Anticorpi Policlonali eterogenei: prodotti da tipi diversi di linfociti B in risposta allo stesso antigene Monoclonali omogenei: prodotti da una linea cellulare clonale
Produzione di anticorpi policlonali
reazioni sierologiche Precipitazione Agglutinazione Neutralizzazione Utilizzate con tecniche dirette o indirette
Precipitazione tra antigeni solubili (proteine cellulari in lisato o rilasciate nel mezzo di crescita, tossine) e anticorpi solubili. la reazione di precipitazione è solamente nella zona di equivalenza. Anticorpi utilizzati: IgG. Metodi in vetrino o piastra basati sulla diffusione radiale.
Tests che si basano su reazioni sierologiche Precipitazione (IgG): in provetta, su vetrino o in piastra Agglutinazione (IgM): su vetrino o piastre a pozzetti Neutralizzazione Utilizzate con tecniche dirette o con anticorpi fluorescenti immunoelettroforesi cromatografia di affinità saggi ELISA EIA RIA immunocattura cell sorting
Precipitazione in mezzo liquido in gel
Immunoprecipitazione zonale
Immunodiffusione in gel: semplice/doppia radiale semplice/doppia (Outcherlony)
reazioni sierologiche Precipitazione Agglutinazione Neutralizzazione Utilizzate con tecniche dirette o indirette
Agglutinazione diretta Anticorpi si legano ad antigeni presenti sulla superficie cellulare e formano aggregati visibili. È più sensibile della precipitazione, ma è comunque dipendente dalla concentrazione dell anticorpo. Preferibilmente si usano anticorpi appartenenti alle IgM. test agglutinazione diretto: anticorpo solubile-microorganismo - se si mantiene costante la quantità di campione -> titolazione dell antigene o dell anticorpo presente
Agglutinazione indiretta passiva test agglutinazione indiretto o inverso passivo (latex beads): - antigeni adsorbiti a sferette - l aggiunta di anticorpo causa aggregazione visibile delle sferette - anticorpo adsorbito alle particelle - aggiunto l antigene solubile --> test per tossine microbiche
DIAGNOSI DIRETTA Ricerca dell'agente eziologico intero o di una sua componente e sua identificazione: DIAGNOSI INDIRETTA Ricerca di anticorpi specifici (test sierologici): sviluppo di una risposta anticorpale specifica
Agglutinazione di microorganismi da anticorpi liberi di sferette+antigene da anticorpi liberi di sferette+anticorpo da microorganismi
reazioni sierologiche Precipitazione Agglutinazione Neutralizzazione Utilizzate con tecniche dirette o indirette
neutralizzazione coltura cellulare aggiunta della tossina dà effetto citopatico se l anticorpo aggiunto non è specifico, mentre se l anticorpo è specifico per la tossina la neutralizza e ne impedisce l azione sulle cellule spesso sufficiente per identificare i patogeni
Identificazione di tossine con cellule in coltura
Identificazione di microorganismi e/o loro componenti mediante microscopia
immunofluorescenza diretta: richiede anticorpo specie-specifico coniugato con fluorocromo. alla coltura batterica preparata su vetrino viene aggiunto l anticorpo, lavato l eccesso e osservata la fluorescenza indiretta: viene aggiunto al campione un anticorpo primario specifico, lavandone l eccesso, poi si ripete il trattamento con un anticorpo secondario coniugato che riconosce il primario. Eliminato l eccesso si osserva la fluorescenza. Il metodo è più sensibile e il segnale che ne deriva è amplificato
Fissazione Preserva e stabilizza Protegge da danni osmotici Impedisce la solubilizzazione dell antigene, rendendolo accessibile scelta del fissativo influenza risultato della reazione Fissativi aldeidici (PFA, FA, GA) Buona conservazione della morfologia. AUTOFLUORESCENZA!! Fissativi organici (MeOH) Limitata conservazione della morfologia Buona conservazione dell antigenicità. Permeabilizzazione delle cellule per estrazione dei lipidi. Non danno autoflorescenza.
Permeabilizzazione (detergenti) SAPONINA 0.01% - estrae colesterolo TRITON 0.1% - estrae circa il 60% delle proteine citoplasmatiche - è utile per smascherare il citoscheletro
Bloccaggio siti aspecifici Soluzioni ad elevato contenuto proteico (PBS + BS) Lavaggi accurati dopo ogni incubazione (più efficaci con aggiunta di saponina + BSA morfologia!!)
Controlli dei reagenti: AbI AbII: omettere o sostituire con siero preimmune dell animale utilizzato per la produzione Controlli dei campioni: controlli negativi (campione sicuramente senza ag) controlli positivi (campione che esprima sicuramente l ag cercato) controllo interno (campione dello stesso tipo già saggiato per ag)
Nuovi patogeni trasmissibili con l'acqua negli ultimi 25 anni: Campylobacter jejuni Cryptosporidium parvum Legionella pneumophila Legionella spp. Norwalk-like viruses Vibrio vulnificus Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica individui adulti in buona salute malattie raramente debilitanti bambini piccoli, anziani e individui immunocompromessi o debilitati malattie severe o morte. difficili da individuare con le metodiche microbiologiche classiche in alcuni casi resistenza o refrattarietà ai metodi di sanificazione (cloro)
Identificazione e titolazione di antigeni (microorganismi/tossine): Enzyme Linked ImmunoaSsorbent Assay o Enzymatic Immuno Assay diretti
EIA per cattura o sandwich: all anticorpo adeso al pozzetto si aggiunge il campione, e se gli antigeni sono presenti vengono catturati dall anticorpo. Aggiunta di un altro anticorpo, che può anche essere identico a quello adsorbito, coniugato ad un enzima Lavaggio dell eccesso e aggiunta del substrato dell enzima: si sviluppa colore solo se l antigene era presente nel campione. Utile per campioni a bassa concentrazione di antigeni o grosse molecole (tossine) EIA competitivo: all anticorpo adeso al pozzetto si aggiungono contemporaneamente il campione e l antigene specifico coniugato ad un enzima. Lavaggio dell eccesso e aggiunta del substrato dell enzima: se la quantità di antigene nel campione è alta questo avrà saturato tutti gli anticorpi e non avrò sviluppo di colore che sarà presente nei campioni senza antigene
per cattura o sandwich
ELISA SANDWICH PER LA RICERCA DI TOSSINE NEGLI ALIMENTI 1. estrazione 2. chiarificazione dell estratto per centrifugazione o filtrazione 3. estratto, controlli e standard immessi nei pozzetti, incubazione 4. eliminazione del liquido, 3 lavaggi e asciugatura 5. aggiunta anticorpo coniugato all enzima nei pozzetti, incubazione 6. eliminazione del liquido, 3 lavaggi e asciugatura 7. aggiunta substrato nei pozzetti, incubazione 8. aggiunta sol. arresto della reazione prima della lettura, da effettuarsi entro 30 9. lettura assorbanza alla λ consigliata per quantificazione, in relazione a pozzetti standard, o lettura visiva dello sviluppo di colore o meno
per competizione Anticorpi e antigeni coniugati ad un enzima mixati con il campione nel pozzetto antigeni del campione occupano siti degli anticorpi. Se non sono presenti si legano gli antigeni coniugati L aggiunta del substrato dell enzima sviluppa un prodotto di reazione colorato in quantità tanto maggiore quanti più antigeni coniugati liberi ci sono
ELISA per competizione per identificazione/quantificazione aflatossine
Identificazione di anticorpi nel campione: EIA o ELISA indiretti o RIA EIA per cattura per anticorpi: l antigene è fissato nel pozzetto. L anticorpo presente nel campione si lega e a sua volta viene legato da un successivo anticorpo secondario coniugato all enzima. Sviluppo di colore solo in caso di anticorpo specifico presente nel campione. EIA per competizione: l antigene è fissato alla fase solida e la competizione si sviluppa tra gli anticorpi, del campione e coniugato.
per cattura o sandwich
Identificazione di microorganismi o tossine
Lateral Flow Tests antibody particle bacterium membrane
quantificazione di antigeni purificati
Immunoelettroforesi
Individuazione di antigeni specifici: immunoblotting
Purificazione di antigeni/anticorpi
Separazione specifica di cellule