Tecniche basate sull impiego degli anticorpi Il materiale presente in questo documento viene distribuito solamente per uso interno ed esclusivamente a scopo didattico.
Anticorpo o immunoglobulina!
IL legame antigene-anticorpo e una reazione reversibile! Ag + Ab Ag-Ab! ANTIGENE ANTICORPO AFFINITA : la forza d interazione tra il sito combinatorio di un anticorpo e l epitopo antigenico ed e la sommatoria di tutte le interazioni non covalenti! Si esprime come la concentrazione di antigene necessaria per saturare il 50% dei siti combinatori
AVIDITA : e la somma della interazioni! Avidita Affinita! =! Avidita! bassa alta molto alta
PRODUZIONE CLONALE DEGLI ANTICORPI
ANTIGENI MULTIVALENTI
LA RISPOSTA ANTICORPALE IN VIVO E DI TIPO POLICLONALE! proteina esprimente! 2 epitopi antigenici! popolazione linfocitaria! espansione clonale dei linfociti B! specifici per l antigene!!
Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Aug 7 ANTICORPI MONOCLONALI (mab) Specificità definita e omogenea Isotipo omogeneo Elevata affinità Produzione in grande quantità Disponibilità illimitata Elevata purezza
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 "for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies" Georges J. F. Khöler César Milstein
L anticorpo monoclonale è omogeneo -Specificità per un singolo epitopo -Affinita -Isotipo VANTAGGI Disponibilità praticamente illimitata Basso costo
Come vengono prodotti gli anticorpi monoclonali? 1. Immunizzazione di un topo con l antigene A Antigene A Prelievo della milza Purificazione dei linfociti
Come vengono prodotti gli anticorpi monoclonali? 1 2 Cellule della milza Cellule di mieloma che producono che hanno perso anticorpi l enzima HGPRT 3 Fusione cellulare (ibridoma)
Come vengono prodotti gli anticorpi monoclonali? 1 2 4 Trasferimento nel medium HAT Cellule della milza Cellule di mieloma che producono che hanno perso anticorpi l enzima HGPRT Soltanto le cellule IBRIDE sopravvivono 5 Selezione cellule d ibridoma che producono gli anticorpi specifici per l antigene A 3 Cellule mischiate e fuse 6 Clone dell ibridoma selezionato
Caratteristiche della linea di mieloma 1. E immortale 2. Non secerne immunoglobuline 3. Manca dell enzima HGPRT (hypoxanthine guanine phosphorybosyl transferase) e quindi: NON CRESCE IN TERRENO SELETTIVO HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine)
GLI ANTICORPI MONOCLONALI (mab) Sono prodotti da una singola plasmacellula immortalizzata mediante fusione somatica con una cellula tumorale B mutante IBRIDOMA
ANTICORPI MONOCLONALI selezione in terreno HAT i sopranatanti di coltura vengono sottoposti a screening: ELISA, citofluorimetria, Western Blot selezioni di cloni ad elevata affinità
PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI Generazione di ascite (5-20 mg/ml) Biofermentatori (5 mg/ml) purificazione mediante cromatografia di affinità
ANTICORPI UTILIZZATI IN LABORATORIO specie di produzione - monoclonale topo, ratto - policlonale uomo, coniglio, capra, pecora, ratto
APPLICAZIONI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI In vitro (diagnostica) Identificazione di popolazioni cellulari esprimenti marcatori specifici Identificazione e dosaggio di antigeni solubili immunoistochimica microscopio ottico immunocitochimica immunofenotipo citofluorimetria a flusso Elisa, ria In vivo (diagnostica o terapeutica) Diagnostica per immagine Terapia (farmaci biologici)
Su vetrino IMMUNOFENOTIPO In sospensione sospensione cellulare da tessuti solidi
CD4 CD3 Immunofenotipo leucocitario L immunofenotipizzazione è basata sull identificazione di antigeni di superficie, citoplasmatici o nucleari, per mezzo di anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromi. La presenza di un dato antigene è, infatti, un indicatore dell appartenenza di una cellula ad uno stipite e/o ad un definito stadio differenziativo o funzionale. Mediante immunofenotipizzazione e possibile quantificare diverse popolazioni cellulari.
Analisi del fenotipo linfocitario 1. Valutazione della % di diverse popolazioni o sottopopolazioni 2. Valutazione della distribuzione nei tessuti 3. Monitoraggio dei linfociti nel corso di patologie o terapie 4. Valutazione funzionale dei linfociti
Gli stipiti cellulari ematopoietici sono identificabili mediante anticorpi monoclonali
PANNELLO DI ANTICORPI MONOCLONALI UTILIZZATI PER L ANALISI DEL FENOTIPO DI LEUCOCITI DI SANGUE PERIFERICO Anti-CD45 leucociti Anti-CD3 Anti-CD4 linfociti T Anti-CD8 Anti-CD19 linfociti B Anti-CD56 Anti-CD16 cellule NK Anti-CD14 monociti
La tipizzazione delle cellule emopoietiche può essere eseguita su materiale proveniente da vari compartimenti: Sangue periferico; Midollo osseo; Liquido cefalorachidiano; Liquido pleurico; Liquido pericardico; Broncolavaggio alveolare; Tessuto solido dopo allestimento di una sospensione cellulare monodispersa
PERCENTUALE DI LEUCOCITI NEL SANGUE - Neutrofili 60-70 - Eosinofili 2-5 - Basofili < 1 - Monociti 3-7 - Linfociti 20-30 LINFOCITI T CD3 58-88% LINFOCITI B 2-19 % CELLULE NK 2-28% CD3+CD4+ 30-62% CD3+CD8+ 17-42%
Il campione biologico: Sangue intero eparinato o PBMC (PBMC)
Immunofluorescenza Diretta: Le cellule in sospensione vengono marcate con un anticorpo fluorescente (anticorpo coniugato) Indiretta: Le cellule in sospensione vengono marcate con un anticorpo non coniugato (anticorpo primario) seguito da quello coniugato (anticorpo secondario)
I Fluorocromi Ogni fluorocromo ha spettri di eccitazione e di emissione caratteristici. Se vengono usati più fluorocromi per analisi multiparametriche, le loro emissioni devono essere sufficientemente distanti tra loro per potere essere distinte da ciascun fotomoltiplicatore (PMT).
LA PRESENZA DI PIU LASER CONSENTE L ANALISI CONTEMPORANEA DI OLTRE 10 PARAMETRI (ANTIGENI)
Il citometro a flusso: consente di identificare le singole cellule in base all espressione di antigeni di superficie 1 Una miscela di cellule è marcata con anticorpi fluorescenti 2 Le cellule vengono fatte passare attraverso un foro formando un flusso continuo che passa attraverso un raggio laser 3 Un tubo fotomultimetro capta la luce diffusa da ogni singola cellula dando un idea della grandezza e della granulosita della cellula stessa, e l emissione dei diversi coloranti fluorescenti Flusso continuo delle cellule marcate con anticorpi 4 Computer: analisi dati
Rappresentazione della fluorescenza: Istogramma ad un parametro e a due parametri One Parameter Histogram Unstained cells Number of Cells FITC-labeled cells Green Fluorescence Intensity Green Fluorescence Intensity Two Parameter Histogram Red Fluorescence Intensity
GATING sui PARAMETRI FISICI
Le cellule isolate dal sangue periferico si colorano con anticorpi coniugati a fluorocromi: Determiniamo qual e? la % di linfociti T CD3+CD8+ in un campione di sangue periferico. Anti-CD3-APC+ Anti-CD8-PE Citometro a flusso monociti linfociti
Determiniamo qual e? la % di linfociti T CD3+CD8+ in un campione di sangue periferico. monociti linfociti 38% 19% CD3+CD8- CD3+CD8+ 38% 19% CD3 10% 3% CD3-CD8- CD3-CD8+ 10% 3% CD8
ANALISI CITOFLUORIMETRICA DEI LINFOCITI T CD4+ E CD8+ DI UN PAZIENTE CON INFEZIONE DA HIV CD4+ CD4+
Studio dei basofili attivati in Citofluorimetria a Flusso CD63 FITC/CD123 PE/HLA-DR PerCP CD63
Strategia di gating
Espressione di marcatori tipici per leucemie e linfomi
Agammaglobulinemia di BRUTON legata al cromosoma X
Analisi funzionale: produzione di citochine Stimolazione, Permeabilizzazione, Colorazione per l analisi delle citochine intracellulari