Ruolo della risposta al danno al DNA nella carcinogenesi e nello sviluppo di terapie tumorali

Ruolo della risposta al danno al DNA nella carcinogenesi e nello sviluppo di terapie tumorali Dr.ssa Daniela Barilà Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno Difetti nella risposta al danno del DNA ed instabilità genomica Patologie genomiche associate ad instabilità genomica: alcuni esempi Ruolo della disposta al danno del DNA nello sviluppo di di terapie tumorali

Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno Danno al DNA di origine endogena: processi metabolici replicazione del DNA riarrangiamenti DNA nel sistema immunitario (VDJ recombination, class switch) Danno al DNA di origine esogena: radiazioni ionizzanti (IR) radiazioni ultravioletto (UV) diversi agenti chimici Scopo principale della risposta di danno al DNA: prevenire la replicazione del DNA in presenza di un danno del DNA e la conseguente instabilità genomica Danno al DNA Arresto del ciclo cellulare Apoptosi Riparo del DNA Sopravvivenza ) Attivazione dei checkpoint cellulari per arrestare il ciclo cellulare 2) Attivazione dei meccanismi di riparo del DNA 3) Riparo del danno e ripresa del ciclo cellulare oppure il danno non è riparabile e si attiva la risposta apoptotica 2

From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev Diversi tipi di danno al DNA e diversi meccanismi di riparo From R. Hakem, 2008, EMBO J 3

Direct reversal: a differenza delle altre risposte non richiede L attivazione di complessi multiproteici. Un esempio: O6-alkylguanina. L alchilazione impedisce l appaiamento con la citosina. Viene rimossa grazie all azione di un singolo enzima, Ada in E. coli corrispondente a O6-methyltransferase, MGMT in cellule di mammifero. MMR pathway: Mismatch Rapair, presente in eucarioti e procarioti viene utilizzata per il riparo di mismatches, ossia piccole inserzioni o delezioni. NER pathway: Nucleotide Excision Repair,presente in eucarioti e procarioti viene utilizzata per il riparo di diverse lesioni tra cui lesioni causate da UV, mutageni chimici e chemioterapici che inducano la formazione di dimeri di pirimidina e addotti sproporzionati. 3 proteine (UvrA, UvrB, UvrC) in procarioti, piu di 30 in mammifero. BER pathway: Base Excision Repair, viene utilizzata in procarioti ed eucarioti per rimuovere basi danneggiate. Danno al DNA su entrambi i filamenti: Double Strand Breaks (DSBs) HR pathway: Homologous Recombination, viene utilizzata in procarioti ed eucarioti per risolvere rotture a doppio filamento (DSB). Viene utilizzata in circa il 90% dei casi di DSBs nei batteri ed in lievito, e solo nel 0% dei casi di DSBs in cellule di mammifero, in cui si preferisce l attivazione della NHEJ. Richiede l attivazione di una serie di complessi proteici e di una cascata di eventi di trasduzione del segnale. E molto accurata. NHEJ: Non Homologous End Joining, viene utilizzata in procarioti ed eucarioti per risolvere rotture a doppio filamento (DSB). Viene utilizzata solo in circa il 0% dei casi di DSBs nei batteri ed in lievito, e nel 90% dei casi di DSBs in cellule di mammifero. Richeiede l attivazione di una serie di complessi proteici e di una cascata di eventi di trasduzione del segnale. Non e molto accurata bensi error prone. 4

From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev Double Strand Breaks (DSBs): NHEJ or HR and cell cycle From S. Takeda et al., 2007, Mol Cell 5

La risposta cellulare attivata da DSBs è molto ben caratterizzata a livello molecolare Una cascata di eventi coordinata da: ) Sensori del danno 2) Trasduttori 3) Effettori Tale risposta deve essere rapida e reversibile: modifiche post-traduzionali quali fosforilazioni ed ubiquitinazioni svolgono un ruolo centrale nella trasduzione del segnale di risposta. From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev From Su, T.T, 2006, Annu Rev Genet 6

La risposta cellulare attivata da DSBs è molto ben caratterizzata a livello molecolare In seguito al DSBs il complesso MRN (MRE/RAD50/NBS) viene reclutato ai siti di rottura del DNA dove media a sua volta il reclutamento e l attivazione della Ser/Thr chinasi ATM. Inoltre altre due Ser/Thr chinasi, ATR e DNA-PK sono attivate e partecipano attivamente alla risposta DSBs. Il complesso MRN promuove anche grazie all attività esonucleasica di MRE la resezione che porta alla formazione di DNA a singolo filamento, il quale a sua volta promuove l attivazione di ATR. In pochi minuti dalla formazione di DSBs ATM, ATR e DNA-PK si attivano e fosforilano a loro volta altri trasduttori ed effettori necessari sia ad attivare il riparo del DNA che ad attivare i checkpoints cellulari Il complesso MRN (MRE/RAD50/NBS) MRE: è una proteina che lega il DNA e possiede attività esonucleasica 3-5 oltre ad attività endonucleasica. Promuove quindi la resezione e la formazione di ssdna necessaria per la ricombinazione omologa. Promuove inoltre l attivazione di ATR. RAD50: è un membro della famiglia SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) e forma omodimeri che si associano con due molecole di MRE per formare complessi tetramerici MRE-RAD50 che possono inserirsi tra le estremità libere del DNA oppure tra i cromatidi fratelli promuoveno la ricombinazione omologa. NBS : presenta un dominio di legame con ATM ed è quindi necessaria per Il reclutamento di ATM ai siti di rottura del DNA e per la sua attivazione. 7

Il complesso MRN Le PI3-like Ser/Thr chinasi svolgono un ruolo centrale come trasduttori della risposta di danno al DNA ATM ATR ATX/SMG 3056 2644 303 DNA-PK mtor/frap TRRAP 428 2549 3830 FAT PI3-K FATC Tali proteine sono altamente conservate nell evoluzione. 8

ATM ATR ATX/SMG 3056 2644 303 DNA-PK mtor/frap TRRAP 428 2549 3830 FAT PI3-K FATC Ruolo centrale nella risposta DSBs. L attività chinasica è finemente regolata da un complesso di interazioni intra ed intermolecolare. Induzione dell attività chinasica in risposta a DSBs ed attivazione di una cascata di fosforilazioni con conseguente amplificazione del segnale. ATM è presente nella cellula come dimero inattivo. In seguito a danno del DNA ATM subisce un cambio conformazionale che ne induce l attività chinasica e l autofosforilazione in Ser98 che determina il rilascio dal dimero di due molecole di monomero autofosforilate ed attive in grado di mediare la fosforilazione di substrati sia in prossimità dei DSBs che piu genericamente nel nucleo. From Bakkenist and Kastan, 2003, Nature 9

Ruolo di ATM nel riparo del DNA ATM colocalizza ed induce la fosforilazione dell istone H2AX in Ser39 ai siti di rottura del DNA. Tale evento promuove la formazione degli IRIF (Ionizing Radiation Induced Foci). Agli IRIF vengono reclutati e fosforilati diversi fattori tra cui: MDC, 53BP, RNF8, BRCA, CHK2 e p53. Inoltre RAD5 e RAD52 direttamente coivolte nel riparo vengono fosforilate. 0

Formazione dei foci in seguito ad IR

Ruolo di ATM nel controllo del ciclo cellulare From Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev From Rotman and Shiloh, 999, Oncogene 2

Patologie genomiche associate ad instabilità genomica: alcuni esempi Sono patologie genetiche autosomiche recessive associate a mutazioni a carico di geni codificanti per proteine importanti nella risposta al danno del DNA. Tali patologie sono generalmente associate ad instabilità cromosomica, aberrazioni del sistema nervoso ed immunitario ed ipersensibilità delle cellule agli agenti che inducono il tipo di danno la cui risposta è non funzionante. Inoltre spesso tali patologie sono anche associate ad una maggiore frequenza di sviluppo tumorale, spesso ma non solo di tumori del sistema immunitario. 3

3 sindromi associate a difetti nella risposta NER Xeroderma Pigmentosum (XP): e una sindrome generata da mutazioni In uno o più geni XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG. E caratterizza da ipersensibilita agi UV e da altissima incidenza di tumori della pelle. Cockayne syndrome: e una sindrome associata a mutazioni in CSA o CSB, proteine richieste per NER.E una patologia Caratterizzata da malformazioni e ritardo mentale grave. Si osserva in alcuni casiun alta incidenza di tumori della pelle come per XP. Tricothiodystrophy: TTD. e una sindrome associata a mutazioni nelle proteine XPB e/o XPD. Ritardo mentale e fotosensibilita. Non si osservano correlazioni con lo sviluppo di tumori della pelle. Bloom s syndrome (BS): e una sindrome rara causata da mutazioni della proteina BML una DNA elicasi importante nella risposta HR a DSBs. Maggiore possibilita di sviluppare vari tumori. Werner s syndrome (WS):WS e un altra RECQ elicasi. Le mutazioni di WS sono associate ad una patologia in cui si riscontra maggiore propensione allo sviluppo di tumori Rothmund-Thompson syndrome (RTS): RTS e generata da mutazioni di un altra RECQ elicasi. Anche questa patologia si associa ad un aumentato rischio di sviluppare tumori della pelle ed osteosarcomi. Fanconi s anemia (FA): E una patologia molto eterogenea Caratterizzata da anemia aplastica. Ci sono almeno 8 diversi FA genes. 4

Ataxia Telangiectasia (A-T): rara patologia genetica, causata da mutazioni del gene atm. E caratterizzata da neurodegenerazione, Telangiectasia, immunodeficienza e da un alta incidenza di linfomi e leucemie. Nijmegen Breakage Syndrome (NBS):mutazioni a carico della proteina NBS che impediscono il corretto funzionamento.patologia Caratterizzata da neurodegenerazione e da alta incidenza di B/T linfomi. Ataxia Telangiectasia Like Disease (ATLD): Mutazioni a carico di MRE. Alta incidenza di tumori. Diverse sindromi da instabilità genomica sono correlate tra loro In quanto le proteine codificate dai geni mutati sono funzionalmente correlate e partecipano alle stesse vie di trasduzione del segnale A-T and NBS: ATM viene attivato e a sua volta fosforila NBS A-T and Fanconi Anemia: ATM fosforila FANCD2 A-T and Bloom s Syndrome: ATM fosforila BLM 5

From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev 6

Inoltre molte mutazioni di geni della risposta a DSBs sono associate Ad alta incidenza di tumori anche in eterozigosi, quando cioe non si sviluppa la patologia genetica. Attivazione della risposta DSBs nelle lesioni pretumorali: Possibile ruolo di barriera anti-tumorale. Ruolo della disposta al danno del DNA nello sviluppo di di terapie tumorali La terapia tumorale ha come scopo fondamentale cercare di colpire Selettivamente le cellule tumorali e non quelle sane. Pertanto tutti gli approcci di sviluppo di nuove terapie si basano sulla comprensione delle differenze tra cellule tumorali e non Una differenza fondamentale è che le cellule tumorali proliferano maggiormente. Pertanto molti approcci sono mirati a colpire il ciclo cellulare. Un approccio molto utilizzato si basa sull uso di sostanza che inducono danno del DNA. Infatti le cellule tumorali in presenza di danno al DNA non arrestano il ciclo. Ciò rende tali sostanze particolarmente tossiche per le cellule che continuando a replicarsi hanno maggiori probabilità di andare incontro a morte. 7

From Helleday et al., 2008, European J of Cancer From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev 8

From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev 9