard di pesticidi clorurati marcati certificati 100 ng/µl e 50 ng/µl (singoli); standard di decaclorobifenile (DCB) certificato 100 ng/µl. 3.4.4 Soluzioni standard 3.4.4.1 Soluzione di PCL mix a 100 µg/ml: 100 µl della miscela di pesticidi clorurati 10 ng/µl vengono diluiti fino al volume di 10 ml con n-esano. 3.4.4.2 Soluzione di PCL mix a 1 µg/ml: 100 µl della miscela di pesticidi clorurati 10 mg/kg vengono diluiti fino al volume di 10 ml con n-esano. 3.4.4.3 Soluzione di PCL marcati a 100 µg/ml: 10 µl della soluzione pesticida marcato a 100 ng/µl e 200 µl della soluzione pesticida marcato a 20 ng/µl vengono diluiti fino al volume di 10 ml con n-esano. 3.4.4.4 Soluzione di PCL marcati a 1 µg/ml: 100 µl della soluzione pesticida marcato a 100 µg/ml vengono diluiti fino al volume di 10 ml con n-esano. Preparare la soluzione di pesticida marcato per ogni analista, utilizzando il marcato corrispondente la soluzione deve essere preparata ogni volta che si effettua l analisi. 3.4.4.5 Soluzione di standard siringa DCB 100 µg/ml: 100 µl della soluzione DCB a 100 µg/ml vengono diluiti fino al volume di 10 ml con n-esano; 3.4.4.6 Soluzione di standard siringa DCB 1 µg/ml: 100 µl della soluzione DCB a 100 µg/ml vengono diluiti fino al volume di 10 ml con n-esano. 3.5 Conservazione del campione 3.5.1 Il campione omogeneizzato è congelato a 20 C, fino all analisi.

3.6 Procedura analitica 3.6.1 Estrazione della componente lipidica. Approssimativamente 30 g di campione opportunamente omogeneizzato vengono pesati in una beuta con tappo smeriglio e impastati con 50-100 g di sodio solfato anidro (la quantità di sodio solfato varia a seconda della percentuale di acqua presente nel campione). Dopo l aggiunta di 150 ml di etere di petrolio, il campione viene sonicato per 15 minuti e lasciato con il solvente per 12 ore. Il surnatante è filtrato su sodio solfato e il solvente evaporato a pressione ridotta. 3.6.2 Estrazione dei pesticidi organoclorurati dal grasso. Circa 1 g di grasso, estratto come descritto al Punto 6.1, viene pesato in una Falcon da 50 ml, addizionato con 100 µl di miscela di standard marcati 1 µg/ml e mescolato con 30 ml di acetonitrile. Il campione così preparato viene posto in stufa a 60 C per 20 minuti, agitato nuovamente, e posto in congelatore a 20 C per almeno 1 ora. Dopo centrifugazione a 4000 rpm a 4 C per 3 minuti, il surnatante viene raccolto in un pallone da evaporazione a fondo conico precedentemente pesato e il residuo viene estratto nuovamente con 30 ml di acetonitrile. Sul campione è ripetuta la fase di riscaldamento in stufa a 60 C e il congelamento a 20 C. Dopo centrifugazione a 4000 rpm a 4 C per 3 minuti, il surnatante è riunito al precedente. Le fasi estratte (volume totale 60 ml) vengono portate a secco in evaporatore rotante a 40 C e sottoposte a purificazione. 3.6.3 Purificazione dei campioni. 20 ml di estratto vengono purificate sulle cartucce SPE Florisil 2000 mg 12 ml. Le cartucce vengono lavate con 20 ml di acetonitrile saturo in n-esano, asciugate per 10 minuti, e condizionate con 5 ml di acetonitrile saturo di n-esano. Caricato l estratto su cartuccia, questa viene asciugata per 5 minuti sotto leggero vuoto e gli analiti vengono eluiti con 12 ml di una miscela n-esano:acetone (1:9). L eluato è portato a secco sotto leggero flusso di azoto in termostato a 30 C, ripreso con 900 µl di n-esano e 100 µl di DCB 1 µg/ml. 3.6.4 Determinazione strumentale. Gli analiti di interesse sono determinati mediante HRGC-MS/MS (trappola ionica) in modalità selective reaction monitoring (SRM) utilizzando le condizioni operative descritte nell Allegato 1. Gli analiti di interesse e i corrispondenti composti marcati sono quantificati utilizzando le masse riportate in Tabella 3.1. Il rilevamento quantitativo viene eseguito mediante retta di taratura in matrice.

Tabella 3.1. Pesticidi organoclorurati ricercati nello studio. Pesticida No. CAS α-hch 319-84-6 β-hch 319-85-7 γ-hch 58-89-9 HCB 118-74-1 eptacloro 76-44-8 aldrin 309-00-2 dieldrin 60-57-1 endrin 72-20-8 cis-eptacloro epossido 280044-83-9 trans-eptacloro epossido 1024-5703 cis-clordano 57-74-9 trans-clordano 57-74-2 2,4 -DDD 53-19-0 4,4 -DDD 72-54-8 2,4 -DDE 3424-82-6 4,4 -DDE 72-55-9 2,4 -DDT 789-02-6 4,4 -DDT 50-29-3

Tabella 3.2. Masse dei pesticidi nativi e isotopicamente marcati utilizzate per il rilevamento strumentale. Pesticida Ione quantificatore (m/z) Ione qualificatore (m/z) α-hch 145 181 β-hch 145 181 γ-hch 145 181 HCB 249 284 eptacloro 237 272 aldrin 228 263 dieldrin 228 263 endrin 228 263 cis-eptacloro epossido 218 253 trans-eptacloro epossido 218 253 cis-clordano 337 373 trans-clordano 337 373 2,4 -DDD 200 235 4,4 -DDD 200 235 2,4 -DDE 176 246 4,4 -DDE 176 246 2,4 -DDT 200 235 4,4 -DDT 200 235 Pesticida Ione quantificatore (m/z) Ione qualificatore (m/z) 13 C-α-HCH 151 187 13 C-β-HCH 151 187 13 C-γ-HCH 151 187 13 C-HCB 255 290 13 C-eptacloro 247 282 13 C-aldrin 240 275 13 C-dieldrin 240 275 13 C-cis-clordano 347 383 13 C-trans-clordano 188 258 13 C-2,4 -DDD 208 243 13 C-4,4 -DDD 212 247 13 C-2,4 -DDE 212 247 13 C-4,4 -DDE 188 258 13 C-2,4 -DDT 212 247 13 C-4,4 -DDT

ALLEGATO 3.1 Condizioni operative suggerite per la determinazione strumentale degli analiti di interesse Le condizioni di analisi gascromatografica sono ancora in fase di ottimizzazione. colonna gas cromatografia: RTX 5sil MS (RESTEK) 30 m 0.25 mm 0.25 µm df, o di analoga selettività a basso spurgo per GC/MS; iniettore splitless con l inlet alla temperatura di 40 C; programmata GC: 70 C per 1 min, 10 C/min fino a 180 C, 180 C per 3 min, 4 C/min fino 220 C, 220 C per 3 min, 5 C/min fino 270 C, 270 C per 10 min, 10 C/min fino 300 C, 300 C per 2 min.

4. Polibromodifenil eteri (PBDE), policlorobifenili (PCB), policlorodibenzodiossine (PCDD) e policlorodibenzofurani (PCDF) in campioni di pesce e di molluschi bivalvi Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, Reparto di Chimica Tossicologica Avvertenze Il metodo proposto è basato su esperienze dirette (Bayarri et al., 2001; De Felip, 2003; di Domenico et al., 1997, 1998, 2002; Ingelido, 2004, 2007) e in accordo con il Metodo 1613 della US EPA (1994) sviluppato per la determinazione di PCDD e PCDF mediante HRGC-HRMS. Al riguardo, si fa presente quanto segue: a causa della complessità intrinseca delle analisi di cui trattasi, l applicazione del metodo si basa sulla disponibilità di infrastrutture e strumentazione specialistiche e personale esperto o adeguatamente addestrato; prodotti consumabili o strumenti identificati commercialmente nel testo, e portati come esempi, possono essere sostituiti con prodotti o strumentazione equivalenti di differente origine; la tecnica della diluizione isotopica utilizzata nel metodo è descritta nel dettaglio nel Metodo 1613 della US EPA (1994): a esso si rinvia per adeguata informazione; i contaminanti in oggetto sono altamente tossici e idonee misure protettive devono essere presenti nel laboratorio per evitare contaminazioni ambientali e rischi occupazionali; a causa della fotolabilità osservata per alcuni dei PBDE in oggetto, particolari precauzioni devono essere prese dal laboratorio per evitare l esposizione alla luce delle soluzioni standard e dei campioni.

Acronimi CRM DL-PCB EI FR FRR GC HR LOQ LR MS materiale di riferimento certificato policlorobifenili diossina-simili electron impact fattore di risposta fattore di risposta relativo gascromatografia alta risoluzione limite di quantificazione bassa risoluzione spettrometria di massa N noise, o rumore di fondo (N = 4 SD N ) NDL-PCB PBDE PCDD PCDF SI SIM TEF policlorobifenili non diossina-simili polibromodifenileteri policlorodibenzodiossine policlorodibenzofurani standard interno single ion monitoring fattori di tossicità equivalente

Introduzione La classe dei polibromodifenileteri (PBDE), strutturalmente non molto dissimile da quella dei policlorobifenili (PCB) e dei polibromobifenili (PBB), comprende 209 congeneri che si differenziano per numero e posizione degli atomi di bromo. Ciascun congenere è numerato secondo il sistema IUPAC utilizzato per la numerazione dei PCB. In commercio esistono tre formulazioni, denominate Penta- BDE, Octa-BDE e Deca-BDE, prodotte per bromurazione dei difenileteri in presenza di un catalizzatore. Ciascuna di esse è costituita da miscele di prodotti con grado di bromurazione variabile. La famiglia dei policlorobifenili (PCB) è costituita da 209 congeneri, il cui substrato di base è il bifenile; esso può alloggiare da uno a 10 atomi di cloro. In relazione ai meccanismi propri dell azione tossica dei PCB, si tende a dividere tali composti in due categorie (comunque coesistenti nelle miscele commerciali e nelle matrici ambientali): i 12 PCB diossina-simili (DL-PCB), con quattro posizioni orto (2, 2, 6, 6 ) libere (DL-PCB non-orto-sostituiti) o monoclorosostituite (DL-PCB mono-ortosostituiti), e i PCB non diossina-simili (NDL-PCB). Policlorodibenzodiossine (PCDD) e policlorodibenzofurani (PCDF) sono termini che indicano due famiglie chimiche caratterizzate da elevata molteplicità: esistono 75 PCDD e 135 PCDF, per un totale di 210 congeneri suddivisi in otto gruppi omologhi per ciascuna famiglia, con grado di clorosostituzione da uno a otto (WHO, 1989; IARC, 1997). Con l eccezione degli ottacloroderivati, tutti gli altri gruppi omologhi sono costituiti da più congeneri (isomeri posizionali). Per il loro potenziale tossicologico, in genere sono d interesse analitico solo quei congeneri clorosostituiti alle posizioni C2, C3, C7, e C8, per un totale di 17 congeneri. PCDD+PCDF, insieme o separatamente, vengono comunemente chiamati diossine ; il termine diossina è di massima riservato al congenere 2,3,7,8- T 4 CDD.

4.1 Scopo e applicazione 4.1.1 Il metodo è proposto per la quantificazione di PBDE, NDL-PCB, DL-PCB, e PCDD+PCDF in campioni omogeneizzati di pesce e di molluschi bivalvi mediante gascromatografia ad alta risoluzione-spettrometria di massa a bassa risoluzione (HRGC-LRMS) e gascromatografia ad alta risoluzione-spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRGC-HRMS). 4.1.2 Il metodo consente la determinazione di a) 11 congeneri di PBDE appartenenti ai gruppi omologhi tetra- (T 4 ), penta- (P 5 ), esa- (H 6 ), epta- (H 7 ), otta- (O 8 ), nona- (O 9 ) e deca- (O 10 ) bromosostituiti; b) 30 congeneri di NDL-PCB appartenenti ai gruppi omologhi tri- (T 3 ), tetra- (T 4 ), penta- (P 5 ), esa- (H 6 ), epta- (H 7 ), e otta- (O 8 ) clorosostituiti; c) 12 congeneri di DL-PCB appartenti ai gruppi omologhi tetra- (T 4 ), penta- (P 5 ), ed esa- (H 6 ) clorosostituiti e comprendenti 8 congeneri mono-orto sostituiti e 4 congeneri a struttura coplanare; d) 17 congeneri tossici di PCDD+PCDF appartenenti ai gruppi omologhi tetra- (T 4 ), penta- (P 5 ), esa- (H 6 ), epta- (H 7 ), e otta- (O 8 ) clorosostituiti. L elenco dei singoli congeneri previsti dal presente metodo è riportato nelle Tabelle 4.1 4.4 4.2 Principio del metodo 4.2.1 La Figura 4.1 sintetizza le fasi di preparazione, estrazione, purificazione e quantificazione utilizzate nel presente metodo. 4.2.2 In accordo con il Metodo 1613 della US EPA (1994), il rilevamento degli analiti di interesse è basato sull impiego estensivo di standard interni (SI), o traccianti, completamente marcati con 13C. Gli IS vengono aggiunti all omogeneizzato prima di qualsiasi operazione analitica, ed eventualmente di passaggi analitici intermedi ritenuti critici. 4.2.3 La componente lipidica è estratta in Soxhlet con n-esano, così da rimuovere gli analiti altamente lipofili. 4.2.4 L estratto è soggetto a una procedura di purificazione comprendente un trattamento con acido solforico concentrato per distruggere il carico organico coestratto con gli analiti, seguito da passaggi su colonne cromatografiche in sequenza che permettono di concentrare gli analiti in forma purificata. 4.2.5 Dopo purificazione, il campione è quantificato contro standard esterni (SE, tanti quanti sono gli analiti da dosare) mediante HRGC-LRMS (SIM) per la determinazione di PBDE, di NDL-PCB, e di mono-orto DL-PCB e mediante HRGC- HRMS (SIM) per la determinazione di non-orto DL-PCB e PCDD+PCDF.

4.2.6 Si fa presente che, a causa dell ampio intervallo di pesi molecolari presentati dai PBDE (fra 480 e 970 Da), la spettrometria di massa a elevata risoluzione rappresenta il sistema di rilevamento di elezione, garantendo elevata selettività e sensibilità anche per i congeneri esa deca-sostituiti. Tuttavia, si ritiene che la determinazione congenere-specifica possa essere effettuata con successo anche in bassa risoluzione. Al riguardo, si nota che i più recenti spettrometri di massa quadrupolari coprono un range di massa fino a 1050 Da, così offrendo una potenziale alternativa all uso di spettrometri ad alta risoluzione anche nella determinazione di PBDE con elevato grado di bromurazione. 4.2.7 Si evidenzia che il rilevamento strumentale dei PBDE è complicato dalla proprietà intrinseche di queste sostanze che presentano alti punti di ebollizione e moderata stabilità chimico-fisica (il congenere 209, per esempio, inizia a degradarsi a temperature prossime a 300 C). Particolare attenzione deve essere posta, dunque, nella scelta del sistema d iniezione e della colonna gascromatografica (Björklund, 2004). 4.2.8 A ciascun batch di campioni è abbinata l analisi di un bianco procedurale per verificare l eventuale contributo al fondo (background) procedurale. 4.2.9 Parallelamente alla quantificazione degli analiti di interesse una frazione dell estratto, pari al 5 % in peso, viene utilizzata per la determinazione del contenuto lipidico. 4.3 Strumentazione 4.3.1 Strumentazione per l estrazione del campione Estrattore Soxhlet in vetro da 250 1000 ml. 4.3.2 Strumentazione per la concentrazione del campione Evaporatore rotante; apparato per la concentrazione sotto corrente di azoto. 4.3.3 Strumentazione per la purificazione del campione Colonna in vetro (Ø 2.5 cm) per Extrelut ; sistema di purificazione automatizzato (Power-PrepTM, Fluid Managemnet Systems); colonna in vetro (Ø 0.5 cm) per allumina; palloni di vetro da 50, 100 e 250 ml.

4.3.4 Strumentazione per la determinazione strumentale del campione HRGC-HRMS, Waters VG Autospec; HRGC-LRMS, Trace GC Ultra, Thermo Electron Corporation. 4.4 Reagenti e standard 4.4.1 Reagenti e materiale cromatografico. Le sostanze identificate con * vengono scaldate a 110 C per 12 24 h prima dell uso. Acido solforico per analisi, concentrato (96 %); azoto per gas cromatografia, ultrapuro; bicarbonato di sodio, purezza 99.8 %; Celite 545, granulometria 0.01 0.04 mm; Merck (Darmstadt, Germany);* elio per gas cromatografia, ultrapuro; Extrelut NT; Merck (Darmstadt, Germany); gel di silice, per cromatografia su colonna, 70 230 mesh; diametro medio dei pori 60 Å;* ossido d alluminio 90, per cromatografia su colonna, 70 230 mesh. Si raccoglie per setacciatura la frazione di granulometria pari a circa 120 230 mesh, e si attiva in muffola a 500 C per 12 24 h prima dell uso. L allumina si utilizza appena raffreddata; in alternativa, essa viene conservata protetta dall umidità (l efficienza della filtrazione cromatografica su allumina è particolarmente sensibile alle condizioni operative e richiede adeguata standardizzazione); kit di tre colonne (allumina, carbone e silice) per Power-Prep ; sodio cloruro (per eventuale aggiunta al sodio solfato anidro per aumentarne la permeabilità), purezza > 99.0 %;* sodio solfato anidro per analisi, purezza 99.0 %*. 4.4.2 Solventi Acetone per HPLC, purezza > 98.0 %, acqua 0.1 %; acetone grado tecnico; diclorometano per HPLC, purezza 99.8 %; n-esano grado tecnico; n-esano per LC, purezza > 98.0 %; etil acetato per HPLC, purezza 99.8 %; iso-ottano per analisi strumentale (UV, IR, o HPLC), purezza 99.5 %; metanolo per HPLC, purezza 99.9 %; n-nonano per HPLC, purezza 99.7 %; n-pentano per analisi, purezza 99.0 %; n-tetradecano standard per GC, purezza 99.5 %; toluene per analisi strumentale (UV, IR, o HPLC), purezza 99.5 %;

tetracloruro di carbonio, purezza 99.5 %. 4.4.3 Standard Clordano 13 C-marcato impiegato come standard d iniezione nella determinazione di NDL-PCB, mono-orto DL-PCB, e PBDE, purezza 99 %; congeneri PBDE, standard naturali, purezza > 99 % (Wellington Laboratories); congeneri PBDE, standard 13 C-marcati; purezza > 99 %; (Wellington Laboratories); congeneri PCB, standard naturali, purezza > 99 % (Cambridge Isotopic Laboratory (CIL)); congeneri PCB, standard 13 C-marcati, purezza > 99 % (Cambridge Isotopic Laboratory (CIL)); congeneri PCDD+PCDF, standard naturali, purezza > 99 % (Cambridge Isotope Laboratories (CIL)); congeneri PCDD+PCDF, standard completamente 13 C-marcati, purezza > 99 %; (Cambridge Isotope Laboratories (CIL)). Questo gruppo di composti include tutti gli SI propriamente utilizzati come tali più due congeneri impiegati come standard d iniezione ( 13 C-1,2,3,7,8,9-H 6 CDF e 13 C- 1,2,3,6,7,8-H 6 CDD). 4.4.4 Campione controllo qualità (CQ). Il campione CQ più idoneo è rappresentato da un materiale di riferimento certificato (CRM) simile alla matrice analizzata, contenente gli analiti di interesse a concentrazioni note. In mancanza di CRM, il campione CQ potrebbe essere costituito da una soluzione standard degli analiti di interesse a concentrazione nota di origine diversa rispetto a quella utilizzata per la quantificazione. 4.5 Interferenze e cause d errore 4.5.1 A causa delle minute quantità di analiti che devono essere identificate e quantificate, solo un laboratorio adeguatamente costruito ed equipaggiato può ritenersi idoneo all esecuzione delle analisi d interesse. All interno del medesimo, dovrà essere mantenuta la massima pulizia, eventualmente in pressione positiva per evitare apporti di contaminazione atmosferica dall esterno. Gli operatori, tutti esperti, dovranno attenersi rigorosamente ai protocolli di buone pratiche e alle procedure operative standard dedicate d accreditamento in vigore nel laboratorio. 4.5.2 Poiché la vetreria, i solventi, i reagenti, e ogni tipo di strumentazione utilizzata durante l analisi possono portare alla presenza di sostanze interferenti, è necessario dimostrare che tutti i materiali impiegati ne siano virtualmente privi.

4.5.3 La vetreria, tutta di Pyrex, viene preventivamente lavata con detersivo e acqua, risciacquata accuratamente con acqua distillata, e poi tenuta in stufa a 170 C per 12 24 h (la vetreria tarata, di Classe A ove opportuno, non viene sottoposta al trattamento termico). Prima dell uso, la vetreria è ulteriormente e ripetutamente risciacquata con acetone seguito da n-esano, e fatta asciugare in zona protetta. L ultimo risciacquo della vetreria con n-esano viene raccolto quantitativamente e concentrato a piccolo volume da 1/100 a 1/500 del volume di partenza per verificarvi mediante rilevamento HRGC-LRMS(SIM) e HRGC- HRMS(SIM) l eventuale presenza d interferenze pregiudiziali sui segnali degli analiti d interesse. Qualora questo background procedurale sia troppo elevato, occorre sottoporre la vetreria di cui trattasi a nuovo lavaggio oppure sostituirla. Dopo l uso, se opportuno, la vetreria impiegata viene recuperata dopo decontaminazione con lavaggi ripetuti con miscela equivolumetrica di acetone e n-esano (eventualmente entrambi di grado tecnico), seguita dalla procedura di lavaggio precedentemente descritta. In una valutazione costo-beneficio, parte della vetreria usata può essere eliminata secondo le prassi di scarico dei rifiuti in atto nel laboratorio. 4.5.4 Tutti i solventi utilizzati in quantità relativamente rilevanti, che subiscono sensibili processi di concentrazione durante il percorso dell analisi, devono essere sottoposti a un controllo di congruità analitica preventiva per verificarne l eventuale contributo al background procedurale. Per tale accertamento, volumi operativi dei solventi d interesse, presi singolarmente, vengono concentrati a piccolo volume secondo quanto si verifica nell applicazione del metodo e sottoposti a rilevamento HRGC-LRMS(SIM) e HRGC-HRMS(SIM). Qualora questo background procedurale sia troppo elevato, occorre purificare il o i solventi inidonei, o effettuarne la sostituzione. 4.5.5 Tutti gli standard acquisiti da ditte specializzate devono essere certificati all origine in merito alle identità dei congeneri forniti, al grado della loro purezza, e al loro titolo effettivo. In genere, è opportuno verificare tali parametri direttamente mediante rilevamento HRGC-LRMS(SIM) e HRGC-HRMS(SIM): qualora si rilevi un incongruenza sensibile tra il dichiarato e il risultato del rilevamento, il prodotto dovrà essere sostituito. Le soluzioni di riferimento derivate dagli standard commerciali utilizzano solventi relativamente poco volatili (n-nonano, iso-ottano, o toluene) per le diluizioni: di esse se ne accerta la stabilità nel tempo. 4.5.6 I lipidi naturalmente presenti nel campione e co-estratti insieme agli analiti di interesse possono interferire con la loro determinazione. Pertanto, il contenuto lipidico deve essere ridotto o eliminato utilizzando la procedura di purificazione riportata.

4.6 Conservazione del campione 4.6.1 Il campione omogeneizzato è congelato a 20 C, fino all analisi. 4.7 Procedura analitica 4.7.1 Preparazione del campione 4.7.1.1 La dimensione del campione da sottoporre all analisi è funzione dei livelli di contaminazione presunti e del contenuto lipidico della specie in esame. La Tabella 4.5 mostra per alcune specie di pesce e di molluschi la percentuale media di lipidi presenti nella parte edibile. 4.7.1.2 Sulla basse dei livelli di contaminazione presunti, è stata stimata per ciascuna classe di analiti la quantità di SI da addizionare al campione prima dell estrazione (Tabella 4.6). Si fa presente che le quantità riportate sono indicative e possono variare in funzione della contaminazione presunta del campione. 4.7.1.3 Il campione omogeneizzato è pesato, mescolato con sodio solfato, in genere aggiunto in quantità doppia rispetto al campione, e addizionato con gli SI. Il campione così preparato è lasciato riposare per 12 24 h prima dell estrazione. 4.7.2 Estrazione 4.7.2.1 L estrazione è condotta in Soxhlet per 18 24 ore con n-esano (circa 150 ricicli). L estratto è concentrato a pressione ridotta e pesato per prelevare una quantità pari al 5 % in peso da destinare alla determinazione del contenuto lipidico. Questo viene calcolato lasciando l aliquota prelevata sotto leggero flusso di azoto fino a portarla a costanza di peso. 4.7.3 Purificazione 4.7.3.1 L estratto esanico viene concentrato fino al volume di 5 10 ml ed è eluito con 350 ml di n-esano su colonna di Extrelut (12 g) impregnato con 30 ml di acido solforico concentrato (Figura 4.2) (De Felip et al., 1990, 1999). Se il carico organico è ancora visibilmente presente dopo il trattamento acido, il campione concentrato a piccolo volume viene eluito con 200 ml di n-esano o n-pentano su una colonna multistrato (Figura 4.2). L eluato ottenuto dall Extrelut o dalla colonna multistrato viene concentrato fino al volume di 4 5 ml e sottoposto a frazionamento mediante Power-Prep TM. Questo apparato, capace di prestazioni elevate, consente d eseguire un cleanup automatizzato con un kit commerciale di tre colonne sequenziali impaccate, nell ordine, con gel di silice, allumina, e