COMUNICAZIONE INTERCELLULARE

COMUNICAZIONE INTERCELLULARE Recettore Cellula segnalante Cellula target Molecola che segnala Cellula segnalante Recettore Cellula target

SEGNALI INTERCELLULARI Recettori di superficie La molecola segnalante è idrofilica Recettori intracellulari Carrier La molecola segnalante è piccola e idrofobica

FATTORI DI CRESCITA Fattori di crescita Recettori

FATTORI DI CRESCITA STIMOLO PARACRINO Cellula segnalante Cellula target STIMOLO AUTOCRINO

FATTORI DI CRESCITA Proliferazione Differenziamento

FATTORI DI CRESCITA Chi produce? Chi risponde? Fattore Sorgente principale Attività primaria PDGF piastrine, cellule endoteliali, promuove la proliferazione del tessuto placenta connettivo, della glia e delle cellule muscolari liscie EGF ghiandola sottomandibolare promuove la proliferazione del mesenchima, di cellule gliali e di cellule epiteliali TGF-α cellule trasformate, macrofagi fibroblasti, osteoclasti FGF endotelio attivato e molti altri fibroblasti, cellule endoteliali, glia, tipi cellulari cheratinociti, neuroni NGF astrociti promuove la crescita e la sopravvivenza neuronale Eritropoietina cellule del rene promuove la proliferazione e il differenziamento degli eritrociti IGF-I cellule del fegato promuove la proliferazione di molti tipi cellulari. Si chiama anche Somatomedina C

FATTORI DI CRESCITA? Come fa una interazione tra due molecole sulla superficie cellulare a raggiungere il nucleo per attivare la trascrizione di mrna e la traduzione proteica?

STUDIO INTERAZIONE RECETTORE-LIGANDO 1. Analisi dell equilibrio di legame a saturazione 2. Cross-linking + 125 I + iodogen bolton-hunter lactoperoxidase 125 I 125 I 125 I 125 I

Analisi dell equilibrio di legame a saturazione (Scatchard plot) 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y T = binding totale NSB = binding non specifico (non saturabile) SB = binding specifico http://www.pdg.cnb.uam.es/cursos/barcelona2002/pages/farmac/comput_lab/guia_glaxo/chap3b.html

Analisi dell equilibrio di legame a saturazione (Scatchard plot) Cellule GM7373 180.000 cells/pozzetto in piastra da 48 pozzetti Aggiunti 100 microlitri di terreno/pozzetto contenente 125 I-FGF2 4 ng/ml, 8 ng/ml, 16 ng/ml, 40 ng/ml, 80 ng/ml, 100 ng/ml +/- FGF2 300x Campioni in quintuplicato 125 I-FGF2: attività specifica 358 CPM/fmole I VALORI SONO OTTENUTI DA HOT medio COLD medio [ 125 I-FGF2] CPM caricate Lavaggio F ph4 B B/F 4 ng/ml 9936 8632 24.11 245 0.68 0.028 8 ng/ml 14306 12975 36.24 302 0.84 0.023 16 ng/ml 28995 26441 73.85 411 1.15 0.0156 40 ng/ml 78385 72462 202.40 563 1.57 0.0078 80 ng/ml 154666 143609 401.14 1063 2.97 0.0074

F B B/F B/F 0,030 24.11 0.68 0.028 0,025 0,025 36.24 0.84 0.023 0,020 0,020 73.85 202.40 1.15 1.57 0.0156 0.0078 0,015 0,015 0,010? 401.14 2.97 0.0074 0,010 0,005 0,005 0,000 0,6 0,5 0,8 1,0 1,0 1,5 1,2 2,0 1,42,5 1,6 3,0 Bound Bound (fmole) (fmole) B rappresenta il coefficiente angolare Quando Y=0 X=1,89 fmoli N rec/cell = 1.89 x 6.023 x 10 23 x 10-15 = 1,8 x 10 5 6.3 x 103 Ka= 1/B = 44.68 fmoli in 100 microlitri, Che equivale a 446 pm

Cross-linking 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y X 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ) is a homobifunctional, water-soluble, non-cleavable and membrane impermeable cross-linker. It contains an amine-reactive N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) ester at each end of an 8-carbon spacer arm. NHS esters react with primary amines at ph 7-9 to form stable amide bonds, along with release of the N-hydroxysulfosuccinimide leaving group. Proteins, including antibodies, generally have several primary amines in the side chain of lysine (K) residues and the N-terminus of each polypeptide that are available as targets for NHS-ester cross-linking reagents. http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldid=02030212

Cross-linking 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF 125 I-GF Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y + sample buffer FGF/FGFR SDS-PAGE Dry gel AUTORADIOGRAFIA

ATTIVAZIONE DEL SEGNALE OUT TK IN

La trasduzione del segnale si perpetra attraverso eventi di fosforilazione

* + fattore di crescita SDS-PAGE * * * * Western blot

La trasduzione del segnale si protrae per integrazione dell informazione

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RECETTORI PER FATTORI DI CRESCITA Recettori tirosino-chinasici

PROTEINE CHE LEGANO PDGFR ATTIVATO

Come identificare proteine legate al recettore? Immunoprecipitazione Lisi in tampone adeguato

Immunoprecipitazione Gli anticorpi si legano specificamente alle proteine A o G di staffilococco tramite la porzione Fc Lisato + anticorpo Lavaggio Tampone Eluizione

Immunoprecipitazione

FGFR1 signal transduction Shc FRS2 P P P P Y766 Y463 FGF2 FGF2 P Y730 Y653 Y654 P P Y653 Y654 Y730 P P Y583 Y585 P Y463 P P Y583 Y585 P P Y766 PLC- γ PLC-γ Crk Crk Src 80K-H Shp-2 Raf Ras Nucleus Jun-D OUT IN MAP kinase pathway Cytoplasm

Specifiche tirosine fosforilate legano specifiche molecole

I trasduttori intracellulari posseggono domini modulari

Dominio SH2 Il nome deriva da una regione omologa nell oncogene src (src homology 2). I domini SH2 sono moduli di circa 100 aminoacidi che legano residui di tirosina fosforilata. La specificità di legame dipende dagli aminoacidi fiancheggianti la tirosina fosforilata.

Proteine con domini SH2

Dominio PTB I domini leganti tirosine fosforilate sono moduli di 100-150 aa che legano motivi Asn-Pro-X-Tyr. In alcuni casi (Shc) la tirosina deve essere fosforilata. Dominio PTB di Shc legato al peptide HIIENPQpYFS

Dominio SH3 Il nome deriva da una regione omologa nell oncogene src (src homology 3). I domini SH3 generalmente legano peptidi ricchi in prolina (Pro-X-X-Pro) Dominio SH3 dell omologo di Grb2 legato al peptide PPPVPPRRR di Sos.