Per uso diagnostico in vitro: MycXtra MycXtra Kit di estrazione per DNA fungino REF 080-005 Uso previsto Il kit di estrazione per DNA fungino MycXtra è studiato per isolare e purificare il DNA fungino presente in campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL), espettorato e altri campioni ottenuti dalle basse vie respiratorie. Introduzione e spiegazione Questo kit è studiato per isolare il DNA di origine fungina in campioni umani ottenuti dalle basse vie respiratorie in pazienti con presunta infezione fungina. L'estrazione del DNA fungino è la prima fase d'importanza cruciale per l'analisi di un campione per uno specifico DNA fungino. Data la complessa procedura di rottura delle pareti di cellule fungine, è necessaria una combinazione di processi per ottimizzare la performance: forze meccaniche dirette nel tampone, seguite da diverse fasi di purificazione per eliminare le sostanze inibitorie della PCR, le componenti delle pareti cellulari e della matrice umana e, infine, l'eluizione nel tampone. La qualità del DNA purificato è idonea per l'analisi in Real-Time PCR. Principi della procedura Le spore e le ife fungine presenti nel campione vengono concentrate mediante centrifugazione e risospese in un piccolo volume. Il campione viene poi aggiunto ad una provetta per l'estrazione mediante "bead beating" contenente beads, soluzione lisante, soluzione di beads e soluzione per l'eliminazione degli inibitori. L'obiettivo di questa procedura è lisare i microrganismi nel campione mediante una combinazione di detergente e forza meccanica contro beads specializzate. Le componenti cellulari vengono lisate per azione meccanica su un agitatore Vortex. Dalle cellule lisate il DNA liberato si lega ad un filtro rotativo a base di silice. Il filtro viene poi lavato, quindi il DNA recuperato in una soluzione tamponata è disponibile per la successiva analisi della PCR. Contenuto del kit Sufficiente per 10 campioni di pazienti Descrizione Volume (ml) 10 provette con Soluzione di 0,55 Beads da 2 ml Soluzione S1 0,65 Soluzione IRS 2,2 Soluzione S2 2,75 Soluzione S3 14,5 Soluzione S4 3,3 Soluzione S5 1,1 10 filtri rotativi in provette da 2 ml 40 provette per microcentrifuga (2 ml) Istruzioni per l'uso Conservazione Il kit deve essere conservato a temperatura ambiente (15-30 C) fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta applicata sulla confezione. Alla scadenza il kit deve essere smaltito in conformità con le normative locali. Avvertenze e precauzioni Il kit è studiato per l'uso esclusivamente presso laboratori professionali. Per una manipolazione dei campioni clinici che prevenga la formazione di aerosol occorre avvalersi di procedure e pratiche, contenitori e dispositivi del livello di biosicurezza 2. Tutte le attività che producono aerosol devono essere condotte in una cabina di sicurezza biologica di classe II o III. Nei campioni clinici possono essere presenti microrganismi patogeni, fra cui, ma senza limitazioni, virus dell'epatite e virus dell'immunodeficienza umana. Nella manipolazione di tutte le sostanze contaminate da sangue o altri fluidi organici, vanno rispettate precauzioni standard e norme istituzionali. Il kit contiene piccole quantità di etanolo, sodio dodecil solfato, guanidina idrocloruro e guanidina isotiocianato. Su richiesta, Myconostica Ltd. mette a disposizione la scheda di sicurezza del prodotto (MSDS). Italiano 1
Materiale occorrente Microcentrifuga (10.000 x g) Centrifuga multiuso Micropipette provviste di puntali con filtro sterili (volumi necessari 40 μl 1000 μl), Agitatore Vortex Genie 2 (di Scientific Industries, ma disponibile presso fornitori locali) Piastra adattatore per agitatore Vortex (disponibile presso Myconostica, REF 080-015) per collegare le provette all'agitatore. Note sulla procedura Il processo richiede circa 1,5 ore. Se il campione è stato ottenuto da espettorato o liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL), appare viscoso, quindi è necessario un ulteriore trattamento preliminare, come descritto nella sezione Procedura per campioni di espettorato o altri campioni respiratori viscosi. Prima di cominciare leggere integralmente il protocollo. Indossare sempre guanti protettivi. Tutte le provette devono essere chiuse con i rispettivi cappucci durante le fasi di miscelazione nell'agitatore Vortex. Utilizzare micropipette per trasferire i fluidi. Accertarsi di identificare correttamente le provette quando si analizzano più campioni di pazienti. Procedura per campioni di BAL trasparenti e fluidi Nota: Se il DNA estratto deve essere utilizzato con un prodotto Myconostica MycAssay TM, si consiglia di iniziare con 2 ml di BAL. 1. Centrifugare il campione di BAL per 20 minuti a 3000 x g. Decantare il supernatante e tenerlo da parte. 2. Aggiungere 800 µl del supernatante trattenuto al pellet, risospendere e trasferire nella provetta per microcentrifuga (in dotazione). 3. Centrifugare per 2 minuti a 10.000 x g, quindi eliminare l eventuale supernatante. Risospendere il pellet della soluzione rimanente nella provetta e trasferire l intera quantità in una provetta con Soluzione di Beads da 2 ml. 4. Miscelare delicatamente nell'agitatore Vortex. 5. Controllare la Soluzione S1. Se la Soluzione S1 è precipitata, riscaldare la provetta con le mani e miscelare nell agitatore Vortex per sciogliere il contenuto. 6. Aggiungere 60 µl di Soluzione S1 alla provetta con Soluzione di Beads e capovolgere varie volte oppure miscelare brevemente nell'agitatore Vortex. 7. Aggiungere 200 µl di Soluzione IRS (soluzione per l'eliminazione degli inibitori) alla provetta con Soluzione di Beads. 8. Fissare orizzontalmente la/e provetta/e con Soluzione di Beads su un'adeguata piastra adattatore per agitatore Vortex (disponibile presso Myconostica, REF 080-015). Miscelare nell'agitatore Vortex a velocità massima per 10 minuti. 9. Centrifugare la/e provetta/e con Soluzione di Beads a 10.000 x g per 30 s. ATTENZIONE: verificare di non superare i 10.000 x g, altrimenti le provette possono rompersi. Verificare che le provette da 2 ml ruotino liberamente nella centrifuga senza sfregare. 10. Trasferire 450 µl di supernatante in una provetta per microcentrifuga pulita (in dotazione), facendo attenzione a non disturbare le beads. Smaltire la provetta con Soluzione di Beads. 11. Aggiungere 250 µl di Soluzione S2 al supernatante e miscelare nell'agitatore Vortex per 5 s. Incubare a 4 8 C per 5 minuti. 12. Centrifugare le provette per 1 minuto a 10.000 x g. 13. Trasferire l'intero volume del supernatante in una provetta per microcentrifuga pulita (in dotazione), facendo attenzione a tralasciare il pellet. 14. Aggiungere 1,1 ml (2 x 550 µl) di Soluzione S3 al supernatante (prestando attenzione perché la provetta è quasi piena). Miscelare capovolgendo la provetta. 15. Caricare all'incirca 650 μl su un filtro rotativo e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. Gettare il liquido filtrato, aggiungere altri 650 μl di supernatante al filtro rotativo e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. Ripetere la procedura finché tutto il supernatante non è passato attraverso il filtro rotativo. Nota: sono necessari complessivamente tre caricamenti per ogni campione. Nella fase finale centrifugare per 1 minuto a 10.000 x g. Gettare il liquido filtrato. 16. Aggiungere 300 µl di Soluzione S4 al filtro rotativo e centrifugare per 30 s a 10.000 x g. 17. Gettare il liquido filtrato. 18. Centrifugare di nuovo per 1 minuto per eliminare le ultime tracce di Soluzione S4, poiché questa inibirebbe la reazione PCR. 19. Posizionare con cautela il filtro rotativo su una nuova provetta per microcentrifuga pulita (in dotazione). Evitare di trascinare la Soluzione S4 sul filtro rotativo. 20. Aggiungere 40 μl di Soluzione S5 al centro della membrana del filtro rotativo. Lasciare a temperatura ambiente per 2 minuti. 21. Centrifugare per 30 s a 10.000 x g. Italiano 2
22. Gettare il filtro rotativo. Il DNA nella provetta è ora pronto per essere utilizzato in un'applicazione PCR. Conservare a 2 8 C al massimo per 5 giorni, altrimenti riporre il DNA in congelatore a -20 C. 23. Possono essere processati fino a 10 campioni di BAL. Se per una data analisi non vengono utilizzate tutte le componenti, riposizionare le componenti del kit nella confezione originale. Non miscelare le componenti di diversi lotti. 24. Terminata la processazione, smaltire le componenti usate del kit in conformità con le normative locali in materia di salute, sicurezza e ambiente. Procedura per campioni di espettorato o altri campioni respiratori viscosi Si consiglia di utilizzare il kit di digestione/decontaminazione per la processazione di campioni micobatterici BD BBL MycoPrep (cat. n 240862) con il protocollo MycXtra per la preparazione dei campioni di espettorato. La procedura di seguito descritta è stata modificata in modo da adattarla ai requisiti di caricamento dei campioni del kit MycXtra. Precauzioni Il reagente NALC-NaOH nel kit di digestione/decontaminazione per la processazione di campioni micobatterici BD BBL MycoPrep contiene forti alcali e può provocare gravi ustioni. Togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Occorre indossare guanti protettivi e una mascherina per gli occhi/il viso. L'NaOH è irritante per gli occhi e la pelle. In caso di contatto con gli occhi o la pelle, sciacquare immediatamente con un prodotto di lavaggio oculare o con acqua corrente per almeno 15 minuti e consultare un medico. In caso di ingestione, somministrare latte, albume d'uovo o grandi quantità d'acqua e consultare un medico. Attenzione: rompere la fiala nel centro una sola volta. Non manipolare ulteriormente la fiala, perché il flacone in plastica potrebbe perforarsi e causare lesioni. Istruzioni per la conservazione: al ricevimento conservare a 15 30 C. Non congelare. Aprire soltanto al momento dell'utilizzo. Deterioramento del prodotto: Non utilizzare i reagenti se le fiale sono danneggiate oppure se presentano segni evidenti di deterioramento. Non utilizzare il tampone fosfato se le confezioni sono lacerate o aperte. Procedura 1. Preparare la soluzione di tampone fosfato BBL MycoPrep. Versare il contenuto di una busta di tampone fosfato in un contenitore in vetro con tappo a vite, quindi riempire fino alla tacca di 500 ml con acqua per biologia molecolare. Sterilizzare, con tappo allentato, in autoclave a 121 C per 15 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente e avvitare il tappo. 2. Svitare con cautela il tappo a vite del flacone del reagente BBL MycoPrep. Collocare la fiala nel flacone, far uscire l'aria in eccesso dal flacone e avvitare il tappo. Tenendo il flacone in posizione verticale, comprimerlo fino a rompere la fiala. Agitare delicatamente per disciogliere il NALC, evitando un'eccessiva agitazione. UNA VOLTA CHE LA FIALA SI È ROTTA, UTILIZZARE IL REAGENTE ENTRO 24 ORE. 3. In una cabina di sicurezza biologica (almeno di classe 2) aggiungere in una provetta per centrifuga graduata da 50 ml con tappo a vite il campione e il doppio della quantità di soluzione di NALC-NaOH attivata in base al volume dell'espettorato. Ad esempio, aggiungere 4 ml di soluzione di NALC-NaOH attivata a circa 2 ml di campione. 4. Chiudere con il tappo la provetta per centrifuga e miscelare su un agitatore Vortex finché il campione non si è sciolto. Se il campione è particolarmente viscoso, aggiungere altra soluzione di NALC-NaOH e ripetere la miscelazione. 5. Far riposare il miscuglio a temperatura ambiente per 15 minuti agitando delicatamente di tanto in tanto. 6. Aggiungere il tampone fosfato preparato nella provetta per centrifuga fino alla tacca di 35 ml e miscelare. Centrifugare per 20 minuti a 3000 x g. 7. Decantare con cautela tutto il supernatante liquido. Con una micropipetta rimuovere delicatamente il supernatante rimasto che non è stato decantato. 8. Aggiungere 800 µl di tampone fosfato preparato e risospendere il sedimento. Trasferire l'intera quantità in una provetta per microcentrifuga. 9. Seguire la procedura per il BAL a partire dalla fase 3. Italiano 3
Caratteristiche di performance e limiti Selettività analitica Utilizzando un kit MycXtra è stato estratto DNA da BAL clinico, da espettorato e da altri campioni respiratori in cui, mediante coltura o microscopia, erano stati identificati i seguenti organismi: Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Aspergillus flavus, Penicillium spp. e Pneumocystis jirovecii. Il DNA è stato rilevato utilizzando il kit Myconostica FXG TM : RESP (Asp +) per la determinazione rapida in Real-Time PCR del DNA di Aspergillus e Pneumocystis in campioni respiratori clinici. Eliminazione di sostanze interferenti I comuni farmaci utilizzati nel trattamento delle malattie respiratorie, quali tobramicina, colistina solfato, dornasi (DNAsi), salmeterolo e altre sostanze, ad es. soluzione fisiologica normale (0,9%), eparina e acido tannico, possono inibire i dosaggi in Real-Time PCR. Tali sostanze vengono completamente eliminate con il processo di estrazione MycXtra. Prove di valutazione della performance con campioni clinici hanno permesso di indicare che nei campioni respiratori esistono alcuni inibitori della PCR di natura oscura, che non vengono eliminati durante il processo di estrazione. Limite di rilevamento e ripetitibilità 45.00 40.00 35.00 Valore Ct 30.00 25.00 20.00 15.00 Tutti i dati: concentrazione di spore vs valore Ct 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 Numero di spore nell estrazione DNA estratto con il kit MycXtra da campioni contenenti 10 spore. Le estrazioni delle spore di Aspergillus fumigatus in soluzione fisiologica sono state eseguite da 2 operatori nel corso di 5 giorni. Il DNA è stato rilevato con il kit Myconostica FXG TM : RESP (Asp +), che presenta un limite di rilevamento di circa 1 genoma di A. fumigatus. I risultati sono illustrati nella Figura 1. Il coefficiente di variazione totale è stato calcolato intorno al 2,4%. L efficienza di estrazione media si è attestata all 8%. Figura 1. Concentrazione di spore di Aspergillus fumigatus versus il valore Ct in Real-Time PCR Riproducibilità Ct Between batch extraction comparison 28.00 27.00 26.00 25.00 24.00 23.00 22.00 21.00 Batch 1 Batch 2 Batch 3 Sono state eseguite ventiquattro estrazioni separate utilizzando ciascuno dei tre lotti dei kit MycXtra con una sospensione standard di spore di Aspergillus fumigatus. Con il kit Myconostica FXG TM : RESP (Asp +) è stata poi eseguita la Real-Time PCR per stabilire la variabilità interlotto e intralotto per l'estrazione del DNA di Aspergillus fumigatus. I risultati sono illustrati nella Figura 2. 20.00 1 2 3 4 5 6 7 8 Extractions Figura 2. Variabilità di estrazione interlotto e intralotto Valutazione della performance Determinazione della specie Aspergillus I campioni respiratori (BAL) raccolti da 2 ospedali, estratti con il kit MycXtra e conservati, sono stati utilizzati per valutare la performance del kit MycAssay TM Aspergillus con campioni clinici. Sono stati operati dei confronti con la diagnosi clinica. È stato stabilito il valore cut-off di un Ct pari a 36,0 dopo aver esaminato una serie di dati di campioni raccolti da diversi siti e diverse popolazioni di pazienti. Sono stati valutati diversi cut-off per la probabilità di differenziare lo stato patologico dallo stato non patologico. PCR versus diagnosi clinica Diagnosi clinica positiva Diagnosi clinica negativa PCR positiva 31 1 0,97 PPV PCR negativa 2 10 0,83 NPV 0,94 0,91 Sensibilità Specificità Lo 0,8% dei campioni testati conteneva inibitori della PCR, come riportato dall IAC, in seguito ad estrazione con il kit MycXtra. Italiano 4
Determinazione di Pneumocystis jirovecii I campioni clinici ottenuti mediante lavaggio broncoalveolare (BAL), che sono stati raccolti presso 2 ospedali, sottoposti ad estrazione con il kit MycXtra e conservati, sono stati utilizzati per valutare la performance del kit MycAssay TM Pneumocystis. I risultati PCR sono stati confrontati con la microscopia a immunofluorescenza. PCR vs. diagnosi microscopica Microscopia positiva Microscopia negativa PCR positiva 45 8 0,85 PPV PCR negativa 2 33 0,94 NPV 0,96 0,80 Sensibilità Specificità La tabella rappresenta i dati ottenuti da pazienti con diagnosi di HIV, pazienti senza infezione da HIV e pazienti con stato HIV sconosciuto. I pazienti con polmonite da Pneumocystis presentano una carica fungina rilevabile molto variabile; minore è il valore Ct, maggiore è la probabilità della malattia. I pazienti affetti da HIV e polmonite da Pneumocystis tendono a presentare una maggiore carica fungina rilevabile rispetto ai pazienti senza infezione dal virus HIV, ma esiste una considerevole sovrapposizione. Il diagramma di dispersione nella figura 3 evidenzia questa sovrapposizione. A scopo di completezza, dato che il set di dati nella tabella include pazienti il cui stato HVI è sconosciuto, il diagramma di dispersione nella figura 3 (colonna 3) comprende anche questo gruppo di pazienti: Category 1 = HIV+ / Microscopy+ ; 2 = HIV- / Microscopy+ ; 3 = HIV Unknown / Microscopy+ ; 4 = All Microscopy- Figura 3: Diagramma di dispersione dei valori Ct ottenuti da DNA estratto da campioni respiratori di pazienti. Sono rappresentati quattro gruppi. Lab21,184 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0GA, United Kingdom. Telephone: +44 (0) 1638 552 882 Facsimile: +44 (0) 1638 552 375 Email: productsupport@lab21.com Italiano 5