Modelli matematici predittivi, Challenge test, studi di Shelf-Life

Approfondimenti sull applicazione dei criteri microbiologici nella valutazione dei piani di autocontrollo Aziende di produzione di alimenti O.A Modelli matematici predittivi, Challenge test, studi di Shelf-Life Fabriano, 7 luglio 2016 Annalisa Petruzzelli Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell Umbria e delle Marche-Pesaro

Art. 3 Prescrizioni generali comma 1

Art. 3 Prescrizioni generali comma 2

Regolamento (CE) n. 2073/2005 della Commissione sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari Allegato I capitolo 1 Alimenti pronti che non costituiscono terreno favorevole allo sviluppo di L. monocytogenes: periodo di conservabilità inferiore ai 5 giorni ph 4,4 o attività dell acqua aw 0,92 ph 5,0 e aw 0,94 Ammessa la presenza di 100 ufc/g di Listeria monocytogenes durante il periodo di conservabilità

Alimenti pronti che costituiscono terreno favorevole allo sviluppo di L. monocytogenes Assente in 25 g di prodotto prima di essere immesso sul mercato oppure 100 ufc/g per tutto il periodo di conservabilità se il produttore è in grado di dimostrare, con soddisfazione dell autorità competente, che tale limite non viene superato durante il periodo di conservabilità

Regolamento (CE) n. 2073/2005 - Allegato II CARATTERISTICHE INTRINSECHE ED ESTRINSECHE: STANDARD DI PROCESSO CHARACTERISTICS INTRINSIC ph and type of acid present Water activity Redox potential Natural barrier Nutritional content of food and availability Antimicrobial substances Microflora Microbiological quality of ingredients Food formulation and composition Food assembly and structure CHARACTERISTICS EXTRINSIC Temperature (during production, storage, distribution and display) Packaging Gas athmosphere Relative humidity Food processing Good manufacturing and hygiene practices Historical data Storage and distribution Consumer practices Procedures based on HACCP

Regolamento (CE) n. 2073/2005 - Allegato II LETTERATURA SCIENTIFICA Comparando le caratteristiche di processo e di prodotto con quelle indicate in letteratura

Studi preliminari (caratterizzazione di processo) Standard di processo Caratterizzazione merceologica, fisico-chimica e microbiologica ottenuta attraverso l analisi di differenti lotti (almeno 3) di uno stesso prodotto provenienti dallo stesso processo produttivo (stesso produttore)

Standard di processo Esempio 1 Formaggio pecorino a latte crudo Descrizione del prodotto Formaggio a latte crudo a breve stagionatura (circa 40 giorni) Forme di circa 2 Kg di peso Non presenta imballaggio Presenta esternamente una crosta di colore giallo pallido, la pasta è di colore bianco con scarse occhiature regolari e di piccole dimensioni, compatta e di consistenza morbido-elastica

Termizzazione del latte a 55-58 C per 15 secondi Processo produttivo Abbattimento a 37 C e trasferimento in polivalente Aggiunta colture starter mesofile e termofile Sosta per 20-25 minuti Aggiunta caglio Presa e consolidamento del coagulo Rottura meccanica della cagliata Formatura, pressatura e rivoltamento delle forme Sineresi a temperatura ambiente per 6 ore Salatura in salamoia per circa 24 ore Stagionatura a +12 C per 40 giorni

Standard di processo Disegno sperimentale analisi su almeno 3 lotti per ogni lotto almeno 3 campioni (3 uc) Lotto 1 Lotto 2 Lotto 3

Caratterizzazione di processo Quali sono le fasi di campionamento? da materia prima (latte/cagliata o carne/impasto) fino a fine processo produttivo o stagionatura prevista nelle prime fasi di processo si verificano le modificazioni più importanti pertanto verranno effettuati campionamenti ravvicinati Quali parametri valutare? microbiologici: microrganismi tecnologici (batteri lattici), criteri di igiene di processo (enterobatteri e stafilococchi) chimico-fisici: ph e aw, contenuto di NaCl Campionamenti Numero Determinazioni campioni Cagliata 3 (una unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Al termine della sineresi 3 (una unità) ph Dopo salatura 3 (una unità) ph Giorno 1 3 (una unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 4 3 (una unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 7 3 (una unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 15 3 (una unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 40 3 (una unità) ph, aw, batteri lattici, % sale

log ufc/g Lattici ph Standard di processo Formaggio pecorino a latte crudo 7,00 6,50 6,00 5,50 5,00 4,50 4,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 giorni di stagionatura Lotto 1 Lotto 2 Lotto 3 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 giorni di stagionatura Lotto 1 Lotto 2 Lotto 3

% sale aw Standard di processo Formaggio pecorino a latte crudo 1,000 0,990 0,980 0,970 0,960 0,950 0,940 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 giorni di stagionatura Lotto 1 Lotto 2 Lotto 3 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 giorni di stagionatura Lotto 1 Lotto 2 Lotto 3

Standard di processo Formaggio pecorino a latte crudo E stato possibile definire uno standard di processo in quanto la dispersione dei valori misurati è risultata di modesta entità, valutabile anche dall osservazione degli andamenti Il formaggio pecorino a latte crudo, riferito al processo produttivo oggetto dello studio, risulta avere a fine stagionatura le seguenti caratteristiche: flora lattica 8,54 log ufc/g ± 0,23 ph 5,17 ± 0,09 aw 0,959 ± 0,003 sale 2,49 g/100g ± 0,28

Standard di processo Esempio 2 Salsiccia di suino stagionata Descrizione del prodotto Salume ottenuto dalla fermentazione lattica di carni di suino macinate (stagionatura 15 giorni) Diametro di circa 3 cm, lunghezza di circa 12 cm e peso di circa 95 g Non presenta imballaggio

Carne fresca di suino Processo produttivo 80% spalla 20% cotenna Aggiunta peperone dolce, pepe nero, aroma di marsala, sale destrosio e saccarosio, fermenti (Stapylococcus xylosus, Pediococcus pentosaceus), E301, E250, E252 Insacco con budello naturale Sosta a 4 C per 24h Sgocciolamento da 5 C fino a 22 C nell arco di tempo di 6 h Asciugatura da 22 C fino a 14 C nell arco di tempo di 4 gg Stagionatura fino a 15 gg ( +12 C< T < +14 C, umidità 75-85%) 17

Disegno sperimentale Standard di processo analisi su almeno 3 lotti per ogni lotto almeno 3 campioni (3 uc) Campionamenti Numero campioni Determinazioni Giorno 0 3 (3 unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 1 3 (3 unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 5 3 (3 unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 8 3 (3 unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 12 3 (3 unità) ph, aw, batteri lattici, % sale Giorno 15 3 (3 unità) ph, aw, batteri lattici, % sale

log ufc/g Lattici ph Salsiccia di suino stagionata Standard di processo 6 5,5 5 4,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 giorni di stagionatura lotto 1 lotto 2 lotto 3 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 giorni di stagionatura lotto 1 lotto 2 lotto 3

% sale aw Standard di processo 0,990 0,980 0,970 0,960 0,950 0,940 0,930 0,920 0,910 0,900 0,890 0,880 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 giorni di stagionatura lotto 1 lotto 2 lotto 3 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 giorni di stagionatura lotto 1 lotto 2 lotto 3

Definizione dello Standard di processo Salsiccia di suino stagionata Non è stato possibile definire lo standard di processo e non è stato possibile classificare il prodotto come favorevole o non favorevole allo sviluppo di L. m. Criticità Andamento delle flore lattiche nel primo lotto Andamento del ph nel primo lotto Andamento dell aw Verifiche Controllo tempi/temperature mediante data logger

Regolamento (CE) n. 2073/2005 - Allegato II MICROBIOLOGIA PREDITTIVA CHALLENGE TEST TEST DI DURABILITA

Modelli di Microbiologia Predittiva La microbiologia predittiva ha come scopo quello di predire il comportamento dei microrganismi in un substrato durante tutto il periodo di produzione e conservazione in particolari condizioni ambientali (Es Temperatura, ph, aw). Pertanto, basandosi su precedenti osservazioni è possibile predire il comportamento degli stessi microorganismi in condizioni ambientali simili (Ross and McMeekin, 1994).

La microbiologia predittiva usa modelli matematici e software informatici per descrivere graficamente le risposte dei microrganismi. Esistono diversi modelli matematici: a) tempo = modello primario b) temperatura, ph, Aw = modello secondario c) tempo, temperatura, ph, Aw, substrato = terziario Esistono diversi software informatici: 1. ComBase http://www.combase.cc/ 2. Pathogen Modeling Program http://www.ars.usda.gov/services/docs.htm?docid=6786 3. Growth Predictor & Perfringens Predictor http://www.ifr.ac.uk/safety/growthpredictor/ 4. Sym'Previus (an integrated database and predictive software, in French) http://www.symprevius.net/

Microbiologia predittiva: limiti Limiti tecnici: Validazione del modello matematico teorico tramite contaminazioni sperimentali degli alimenti e calcolo dell errore tra modello e situazione reale (McMeekin et al., 1993). Bisogna sempre validare il modello con studi scientifici in quanto nei data base sono inseriti dei valori corrispondenti al comportamento dei germi su terreno colturali quindi non del tutto corrispondenti alla realtà (substrato alimento)

Microbiologia predittiva: limiti Limiti professionali: bisogna conoscere bene i parametri del modello e, di conseguenza, quali interrogazioni possono essere chieste al modello stesso e quali invece non possono essere ritenute attendibili. Limiti Biologici: Spesso i modelli non tengono conto delle interazioni fra i germi e non contengono tutti i tipi di alimento. PARAMETRI: T 25 C ph 6 Aw 0,997 Nitrato di Na 0 Livello iniziale 0

Microbiologia predittiva: limiti Limiti statistici: nonostante vengano introdotti dei metodi per armonizzare valori e scale (es. logaritmi), per correggere la varianza interna ai modelli, spesso i range dei valori calcolati in condizioni marginali di sviluppo sono molto elevati. Limiti territoriali: I modelli sono molto utili nei paesi di tipo anglosassone dove le produzioni sono molto standardizzate, sono meno efficaci in paesi come il nostro dove esistono centinaia di prodotti tipici con formulazioni molto diverse

Microbiologia predittiva: applicazioni Predire la shelf-life di un prodotto: simulazione di permanenza in determinate condizioni e valutazione dei parametri (microbici e qualitativi) di accettabilità del prodotto ad un tempo x di conservazione Stimare il livello di contaminazione in una particolare fase di produzione o shelf life Testare la variabilità tra due lotti Ottimizzare la formulazione (additivi, ph, sale) anche in seguito a non conformità verificatesi nel processo: la stima dello sviluppo batterico in differenti condizioni ambientali consente di adottare formulazioni alternative utilizzando combinazioni diverse degli ostacoli di crescita. E possibile prendere decisioni puntuali senza ricorrere alle analisi di laboratorio Valutare l impatto di un interruzione della catena del freddo: è possibile prendere decisioni puntuali in merito all eventuale utilizzo rapido, reimpiego in altro processo produttivo, distruzione ecc. senza attendere il risultato di analisi di laboratorio

Regolamento (CE) n. 2073/2005 - Allegato II CHALLENGE TEST TEST DI DURABILITA Necessità di definire la Shelf Life dell alimento

TECHNICAL GUIDANCE DOCUMENT On shelf-life studies for Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods (Version 3-2014) SHELF LIFE Il periodo di tempo che corrisponde, in determinate circostanze, ad una tollerabile diminuzione di qualità dell alimento La durata di conservazione di un alimento inizia dal momento in cui viene prodotto e / o imballato

SHELF LIFE Prodotto dipendente Il prodotto non è confezionato quindi la SL dipende solo dalle caratteristiche intrinseche del prodotto Packaging dipendente Il prodotto è confezionato quindi lo SL dipende anche dalle modalità di confezionamento

Quando vanno effettuati studi di Shelf Life???? Cambiamenti di ingredienti o confezionamento di un prodotto esistente Per lo sviluppo di prodotti nuovi o modificati Sviluppo di nuovi processi Cambiamenti nei siti di produzione o attrezzature Qualsiasi variazione a quanto stabilito precedentemente!!!

Su quali prodotti vi è l obbligo di indicare il termine minimo di conservazione o la data di scadenza??? Regolamento (UE) 1169/2011 Art 1: Si applica a tutti gli alimenti destinati al consumatore finale, compresi quelli forniti dalle collettività Scompaiono le definizioni di prodotto preconfezionato e prodotto preincartato e compare solo la definizione di «alimento preimballato»: unità di vendita destinata ad essere presentata come tale al consumatore finale e alla collettività, costituita da un alimento e dall imballaggio in cui è stato confezionato prima di essere messo in vendita, avvolta interamente o in parte da tale imballaggio, ma comunque in modo tale che il contenuto non possa essere alterato senza aprire o cambiare l imballaggio Non comprende gli alimenti imballati nei luoghi di vendita su richiesta del consumatore o preimballati per la vendita diretta Il prodotto alimentare preincartato diventa prodotto alimentare «non preimballato»..esclusione DAL REGOLAMENTO?????

Studio di SHELF LIFE METODO SIMULATIVO Stoccare il prodotto in esame in condizioni di conservazione ottimali per un periodo di tempo più lungo della durata prevista e analizzare il prodotto ad intervalli regolari fino a deterioramento METODO ACCELLERATO Stoccare il prodotto a temperature più elevate rispetto a quelle ottimali al fine di velocizzare i processi di deterioramento. Attraverso la modellazione predittiva microbiologica è quindi possibile dedurre la shelf life

Quali valutazioni vengono effettuate durante un test di shelf life? Esami microbiologici (enterobatteri, muffe, batteri sulfito riduttori) Chimici (degradazione delle proteine e l irrancidimento) Parametri fisici (umidità) Valutazioni sensoriali attraverso esame ispettivo in cui si valuta l aspetto, il colore, la consistenza, l odore e il sapore

Shelf Life (Abuso termico) salsiccia stagionata

Shelf Life (Abuso termico) salsiccia stagionata 0 1 5 8 0 1 5 8 Giorni Giorni 0 1 5 8 Mercoledì 19.11.14 Giovedì 20.11.14 Venerdì 21.11.14 Lunedì 24.11.14 Mercoledì 19.11.14 Giovedì 20.11.14 Venerdì 21.11.14 Lunedì 24.11.14 Giorni Enterobatteri (UFC/g) Muffe (UFC/g) 25 C 30 C 35 C 25 C 30 C 35 C 380 22.000 40 1.100 60 <10 <100 180 <10 <10 <100 <100 ABVT (mg/100 g) Umidità (g/100 g) 25 C 30 C 35 C 25 C 30 C 35 C Mercoledì 19.11.14 Giovedì 20.11.14 Venerdì 21.11.14 Lunedì 24.11.14 52 33.34 59 29.41 54 65 27.91 27.53 59 66 25.71 23.98 Test edonistico 25 C 30 C 35 C 4 3 2.5 1 0 1 Pertanto, in base a tali risultati sono state valutate come inaccettabili le caratteristiche del prodotto in esame dopo: 1 giorno a temperatura di 35 C 3 giorni a temperatura di 30 C 5 giorni a temperatura di 25 C Valutazione predittiva della Shelf life: 5 mesi a 4 C 1 mese a 13 C <T< 16 C 39

Studi di conservabilità (durabilità) Valutazione della crescita di L. monocytogenes in alimenti naturalmente contaminati Analizzare, alla fine della shelf-life, un certo numero di unità (confezioni) di prodotto scelte in modo casuale (all interno di lotti diversi) e conservate in condizioni ragionevolmente prevedibili, per verificare quante unità superano il limite di 100 ufc/g Prevalenza alta (almeno 10%) Elevato numero di campioni per avere risultati attendibili

Challenge test Valutazione della dinamica di comportamento di L. monocytogenes in RTE non confezionati contaminazione delle materie prime all inizio del processo produttivo riproduzione del processo in condizioni sperimentali valutazione dell andamento del patogeno fino a fine shelf-life 1. Valutazione della dinamica di comportamento di L. monocytogenes durante la produzione, stagionatura e shelf-life di formaggio pecorino a latte crudo 2. Valutazione della dinamica di comportamento di L. monocytogenes durante la produzione, stagionatura e shelf-life della salsiccia di suino stagionata

Formaggio pecorino a latte crudo Challenge test: Tesi sperimentali (EURL Lm Thechnical Guidance Document for conducting shelf-life studies on Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods Version 3 6 June 2014) Sperimentazione Tal quale (Tq): 3 lotti di prodotto preparati e stagionati in Azienda Sperimentazione Controllo negativo (CN): 3 lotti di formaggio prodotti dall Azienda. Stagionatura avvenuta presso l Istituto Sperimentazione Trattato: 3 lotti di latte forniti dall Azienda ai quali è stata addizionata una sospensione cellulare di L. monocytogenes a titolo noto in polivalente contestualmente all utilizzo di starter. Stagionatura avvenuta presso l Istituto 43

Disegno sperimentale campionamenti tesi Tal quale (aziendale) e Controllo negativo Campionamenti Numero Determinazioni campioni Cagliata 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Al termine della sineresi 3 (una unità) ph Dopo salatura 3 (una unità) ph Giorno 1 stagionatura 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 4 stagionatura 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 7 stagionatura 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 15 stagionatura 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 40 stagionatura 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 20 shelf-life 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 50 shelf-life 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale tesi Trattato: numerazione e ricerca Lmo Ricerca Lmo nel latte sempre negativa

Preparazione dell inoculo e contaminazione E stata preparata una sospensione contenente il ceppo di riferimento (L. monocytogenes ATCC 7644) e 2 ceppi di campo isolati da formaggio Lotto 1-Concentrazione inoculo : 8,8 x 10 6 UFC in 100 ml di sospensione Lotto 2-Concentrazione inoculo : 2,5 x 10 7 UFC in 100 ml di sospensione Lotto 3-Concentrazione inoculo : 1,4 x 10 7 UFC in 100 ml di sospensione La tesi Trattato è stata ottenuta dalla trasformazione di 80 L di latte pertanto ci si aspettava una contaminazione iniziale di 10 2 ufc/g Contaminazione in polivalente contestualmente all aggiunta degli starter

Challenge test: trasformazione e condizioni di stoccaggio (tempo/temperatura) lotti negativi e contaminati Tutti i lotti sono stati trasformati nel rispetto del profilo tempo/temperatura fornito dalla Ditta nelle fasi di trasformazione stagionatura e per tutto il periodo di SL (50 gg)

Risultati Valutazione ph nelle tesi tal quale (aziendale) e controllo negativo Stagionatura Vita commerciale Giorni controllo negativo aziendale IC 95% controllo negativo IC 95% aziendale P-value 0 (cagliata) 6,40 6,40 6,15-6,65 6,15-6,65 1,00 1 5,20 5,20 5,15-5,25 5,15-5,25 1,00 4 5,19 5,14 5,18-5,21 4,86-5,42 0,50 7 5,24 5,22 4,82-5,65 4,88-5,56 0,92 15 5,19 5,19 5,00-5,38 5,03-5,35 1,00 30 5,18 5,17 4,95-5,40 4,96-5,38 0,93 40 5,04 5,05 4,71-5,36 4,82-5,29 0,87 20 4,96 4,99 4,56-5,35 4,63-5,35 0,80 50 5,05 5,07 4,82-5,65 4,88-5,56 0,92 ph 7,00 6,50 6,00 5,50 5,00 4,50 4,00 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 giorni stagionatura vita commerciale controllo negativo aziendale

Risultati Valutazione aw nelle tesi tal quale (aziendale) e controllo negativo Stagionatura Vita commerciale Giorni controllo negativo aziendale IC 95% controllo negativo IC 95% aziendale P-value 0 (cagliata) 0,989 0,988 0,980-1,000 0,980-1,000 0,900 1 0,985 0,988 0,980-0,990 0,987-0,990 0,092 4 0,982 0,986 0,960-1,000 0,980-0,990 0,417 7 0,973 0,979 0,950-1,000 0,960-1,000 0,447 15 0,977 0,976 0,970-0,980 0,970-0,980 0,468 30 0,965 0,959 0,950-0,970 0,950-0,970 0,108 40 0,960 0,959 0,950-0,970 0,940-0,970 0,813 20 0,956 0,954 0,950-0,970 0,940-0,970 0,702 50 0,949 0,952 0,930-0,970 0,940-0,960 0,525 a w 1,000 0,990 0,980 0,970 0,960 0,950 0,940 0,930 0,920 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 giorni stagionatura vita commerciale controllo negativo aziendale

% Risultati Valutazione % cloruro di sodio nelle tal quale (aziendale) e controllo negativo Stagionatura Vita commerciale Giorni controllo negativo aziendale IC 95% controllo negativo IC 95% aziendale P-value 0 (cagliata) 0,162 0,156 0,150-0,180 0,150-0,180 0,605 1 0,306 0,363 0,190-0,420 0,250-0,470 0,398 4 0,538 0,636 0,440-0,640 0,600-0,670 0,057 7 0,784 0,870 0,670-0,900 0,760-0,900 0,213 15 1,349 1,306 1,230-1,470 1,160-1,450 0,584 30 1,700 1,838 1,410-2,000 1,650-2,000 0,348 40 1,942 2,005 1,670-2,220 1,750-2,260 0,685 20 2,285 2,259 2,100-2,470 2,100-2,410 0,800 50 2,463 2,414 2,220-2,700 2,210-2,610 0,712 cloruro di sodio 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 giorni stagionatura vita commerciale controllo negativo aziendale

Log UFC/g Risultati Valutazione batteri lattici nelle tesi tal quale (aziendale) e controllo negativo Stagionatura Vita commerciale Giorni controllo negativo aziendale IC 95% controllo negativo IC 95% aziendale P-value 0 (cagliata) 5,90 5,90 5,41-6,38 5,41-6,38 1,00 1 6,57 6,72 6,08-7,06 6,30-7,14 0,56 4 7,30 7,19 6,89-7,70 6,71-7,67 0,71 7 7,83 7,86 7,61-8,06 7,56-8,17 0,87 15 8,28 8,34 7,91-8,65 7,98-8,70 0,80 30 8,43 8,53 8,26-8,60 8,37-8,70 0,34 40 8,64 8,38 8,32-8,96 8,18-8,59 0,15 20 8,28 8,27 8,14-8,38 8,16-8,38 0,91 50 8,20 8,02 7,98-8,42 7,86-8,17 0,14 Batteri lattici 9,00 8,50 8,00 7,50 7,00 6,50 6,00 5,50 5,00 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 giorni stagionatura vita commerciale controllo negativo aziendale

log ufc/g Risultati Valutazione andamento L. monocytogenes nella tesi Trattato L. monocytogenes 3,00 2,00 1,00 0,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 giorni stagionatura vita commerciale Ipotesi: la rapida crescita della flora lattica nelle prime fasi della trasformazione ha svolto un azione di competizione per il substrato di crescita, oltre che aver permesso una repentina acidificazione del mezzo creando un ambiente non favorevole allo sviluppo del patogeno

Discussione nelle prime fasi del processo di trasformazione si osservano modificazioni importanti nei parametri considerati per tutto il periodo di shelf-life considerato il prodotto presenta caratteristiche in termini di ph e aw che lo classificano come Alimenti pronti che costituiscono terreno favorevole lo sviluppo di L. monocytogenes dall osservazione dell andamento di L. monocytogenes si evince che il prodotto non consente la crescita del suddetto microrganismo nel corso del processo di trasformazione e stagionatura, oltre che durante il periodo di shelflife valutato 100 ufc/g per tutto il periodo di conservabilità se il produttore è in grado di dimostrare, con soddisfazione dell autorità competente, che tale limite non viene superato durante il periodo di conservabilità

Salsiccia stagionata Challenge test: Tesi sperimentali (EURL Lm Thechnical Guidance Document for conducting shelf-life studies on Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods Version 3 6 June 2014) Sperimentazione Tal quale (Tq): 3 lotti di prodotto preparati e stagionati in Azienda Sperimentazione Controllo negativo (CN): 3 lotti di impasto forniti dall Azienda completi di tutti gli ingredienti ai quali è stata addizionata soluzione fisiologica sterile. Insacco e stagionatura avvenuta presso l Istituto Sperimentazione Trattato: 3 lotti di impasto forniti dall Azienda completi di tutti gli ingredienti ai quali è stata addizionata una sospensione cellulare di L. monocytogenes a titolo noto. Insacco e stagionatura avvenuta presso l Istituto 53

Challenge test: preparazione dell inoculo E stata utilizzata una sospensione batterica composta da un ceppo di L. m. ATCC 7644 e 2 ceppi di campo isolati da salsicce stagionate Lotto 1-Concentrazione inoculo : 1,3 x 10 6 UFC in 50 ml di sospensione Lotto 2-Concentrazione inoculo : 1,4 x 10 6 UFC in 50 ml di sospensione Lotto 3-Concentrazione inoculo : 1,7 x 10 6 UFC in 50 ml di sospensione Ogni lotto è stato ottenuto dalla trasformazione di 6 kg di impasto pertanto ci si aspettava una concentrazione di L. m. iniziale pari a circa 10 2 UFC/g 54

Insacco meccanico dell impasto con budello naturale fornito dall Azienda 55

Legatura manuale con spago 56

57

Challenge test: trasformazione e condizioni di stoccaggio (tempo/temperatura) lotti negativi e contaminati Tutti i lotti sono stati trasformati nel rispetto del profilo tempo/temperatura fornito dalla Ditta nella fase di trasformazione stagionatura e per tutto il periodo di SL (150 gg) 58

Challenge test: campionamento e attività analitica campionamenti tesi Tal quale (aziendale) e Controllo negativo Campionamenti Numero Determinazioni campioni Giorno 0: dopo 24 h a + 4 C 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 1: dopo le prime 6 h della 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale fase di asciugatura Giorno 5: al termine della fase di 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale asciugatura Giorno 10: nella fase di 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale stagionatura Giorno 15: al termine della 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale stagionatura Giorno 7 shelf-life 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 50 shelf-life 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 100 shelf-life 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale Giorno 150 shelf-life 3 (una unità) ph, a w, batteri lattici, % sale tesi Trattato: numerazione e ricerca Lmo 59

log ufc/g log ufc/g log ufc/g log ufc/g Challenge test: Risultati «Tq e CN» Batteri lattici lotto 1 Batteri lattici lotto 2 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 stagionatura giorni shelf life stagionatura giorni shelf life cont neg tal quale cont neg tal quale Batteri lattici lotto 3 Batteri lattici media 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 stagionatura giorni shelf life stagionatura giorni shelf life cont neg tal quale cont neg tal quale 60

Challenge test: Risultati «Tq e CN» ph lotto 1 ph lotto 2 6,20 6,00 5,80 5,60 5,40 5,20 5,00 4,80 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life 6,20 6,00 5,80 5,60 5,40 5,20 5,00 4,80 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life cont neg tal quale cont neg tal quale ph lotto 3 ph medio 6,20 6,00 5,80 5,60 5,40 5,20 5,00 4,80 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life 6,20 6,00 5,80 5,60 5,40 5,20 5,00 4,80 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life cont neg tal quale cont neg tal quale 61

Challenge test: Risultati «Tq e CN» aw lotto 1 aw lotto 2 0,980 0,980 0,960 0,940 0,920 0,900 0,880 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life 0,960 0,940 0,920 0,900 0,880 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life cont neg tal quale cont neg tal quale aw lotto 3 aw medio 0,980 0,980 0,960 0,960 0,940 0,940 0,920 0,900 0,880 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life 0,920 0,900 0,880 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life cont neg tal quale cont neg tal quale 62

% % % % Challenge test: Risultati«Tq e CN» cloruro di sodio lotto 1 cloruro di sodio lotto 2 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life cont neg tal quale cont neg tal quale cloruro di sodio lotto 3 cloruro di sodio medio 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 giorni stagionatura shelf life cont neg tal quale cont neg tal quale 63

Challenge test: Risultati «Trattato» 64

Discussione Il prodotto non presenta caratteristiche chimico-fisiche (batteri lattici e ph) stabili in tutti e tre i lotti pertanto il processo produttivo non è sufficientemente standardizzato Lo sviluppo di Listeria monocytogenes nel terzo lotto produttivo dimostra come il processo tecnologico e le caratteristiche intrinseche del prodotto possono influenzare la dinamica di sviluppo del germe Si è concordato con il produttore di ripetere il terzo lotto nel rispetto dei tempi/temperature del processo 65

Grazie per l attenzione