DOSSIER ALOA Coltura ed identificazione di L.monocytogenes Biolife Tradizione ed innovazione in microbiologia Pag.1 di 22
INDICE DEL DOSSIER PRODOTTI BIOLIFE PER LA COLTURA E L IDENTIFICAZIONE DI L.MONOCYTOGENES pag 3 LISTERIA MONOCYTOGENES 4 LISTERIOSI 4 LISTERIA MONOCYTOGENES NEGLI ALIMENTI 5 ISOLAMENTO 5 TERRENO ALOA 6 DETERMINAZIONE DI L.MONOCYTOGENES (ISO 11290-1) 7 ENUMERAZIONE DI L.MONOCYTOGENES (ISO 11290-2) 8 DETERMINAZIONE DI L.MONOCYTOGENES (METODO RAPIDO AFNOR) 8 DETERMINAZIONE DI L.MONOCYTOGENES (METODO MPN O.M. 7/12/93) 9 TEST DI CONFERMA (ISO 11290) 10 TEST DI CONFERMA CON MONOCYTOGENES ID DISCS 10 TEST DI CONFERMA CON NONOCONFIRM TEST 11 BIBLIOGRAFIA 12 TERRENI DI COLTURA E KIT PER L IDENTIFICAZIONE (formule e metodi di preparazione) 13. Pag.2 di 22
Prodotti Biolife per la coltura e l identificazione di L.monocytogenes Coltura ARRICCHIMENTO TERRENI IN POLVERE E SUPPLEMENTI 401596 LISTERIA FRASER BROTH BASE, 500 G (9.1 L) 5 KG (91 L) 401594 LISTERIA FRASER BROTH BASE HALF CONCENTRATION, 500 G (9.1 L) 5 KG (91 L) 4240056 FERRIC AMMONIUM CITRATE SUPPLEMENT, 10 FIALE, CIASCUNA PER 500 ML DI TERRENO 401495 FRASER BROTH BASE 500 G (8.7 LT) 5 KG (87 L) 4240043 FRASER SELECTIVE SUPPLEMENT 10 FIALE, CIASCUNA PER 500 ML DI TERRENO 4240044 FRASER HALF SELECTIVE SUPPLEMENT 10 FIALE, CIASCUNA PER 225 ML DI TERRENO 401597 LISTERIA ENRICHMENT BROTH BASE (UVM), 500 G (9.2 LT) 5 KG (92 L) 4240036 UVM 1 ANTIMICROBIC SUPPLEMENT, 10 FIALE, CIASCUNA PER 500 ML DI TERRENO 4240037 UVM 2 ANTIMICROBIC SUPPLEMENT, 10 FIALE, CIASCUNA PER 500 ML DI TERRENO 401601 LISTERIA ENRICHMENT BROTH 100G (2.77 L)-500G (13.8 LT)- 5 KG (138L) 401601B LISTERIA BUFFERED ENRICHMENT BROTH 100 G (2.1 LT) - 500 G (10.5 LT) 401601S LISTERIA ENRICHMENT BROTH LOW ACRIFLAVINE 100G (2.77 L)-500G (13.8 LT) TERRENI PRONTI PER L USO 551278 LISTERIA FRASER BROTH PROVETTE 20 X 10 ML 5115942 LISTERIA FRASER BROTH BASE HALF CONCENTRATION FLACONI 6 X 90 ML 5115943 LISTERIA FRASER BROTH BASE HALF CONCENTRATION FLACONI 6 X 225 ML 56AEB910913 DILUBAG FRASER BROTH BASE HALF CONCENTRATION 3 LITRI 56AEB910915 DILUBAG FRASER BROTH BASE HALF CONCENTRATION 5 LITRI 5116013 LISTERIA ENRICHMENT BROTH FLACONI 6 X 225 ML ISOLAMENTO TERRENI IN POLVERE E SUPPLEMENTI 401605 AGAR LISTERIA ACC. TO OTTAVIANI & AGOSTI (ALOA), 100 G (1,4 L) - 500 G (7,1 L) 423501 ALOA ENRICHMENT SELECTIVE SUPPLEMENTS, 4+4 FLACONI, CIASCUNO PER 500 ML 401601 LISTERIA PALCAM AGAR BASE 100 G (1,4 L) - 500 G (7,1 L) 4240042 PALCAM ANTIMICROBIC SUPPLEMENT 10 FIALE, CIASCUNA PER 500 ML DI TERRENO 401605 LISTERIA OXFORD AGAR BASE 100 G (1,4 L) - 500 G (7,1 L) 4240038 OXFORD ANTIMICROBIC SUPPLEMENT 10 FIALE, CIASCUNA PER 500 ML DI TERRENO 4240039 MOX-COL ANTIMICROBIC SUPPLEMENT 10 FIALE, CIASCUNA PER 500 ML DI TERRENO TERRENI PRONTO PER L USO 541605 AGAR LISTERIA ACC. TO OTTAVIANI & AGOSTI (ALOA), 20 PIASTRE PRONTE ALL USO 501605P AGAR LISTERIA ACC. TO OTTAVIANI & AGOSTI (ALOA), 5 PIASTRE PRONTE ALL USO DIAM 150 MM 541601 LISTERIA SELECTIVE AGAR (PALCAM) 20 PIASTRE PRONTE ALL USO 541605 LISTERIA SELECTIVE AGAR (OXFORD) 20 PIASTRE PRONTE ALL USO Identificazione da coltura 193005 MONOCYTOGENES ID DISCS 50 test Dischi impregnati di un substrato specifico per aminopeptidasi per la differenziazione di L.monocytogenes in 2 ore e reattivo rilevatore con p-dimetilamminobenzaldeide 193000 MONOCONFIRM TEST 24 test Micrometodo per l'identificazione biochimica di Listeria spp. e la differenziazione di L.monocytogenes Biolife Italiana S.r.l. Viale Monza 272, 20128 Milano. Tel. n 02-25209.1 - Fax n 02-2576428 E-mail : biolife@masciabrunelli.it - Internet: www.biolifeitaliana.it Pag.3 di 22
LISTERIA MONOCYTOGENES Al genere Listeria appartengono 6 specie: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seegligeri e L. grayi. Sebbene sia L. ivanovii che L. monocytogenes siano patogene per il topo, solo L. monocytogenes è associata in modo consistente alla patologia umana. Listeria monocytogenes è un corto bacillo Gram positivo non capsulato, asporigeno, anaerobio facoltativo, catalasi positivo, con capacità di crescere sui terreni colturali più comuni entro un vasto intervallo di temperatura. L. monocytogenes è mobile a temperature comprese tra 18 e 22 C con caratteristico movimento largo, oscillatorio e rotatorio, immobile a 37 C; le dimensioni sono 1-4 µm / 0,5 µm ed è osservabile al microscopio in corte catene o piccoli ammassi. I ceppi che appaiono all osservazione microscopica come larghi bacilli, cocchi o bacilli con rapida mobilità non devono essere considerati come appartenenti al genere Listeria. L. monocytogenes è un microrganismo saprofita largamente presente in natura ubiquitario nell ambiente, essendo stato isolato nel suolo, nell acqua, nei vegetali, nelle acque di scarico, nell intestino e nel tratto genitale di portatori sani. E responsabile di infezioni sporadiche severe nell uomo e nell animale; è invasivo essendo capace di attraversare la placenta e di penetrare nel sistema nervoso centrale (meningoencefaliti); è un batterio intracellulare facoltativo capace di sopravvivere e di crescere nella maggior parte delle cellule dell ospite infetto. LISTERIOSI La listeriosi è una setticemia d origine intestinale con rischio di infezione fetoplacentale e di meningoencefalite. Negli adulti si instaura la malattia per contatto con materiale infetto (carni, prodotti a base di latte, materiali contaminati da feci di animali infetti) o per ingestione di alimenti contaminati. La dose infettiva di Listeria è piuttosto bassa: bastano infatti 100 cellule batteriche per grammo di cibo a causare infezione. La malattia colpisce soprattutto pazienti debilitati (soggetti immunodepressi, pazienti con patologie epatiche, anziani) e donne in gravidanza. Dopo un incubazione di 3-8 giorni la malattia si manifesta con febbre (batteriemia), cefalea (forme meningo-encefalche); altre manifestazioni cliniche sono: ascessi localizzati interni ed esterni, endocardite, lesioni cutanee lesioni granulomatose del fegato e di altri organi. La listeriosi neonatale può verificarsi per passaggio transplacentale del microrganismo, nei casi di sepsi della madre o per colonizzazione delle vie genitali e conseguente infezione del feto durante il parto. La listeriosi nei soggetti immunocompetenti è quasi sempre limitata a forme gastroenteriche con nausea, vomito, diarrea e febbre, qualche ora dopo l ingestione di alimenti contaminati, normalmente senza complicanze neurologiche. Gli antibiotici più attivi sembrano essere ampicillina e gentamicina; gli insuccessi clinici non indicano necessariamente il fallimento della terapia, poiché in molti casi la terapia viene iniziata Pag.4 di 22
tardivamente proprio per la difficoltà di porre una corretta diagnosi. La listeriosi può essere positivamente diagnosticata solo con l isolamento del microrganismo dal sangue, dal liquido cefalorachidiano o dalle feci (sebbene quest ultimo isolamento sia difficile e di limitato valore diagnostico). L. monocytogenes è un importante patogeno anche in medicina veterinaria poiché provoca encefalite, mastite ed aborto nelle pecore e nei bovini e casi di infezione contratti dal personale che manipola animali infetti (Cain, 1986). LISTERIA MONOCYTOGENES NEGLI ALIMENTI Numerose sono le segnalazioni di isolamenti nei prodotti alimentari, tra cui carne cruda (Kwantes e Isaac. 1971; Gitter, 1976; Eliscerova e coll., 1979), latte (Rodriguez e coll., 1985; Garayzabal e coll., 1986; Hayes e coll., 1986; Donnelly e coll., 1986), latte pastorizzato (Fleming e coll., 1985), insalata di verdure crude (Scjlech e coll, 1983), formaggi (James e coll., 1985; V. Johnston e coll., 1986; Doyle e Schoeni, 1986), cioccolato (Dalton et al., 1997), insalata di riso (Salamina et al., 1996) scampi (Riedo et al., 1994) insalata e tonno (Aureli e coll. 2000). In un documento FDA/USDA/CDC (2003) nel quale si esaminano gli episodi epidemici di tossinfezioni alimentari sostenute da L.monocytogenes negli USA e in altri paesi, gli alimenti maggiormente coinvolti risultano essere i prodotti lattiero caseari, seguiti dalla carne, dagli alimenti di mare e dagli alimenti grezzi. L. monocytogenes è in grado di sopravvivere per settimane o addirittura per mesi sia in ambienti secchi che umidi; ha la capacità di moltiplicarsi a temperature di frigorifero, non è influenzata dai conservanti alimentari quali il sodio cloruro ed il nitrito (Shahamat e coll., 1980), sopravvive ai processi di produzione del latte in polvere (Doyle e coll., 1985), resiste alle procedure di pastorizzazione (Berns e Girard, 1958; Doyle e coll, 1987) quando non siano effettuate secondo la procedura prevista dall FDA, o a causa della situazione intracellulare del batterio o della ricchezza in materia grassa del mezzo in cui il batterio si trova. I casi di listeriosi, secondo i dati riportati da Anon (1986) per gli animali e da Mc Lauchlin (1987) per l uomo, sono in continuo aumento fin dagli anni successivi al 1970. Indagini epidemiologiche condotte negli USA hanno evidenziato che annualmente L. monocytogenes è responsabile di circa 1800 episodi enterici dei quali circa 450 hanno esito letale (Schuchat, H.F., 1992). Secondo dati più recenti (FDA/USDA/CDC, 2003) negli USA, l incidenza dell infezione da L.monocytogenes è di 3,4 casi per ogni milione di abitanti. Negli animali questo incremento può essere spiegato da modificazioni nelle pratiche agricole di fertilizzazione dei suoli (Watson, 1985) e dall impiego sempre più massiccio di prodotti alimentari conservati nei silos (Fenlon, 1985). ISOLAMENTO L isolamento di L. monocytogenes dagli alimenti di origine animali ha sempre presentato notevoli difficoltà a causa della flora contaminante ed in passato l unico metodo di arricchimento utilizzato era quello a freddo che sfruttava le capacità psicrofile di questo microrganismo. Oggi vi sono innumerevoli procedure proposte e tra queste segnaliamo i metodi ISO, FDA, USDA. Il protocollo FDA (2003) prevede un arricchimento in Listeria Enrichment Broth, tamponato con fosfato, senza agenti selettivi per 4 ore a 30 C seguito da un secondo arricchimento nello stesso terreno ma con l aggiunta di agenti selettivi (acriflavina, acido nalidissico e cicloeximide), per 44 ore a 30 C e completato dall isolamento in uno dei seguenti terreni: Oxford, PALCAM, LPM con esculina e ferro citrato, MOX. Insieme ad uno dei terreni classici è ammesso l impiego di un terreno cromogeno a scelta tra BCM, ALOA, CHROMagar Pag.5 di 22
Listeria, Rapid' L. mono. La metodica USDA fu la prima ad introdurre l arricchimento selettivo in 2 fasi. Originariamente la metodica prevedeva l impiego dei terreni UVM1 e UVM2; in seguito il brodo UVM2 è stato sostituito dal Fraser Broth. Il protocollo ISO prevede un primo arricchimento in Fraser Broth Half Concentration, un secondo arricchimento in Fraser Broth e l isolamento su terreno ALOA e PALCAM o Oxford. Va infine ricordata l O.M. 7/12/1993 che decreta i limiti di tolleranza di L. monocytogenes in alcuni prodotti alimentari da sottoporre a cottura che stabilisce una dettagliata metodica che prevede un pre-arricchimento non selettivo, un arricchimento selettivo in Fraser Broth e l isolamento su Oxford Agar. IL TERRENO ALOA Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti (ALOA) è un terreno selettivo, cromogenico e differenziale per la ricerca ed il conteggio di Listeria monocytogenes negli alimenti ed in altri campioni. L azione selettiva è dovuta alla presenza nel terreno di base del litio cloruro ed all aggiunta della miscela antimicrobica del supplemento selettivo contenente ceftazidime, polimixina B, acido nalidissico e cicloeximide. L azione differenziale è dovuta alla presenza nel terreno del composto cromogenico X- glucoside quale substrato per l evidenziazione dell enzima ß-glucosidasi, comune a tutte le specie di Listeria. L azione differenziale specifica è ottenuta con un substrato specifico per la fosfolipasi C (PIPLC), propria della sola specie L.monocytogenes e di alcuni ceppi di L.ivanovii. Con l azione combinata dei due substrati è possibile differenziare le seguenti colonie: L. monocytogenes: colonie verde-blu circondate da un alone opaco. Listeria spp. non monocytogens : colonie verde-blu senza alone Il terreno ALOA è raccomandato dalla norma ISO 11290-1 Amd.1:2004 (determinazione di L.monocytogenes negli alimenti) e dalla norma ISO 11290-2 Amd1:2004 (enumerazione di L.monocytogenes negli alimenti). Il protocollo di lavoro messo a punto da Biolife con il terreno di coltura ALOA (validato AFONOR nel settembre 2000) semplifica notevolmente la procedura analitica prevedendo un unico arricchimento selettivo e l isolamento su ALOA. Numerosi lavori scientifici riguardanti il terreno ALOA sono apparsi negli ultimi anni, allo scopo di compararne le performances in rapporto ai terreni tradizionali o ad altri terreni cromogenici e per verificarne le caratteristiche di sensibilità e specificità. Di seguito sono riportate brevi note dei lavori salienti: Leclercq A. ( 2004) - L autore riporta che ALOA è risultato il terreno migliore tra i quattro esaminati e che la sua introduzione nei metodi d analisi in sostituzione di Oxford e PALCAM aumenta l isolamento ed il conteggio dei ceppi atipici di L.monocytogenes Gnanou Besse N e coll.( 2004) - Gli autori hanno messo a punto un metodo per filtrazione, con coltura dei filtri su terreno ALOA, per il conteggio di L.monocytogenes in campioni con basse cariche. Il metodo è risultato più preciso di quello riportato da ISO 11290-2. Bauwens L e coll. (2003) - Gli autori riportano una superiorità del terreno ALOA rispetto al terreno PALCAM e che i Monocytogens ID Disc Biolife hanno identificato correttamente tutti i ceppi di L.monocytogenes esaminati. Gracieux P. e coll ( 2003.) - Gli autori riportano con ALOA una percentuale di recupero superiore dei ceppi virulenti, ipovirulenti ed avirulenti di L.monocytogenes rispetto al terreno PALCAM e ad altro terreno cromogeno. Sacchetti R. e coll. (2003) - In una sperimentazione su 132 campioni di alimenti, ALOA ed un secondo terreno cromogeno consentono di determinare L.monocytogenes in tempi più rapidi e con maggiore sensibilità e specificità rispetto al terreno PALCAM. Gli autori riportano risultati di conferma con Monocytogens ID Disc Biolife, comparabili con quelli delle gallerie del commercio ma più rapidi. Pag.6 di 22
Moroder L. (2002) - Trial di 10 laboratori italiani per validare i terreni cromogeni in sostituzione di PALCAM ed Oxford nella norma ISO 11290-2 (conteggio). Il coordinatore del gruppo di lavoro riporta che i migliori risultati sono stati ottenuti con ALOA. Beumer R.R. (2001) - Trial di 17 laboratori in 13 paesi europei per validare i terreni cromogeni in sostituzione di PALCAM ed Oxford nella norma ISO 11290-1 (isolamento). Il coordinatore del gruppo di lavoro riporta che i migliori risultati sono stati ottenuti con ALOA e Rapid L.mono. Vlaemynck G. e coll (2000) - L introduzione del terreno ALOA nelle procedure standard d isolamento di L.monocytogenes in aggiunta ai terreni tradizionali, aumenta le percentuali di recupero e riduce i tempi ed i costi d analisi. Artault L. e coll. (2000) Trial di 15 laboratori francesi per verificare le performances del terreno ALOA al fine della validazione AFNOR. Gli autori hanno valutato la sensibilità (<10 UFC/25 g), la specificità (98,8%) e l accuratezza (100%). Mioni R. e coll. (1998) - Studio comparativo del terreno ALOA con il terreno PALCAM, da cui risulta un aumento del 14,7% del ritrovamento di campioni positivi con ALOA. DETERMINAZIONE DI L.MONOCYTOGENES (METODO ISO 11290-1) Eseguire l arricchimento del campione in Fraser Broth Half Concentration, con un rapporto campione/terreno liquido 1:10 (es. 25 g di campione + 225 ml di Fraser Broth Half Concentration) ed incubando a 30 C per 24 ± 3 ore. Inoculare un ansata di brodocoltura su una piastra di terreno ALOA e su una piastra di un altro terreno a scelta (PALCAM o Oxford). Esaminare dopo incubazione a 37 C per 24 ± 3 ore e, se non vi fossero colonie tipiche o se vi fosse crescita scarsa o nessuna crescita, re-incubare per altre 24 ± 3 ore. Eseguire una subcultura di 0,1 ml dal brodo Fraser Half in una provetta contenente 10 ml di Fraser Broth. Incubare a 37 C per 48 ± 3 ore. Inoculare con un ansata di brodocoltura una piastra di terreno ALOA ed una piastra di un altro terreno a scelta (PALCAM oppure Oxford). Esaminare dopo incubazione a 37 C per 24 ± 3 ore e, se non vi fossero colonie tipiche o se vi fosse crescita scarsa o nessuna crescita, re-incubare per altre 24 ± 3 ore. Colonie tipiche su ALOA: L. monocytogenes: colonie verde-blu circondate da un alone opaco; Listeria spp. non monocytogens : colonie verde-blu senza alone Confermare le colonie con i test raccomandati dalla norma ISO. Colonie di L.monocytogenes (verde-blu con alone opaco) e L.innocua (colonie verdeblu senza alone su ALOA. Pag.7 di 22
ENUMERAZIONE DI L.MONOCYTOGENES (METODO ISO 11290-2) Il metodo ISO 11290-2 (conteggio di L.monocytogens) raccomanda la seguente procedura: Preparare una sospensione del campione in Buffered Peptone Water o in Fraser Broth Half Concentration. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Inoculare con 0,1 ml di brodocoltura una piastra di terreno ALOA. Esaminare dopo incubazione a 37 C per 24 ± 2 ore e, se non vi fossero colonie tipiche, reincubare per altre 24 ± 2 ore. Contare come L.monocytogenes le colonie tipiche confermate con i test descritti dalla norma ISO. Colonie tipiche su ALOA: L. monocytogenes: colonie verde-blu circondate da un alone opaco; Listeria spp. non monocytogens : colonie verde-blu senza alone DETERMINAZIONE DI L.MONOCYTOGENES ISO 11290-2 25 g + 225 ml Fraser Half Concentration Incubare a 30 C per 24 ore ENUMERAZIONE DI L.MONOCYTOGENES ISO 11290-2 25 g + 225 ml Fraser Half Concentration Oppure 25 g + 225 ml Buffered Peptone Water 0,1 ml + 10 ml Fraser Broth Incubare 48 h a 37 C Seminare su ALOA e PALCAM o OXFORD Incubare 1 ora a temp. ambiente Seminare 0,1 su ALOA Seminare su ALOA e PALCAM o OXFORD Incubare 24 h a 37 C Incubare 24 h a 37 C SI Colonie tipiche NO SI Colonie tipiche NO Conferma SI Re-incubazione 24 h a 37 C Conferma SI Reincubazione Contare le colonie tipiche confermate con i test indicati nella norma DETERMINAZIONE DI L.MONOCYTOGENES (METODO RAPIDO AFNOR) Il metodo semplificato da noi raccomandato e che ha ottenuto, in Francia, la validazione AFNOR (Artault, 2000) è il seguente: Eseguire l arricchimento del campione in Fraser Broth Half Concentration, secondo le metodiche usuali con un rapporto campione/terreno liquido 1:10 (es. 25 g di Pag.8 di 22
campione + 225 ml di Fraser Broth Half Concentration cod. 401594) ed incubando a 30 C per 24 ore. Inoculare con 0,1 ml di brodocoltura una piastra di terreno ALOA. Esaminare dopo incubazione a 37 C per 24 ± 3 ore. Considerare come L. monocytogenes le colonie verde-blue circondate da un alone opaco. Eseguire le prove di conferma appropriate in accordo a ISO 11290. In alternativa impiegare il test rapido Biolife Monocytogenes ID Disc -cod.193005 (vedi nota). In caso di assenza di colonie tipiche reincubare per ulteriori 24 ± 3 ore. Se non si sviluppano colonie tipiche riportare i risultati come assenza di L.monocytogenes. In caso di sviluppo di colonie tipiche nelle ulteriori 24 ore di incubazione confermare le colonie come riportato sopra. Nota: Il test di conferma con i Monocytogenes ID Disc è stato incluso nel metodo validato AFNOR fino a settembre 2004. Nella estensione temporale attualmente in vigore il metodo con i dischetti è stato sostituito dalle reazioni biochimiche incluse nella norma ISO. DETERMINAZIONE DI L.MONOCYTOGENES Validazione AFNOR 25 g + 225 ml Fraser Half Concentration Incubare a 30 C per 24 ore Seminare su ALOA Incubare 24 h a 37 C SI Colonie tipiche NO Conferma SI Re-incubazione 24 h a 37 C Test della norma ISO 11290 oppure MONOCYTOGENES ID DISC (non incluso nel metodo attuale AFNOR) DETERMINAZIONE DI L.MONOCYTOGENES (METODO MPN O.M. 7/12/93) Il metodo raccomandato dalla O.M. del 7.12.93 per alimenti sfusi o preconfezionati, destinati per la loro natura ad essere consumati previa cottura, o che rechino sulla confezione la dizione da consumarsi previa cottura (esclusi il latte e i derivati del latte), é il seguente: Prelevare da ciascuna unità campione 10 g di prodotto, addizionare 90 ml di Buffered Peptone Water (cat. n. 401278) ed omogeneizzare per 2-3 minuti; Pag.9 di 22
Allestire diluizioni scalari fino alla 10-3 e seminare in triplicato 1 ml di ciascuna diluizione in 9 ml di Fraser Broth. Per gli alimenti surgelati o comunque sottoposti ad un trattamento termico,effettuare un pre-arricchimento, seminando in triplicato 1 ml di ciascuna diluizione in 9 ml di Tryptic Soy Broth + 0.6% Yeast Extract. Dopo 18-20 ore a 32 C subcolturare 1 ml di ciascuna provetta in 9 ml di Fraser Broth; Incubare le provette di Fraser Broth a 32 C per 24-48 ore; Dalle brodocolture che presentano annerimento prelevare un ansata ed eseguire strisci su terreno Oxford ed incubare a 37 C per 24-48 ore; Eseguire l identificazione selezionando almeno 5 colonie caratteristiche per piastra, secondo il metodo descritto dall Ordinanza Ministeriale e secondo quanto riportato in letteratura. TEST DI CONFERMA ISO 11290-1, ISO 11290-2 Il metodo di conferma di L.monocytogenes riportato da ISO 11290-1 e da ISO 11290-2 prevede il ritrapianto delle colonie sospette in Tryptic Soy Yeast Extract Agar o Tryptic Soy Yeast Extract Broth (in funzione del test) e l esecuzione delle seguenti prove biochimiche: Emolisi: + Produzione di acidi dal ramnosio: + Produzione di acidi dallo xilosio: - Camp Test: S.aureus +, R.equi - TEST DI CONFERMA CON MONOCYTOGENES ID DISC Una semplificazione delle procedure d identificazione è costituita dal test rapido Monocytogenes ID Disc che, abbinato al terreno ALOA, consente l identificazione di L. monocytogenes, in sole 2 ore. Numerosi lavori sperimentali testimoniano dell accuratezza di questo test di conferma (2,4,8,31). Il test deve essere eseguito secondo la seguente procedura: - Introdurre un disco in una provettina trasparente ed aggiungere 4 gocce (circa 0,2 ml) di soluzione fisiologica sterile. - Agitare brevemente su vortex - Prelevare con un ansa 3-4 colonie * con morfologia simile dal terreno ALOA. Introdurre le colonie nella provettina, tappare, agitare di nuovo su vortex ed incubare a 37 C per 2 ore - Aggiungere 2 gocce di soluzione p-dimetilaminobenzaldeide 5% * Il test può comunque essere effettuato anche su una singola colonia. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Listeria monocytogenes: nessuno sviluppo di colore o sviluppo di una lieve colorazione rosa. Listeria sp. non monocytogenes : sviluppo di una colorazione gialla. Pag.10 di 22
TEST DI CONFERMA CON MONOCONFIRM TEST Prelevare colonie pure dal terreno selettivo per Listeria o da subcoltura in terreno al sangue d uso generale (Tryptic Soy Blood Agar, Columbia Blood Agar, ecc.), eseguire una colorazione Gram, i test della catalasi e dell ossidasi, la mobilità. I ceppi di Listeria spp. appaiono come corti bastoncini Gram positivi, mobili a 25 C ed immobili a 37 C, catalasi positivi ed ossidasi negativi. - Preparare una sospensione batterica, da terreno selettivo o da terreno al sangue, in 1 ml di soluzione fisiologica sterile o in una provetta di Inoculation Fluid (cat. n. 524510) con torbidità pari a quella dello standard Mc Farland 2 fornito nel kit, utilizzando da 6 a 8 colonie. - Trasferire le strisce necessarie al lavoro d identificazione sull apposito supporto. - Distribuire 3 gocce di sospensione batterica nei pozzetti delle file A-B-C-D oppure delle file E-F-G-H utilizzando le pipette a bulbo fornite con il kit. Coprire con il coperchio ed incubare a 37 C per 18-24 ore - Riportare i risultati dei pozzetti delle file A-B-C (oppure E-F-G), che non richiedono aggiunta di reattivo: ara, meglu, x-glupy - Aggiungere una goccia di reattivo dimetilaminobenzaldeide ai pozzetti della fila D (o H) e riportare i risultati del test d-amp - Leggere i risultati e procedere all identificazione in accordo alle indicazione delle tabelle che seguono - Nel caso il supporto plastico delle strisce ed il coperchio debbano essere riutilizzati, lavarli con soluzione disinfettante LETTURA DEI RISULTATI TEST Arabitolo (ARA) Metil-glucoside (MEGLU) Beta-glucosidase (X-GLUPY) aminopeptidasi (AMP) COLORE REAZIONE POSITIVA paglierino paglierino blu azzurro giallo (dopo aggiunta didimetilaminobenzaldeide) COLORE REAZIONE NEGATIVA blu o verde blu blu o verde blu incolore incolore INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI ARA ME-GLU X-GLUPY AMP IDENTIFICAZIONE NE NEG NEG * Non Listeria spp. G NE POS POS * Non Listeria spp. G NE NEG POS * Non Listeria spp. G NE POS NEG * Non Listeria spp. G POS NEG NEG * Non Listeria spp. POS NEG POS * Non Listeria spp. POS POS NEG * Non Listeria spp. POS POS POS POS Listeria non monocytogenes POS POS POS NEG Listeria monocytogenes *quando anche uno solo dei test ARA, MEGLU, X-GLUPY è negativo, la lettura del test AMP é ininfluente, poichè è esclusa la presenza di Listeria Pag.11 di 22
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TERRENI DI COLTURA E KIT PER L IDENTIFICAZIONE Sono riportate di seguito le formulazioni ed i metodi di preparazione dei terreni citati nei capitoli precedenti. Per la consultazione delle schede tecniche complete si veda il sito web www.biolifeitaliana.it alla voce PRODOTTI LISTERIA ENRICHMENT BROTH Brodo selettivo completo, in polvere e pronto per l uso in flacone per l arricchimento di Listeria (Formulazione FDA) FORMULA TIPICA (g/l) Idrolisato triptico di caseina 17.000 Peptone di soia 3.000 Estratto di lievito 6.000 Cicloeximide 0.050 Acido nalidissico 0.040 Acriflavina HCl 0.015 Sodio cloruro 5.000 Potassio fosfato bibasico 2.500 Glucosio 2.500 PREPARAZIONE Sospendere 36.1 g di Listeria Enrichment Broth in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare per sciogliere completamente il brodo, distribuire ed autoclavare a 115 C per 15 minuti. ph finale 7.3 ± 0.2 DESCRIZIONE Listeria Enrichment Broth è preparato secondo la formulazione raccomandata da J. Lovett per la ricerca di L. monocytogenes negli alimenti. Contiene quali agenti selettivi la cicloeximide e l acriflavina, derivato acridinico con proprietà batteriostatiche verso molti batteri Gram positivi e con debole attività antifungina, e l acido nalidissico, un inibitore della flora Gram negativa. I due terreni sono completi degli agenti selettivi cicloeximide, acriflavina e acido nalidissico che, per le loro caratteristiche di termostabilità, sopportano la temperatura di sterilizzazione indicata (Martindale The Extra Pharmacopoeia, 1982; Haley e coll., 1980). LISTERIA BUFFERED ENRICHMENT BROTH Brodo selettivo tamponato, completo di antimicrobici per l'arricchimento di Listeria FORMULA (g/l) Tryptic Soy Broth 30.000 Estratto di lievito 6.000 Cicloeximide 0.050 Acido nalidissico 0.040 Acriflavina HCl 0.015 Potassio fosfato monobasico 1.350 Sodio fosfato bibasico 9.600 PREPARAZIONE Sospendere 47 g di in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare per sciogliere completamente il brodo, distribuire ed autoclavare a 115 C per 15 minuti. ph finale 7.3 ± 0.2 Pag.13 di 22
DESCRIZIONE Listeria Buffered Enrichment Broth è preparato secondo la formulazione raccomandata da J. Lovett per la ricerca di L. monocytogenes negli alimenti. Contiene quali agenti selettivi la cicloeximide e l'acriflavina, derivato acridinico con proprietà batteriostatiche verso molti batteri Gram positivi e con debole attività antifungina, e l'acido nalidissico, un inibitore della flora Gram negativa. Valutazioni successive hanno dimostrato che le proprietà selettive sono incrementate inserendo nel terreno un sisetma tampone. Il terreno Listeria Buffered Enrichment Broth contiene sodio fosfato bibasico e potassio fosfato monobasico. Il terreno è completo degli agenti selettivi cicloeximide, acriflavina e acido nalidissico che, per le loro caratteristiche di termostabilità, sopportano la temperatura di sterilizzazione indicata (Martindale The Extra Pharmacopoeia, 1982; Haley e coll., 1980). Il terreno tamponato con fosfati è suggerito dal rapporto ISTISAN 96/35 per l arricchimento dei derivati del latte fermentati. LISTERIA ENRICHMENT BROTH LOW ACRIFLAVINE Terreno liquido selettivo per l arricchimento di Listeria spp. nel latte e derivati del latte (formulazione FIL/IDF) FORMULA TIPICA (G/L) Idrolisato triptico di caseina 17.000 Peptone di soia 3.000 Estratto di lievito 6.000 Cicloeximide 0.050 Acido nalidissico 0.040 Acriflavina HCl 0.010 Sodio cloruro 5.000 Potassio fosfato bibasico 2.500 Glucosio 2.500 PREPARAZIONE Sospendere 36.1 g in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa solubilizzazione, distribuire ed autoclavare a 115 C per 15 minuti. ph finale 7.3 ± 0.2 DESCRIZIONE Listeria Enrichment Broth Low Acriflavine si differenzia dal terreno classico di Lovett e raccomandato dal FDA per un contenuto più ridotto di acriflavina: 10 mg/l invece di 15 mg/l. Tale concentrazione di acriflavina è raccomandata da FIL/IDF e da ISO 10560 nel terreno per l arricchimento di Listeria nel latte e prodotti lattiero caseari. LISTERIA FRASER BROTH BASE LISTERIA FRASER BROTH HALF CONCENTRATION FERRIC AMMONIUM CITRATE SUPPLEMENT Terreni di base e supplemento ferro ammonio citrato per l arricchimento primario e secondario di Listeria spp. e per la determinazione di Listeria spp. con metodo MPN FORMULE TIPICHE Listeria Fraser Broth Base (g/l) Proteose Peptone 5.000 Triptone 5.000 Estratto di carne 5.000 Estratto di lievito 5.000 Sodio cloruro 20.000 Sodio fosfato bibasico anidro 9.500 Potassio fosfato monobasico 1.350 Esculina 1.000 Litio cloruro 3.000 Acido nalidissico 0.020 Acriflavina 0.024 Pag.14 di 22
Listeria Fraser Broth Half Concentration (g/l) Proteose Peptone 5.0000 Triptone 5.0000 Estratto di carne 5.0000 Estratto di lievito 5.0000 Sodio cloruro 20.0000 Sodio fosfato bibasico anidro 9.5000 Potassio fosfato monobasico 1.3500 Esculina 1.0000 Litio cloruro 3.0000 Acriflavina 0.0125 Acido nalidissico 0.0100 Ferric Ammonium Citrate Supplement (x fiala) Ferro Ammonio Citrato 0.25 g PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE Sospendere 27.4 g di Listeria Fraser Broth o di Listeria Fraser Broth Half Concentration in 500 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione fino a completa soluzione. Autoclavare a 121 C per 15 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente, quindi aggiungere il contenuto di una fiala di Ferric Ammonium Citrate Supplement (codice 4240056) ricostituito con 5 ml di acqua distillata sterile. Mescolare bene e distribuire in provette sterili con le cautele dell asepsi. ph finale 7.2 +/- 0.2 DESCRIZIONE Listeria Fraser Broth e Listeria Fraser Broth Half Concentration, preparati in accordo alla formulazione descritta da Fraser, sono una modificazione del brodo di arricchimento UVM2 e, rispetto a quest ultimo, contengono in più il ferro ammonio citrato. Il brodo half concentration contiene acido nalidissico e acriflavina a concentrazioni dimezzate rispetto al Listeria Fraser Broth. Entrambi i terreni richiedono l aggiunta del supplemento con ferro ammonio citrato. La presenza di Listeria nei due brodi é indicata dall annerimento della coltura, dovuta alla reazione della esculetina, prodotta dall idrolisi dell esculina, con gli ioni ferro. Fraser Broth e Fraser Broth Half Concentration sono raccomandati da AFNOR V08-055, ISO11290 per l arricchimento primario e secondario di Listeria nei prodotti alimentari e sono indicati dal Rapporto ISTISAN 96/35 per la determinazione di Listeria negli alimenti (eccetto latte e derivati). Fraser Broth é raccomandato da USDA-FSIS per il secondo arricchimento di Listeria negli alimenti e in campioni di origine ambientale ed inoltre dall Ordinanza del Ministero della Sanità del 7.2.93 per la determinazione di Listeria spp con metodo MPN. FORMULE TIPICHE FRASER BROTH BASE (g/l) Peptone 5.000 Triptone 5.000 Estratto di carne 5.000 Estratto di lievito 5.000 Sodio cloruro 20.000 Sodio fosfato bibasico 12.000 Potassio fosfato monobasico 1.350 Esculina 1.000 Litio cloruro 3.000 FRASER BROTH BASE FRASER SELECTIVE SUPPLEMENT FRASER HALF SELECTIVE SUPPLEMENT Terreno di base e supplementi selettivi per l arricchimento primario e secondario di Listeria spp. e per la determinazione di Listeria spp. con metodo MPN Pag.15 di 22
FRASER SELECTIVE SUPPLEMENT ( fiala per 500 ml) Ferro Ammonio Citrato 250 mg Acido nalidissico 10 mg Acriflavina HCl 12.5 mg FRASER HALF SELECTIVE SUPPLEMENT ( fiala per 225 ml) Ferro Ammonio Citrato 112.50 mg Acido nalidissico 2.25 mg Acriflavina HCl 2.8125 mg PREPARAZIONE FRASER BROTH: Sospendere 28.7 g di Fraser Broth Base in 500 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa soluzione. Autoclavare a 121 C per 15 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente, quindi aggiungere il contenuto di una fiala di Fraser Selective Supplement (codice 4240043) ricostituito con 5 ml di etanolo/acqua distillata sterile (1:1). Mescolare bene e distribuire in provette sterili con le cautele dell asepsi. FRASER HALF BROTH : Sospendere 12.91 g di Fraser Broth Base in 225 ml di acqua distillata fredda Scaldare fino a completa soluzione. Autoclavare a 121 C per 15 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente, quindi aggiungere il contenuto di una fiala di Fraser Half Selective Supplement (codice 4240044) ricostituito con 3 ml di etanolo/acqua distillata sterile (1:1). Mescolare bene prima dell uso. ph finale 7.2 ± 0.2 DESCRIZIONE Fraser Broth e Fraser Half Broth preparati in accordo alla formulazione raccomandata da ISO 11290 sono una modificazione del brodo di arricchimento UVM2 e, rispetto a quest ultimo, contengono in più il ferro ammonio citrato. Il brodo Fraser Half contiene acido nalidissico e acriflavina a concentrazioni dimezzate rispetto al Fraser Broth. Entrambi i terreni contengono ferro ammonio citrato. La presenza di Listeria nei due brodi é indicata dall annerimento della coltura, dovuta alla reazione della esculetina, prodotta dall idrolisi dell esculina, con gli ioni ferro. Fraser Broth e Fraser Half Broth sono raccomandati da ISO 11290 per l arricchimento primario e secondario di Listeria nei prodotti alimentari e sono indicati dal Rapporto ISTISAN 96/35 per la determinazione di Listeria negli alimenti (eccetto latte e derivati). Fraser Broth é raccomandato da USDA-FSIS per il secondo arricchimento di Listeria negli alimenti e in campioni di origine ambientale ed inoltre dall Ordinanza del Ministero della Sanità del 7.2.93 per la determinazione di Listeria spp con metodo MPN. LISTERIA ENRICHMENT BROTH BASE UVM LISTERIA UVM 1 ANTIMICROBIC SUPPLEMENT LISTERIA UVM 2 ANTIMICROBIC SUPPLEMENT Terreno di base UVM e supplementi selettivi per l arricchimento di Listeria spp negli alimenti FORMULE TIPICHE Listeria Enrichment Broth UVM 1 (g/l) Proteose Peptone 5.000 Triptone 5.000 Estratto di lievito 5.000 Estratto di carne 5.000 Sodio cloruro 20.000 Sodio fosfato bibasico 12.000 Potassio fosfato monobasico 1.350 Esculina 1.000 Acido nalidissico 0.020 Acriflavina 0.012 Listeria Enrichment Broth UVM 2 (g/l) Proteose Peptone 5.000 Triptone 5.000 Pag.16 di 22
Estratto di lievito 5.000 Estratto di carne 5.000 Sodio cloruro 20.000 Sodio fosfato bibasico 12.000 Potassio fosfato monobasico 1.350 Esculina 1.000 Acido nalidissico 0.020 Acriflavina 0.025 Listeria Enrichment Broth Broth Base UVM (g/l) Proteose Peptone 5.000 Triptone 5.000 Estratto di lievito 5.000 Estratto di carne 5.000 Sodio cloruro 20.000 Sodio fosfato bibasico 12.000 Potassio fosfato monobasico 1.350 Esculina 1.000 Listeria UVM 1 Antimicrobic Supplement (mg/fiala) Acriflavina 6 Acido nalidissico 10 Listeria UVM 2 Antimicrobic Supplement (mg/fiala) Acriflavina 12.5 Acido nalidissico 10 Preparazione Listeria Enrichment Broth UVM 1 e UVM 2 (terreni completi di antimicrobici nella polvere): sospendere 54.4 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino a completa dissoluzione, distribuire in provette o flaconi ed autoclavare a 115 C per 15 minuti. ph finale 7.2 ± 0.2 Listeria Enrichment Broth Base UVM: sospendere 27.2 g di polvere in 500 ml di acqua distillata sterile. Scaldare fino a completa dissoluzione. Autoclavare a 121 C per 15 minuti. Listeria UVM 1 Enrichment Broth: sciogliere il contenuto di un flacone di Listeria UVM1 Antimicrobic Supplement (4240037) con 5 ml di acqua distillata sterile. Addizionare a 500 ml di Listeria Enrichment Broth Base UVM autoclavato e raffreddato; mescolare e distribuire in flaconi o provette sterili, con le cautele dell asepsi. ph finale 7.2 ± 0.2 Listeria UVM 2 Enrichment Broth: sciogliere il contenuto di un flacone di Listeria UVM2 Antimicrobic Supplement (4240036) con 5 ml di acqua distillata sterile. Addizionare a 500 ml di Listeria Enrichment Broth Base UVM autoclavato e raffreddato; mescolare e distribuire in flaconi o provette sterili, con le cautele dell asepsi. ph finale 7.2 ± 0.2 DESCRIZIONE Biolife prepara i terreni UVM 1 e UVM 2 sia come polvere completa degli agenti antimicrobici (cat. n. 401598 e 401599) sia come terreno di base (cat. n. 401597) a cui addizionare i supplementi selettivi UVM1 (cat. 4240036) e UVM 2 (cat. n. 4240037). I due terreni con gli agenti antimicrobici acriflavina ed acido nalidissico inclusi nella polvere, per le loro caratteristiche di termostabilità, sopportano la temperatura di sterilizzazione indicata (Martindale The Extra Pharmacopoeia, 1982: Haley e coll. 1980). I terreni ed i supplementi sopra riportati, preparati in accordo alla formulazione di Donnelly e Baigent e Mc Clain e Lee, sono utilizzati per l arricchimento in due fasi di Listeria spp. nei prodotti a base di carne. Il terreno completo UVM 1 risulta contenere una concentrazione di acido nalidissico pari a 20 mg/l e di acriflavina pari a 12 mg/l; il terreno completo UVM 2 presenta una concentrazione doppia di acriflavina (25 mg/l) rispetto all UVM1. Pag.17 di 22
ALOA AGAR LISTERIA ACC. TO OTTAVIANI & AGOSTI ALOA ENRICHMENT-SELECTIVE SUPPLEMENTS Terreno in polvere, supplemento selettivo, arricchimento e piastre pronte all uso per l isolamento di Listeria spp. e la differenziazione di L. monocytogenes. FORMULE TIPICHE AGAR LISTERIA ACC. TO OTTAVIANI &AGOSTI (ALOA ) (g/l) Peptone 18,00 Triptone 6,00 Estratto di lievito 10,00 Sodio piruvato 2,00 Glucosio 2,00 Magnesio glicerofosfato 1,00 Magnesio solfato 0,50 Sodio cloruro 5,00 Litio cloruro 10,00 Disodio idrogeno fosfato anidro 2,50 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranoside 0,05 Agar 13,50 ALOA SELECTIVE SUPPLEMENT (contenuto della fiala) Acido nalidissico, sale sodico 0,010 g Ceftazidime 0,010 g Cicloeximide 0,050 g Polimixina B solfato 38350 UI ALOA ENRICHMENT SUPPLEMENT (contenuto della fiala) L-α- Fosfatidilinositolo 1,0 g ALOA, PIASTRE PRONTE ALL USO (g/l) Peptone 18,00 Triptone 6,00 Estratto di lievito 10,00 Sodio piruvato 2,00 Glucosio 2,00 Magnesio glicerofosfato 1,00 Magnesio solfato 0,50 Sodio cloruro 5,00 Litio cloruro 10,00 Disodio idrogeno fosfato anidro 2,50 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranoside 0,05 Agar 13,50 L-α- Fosfatidilinositolo 2,00 Acido nalidissico, sale sodico 0,020 Ceftazidime 0,020 Cicloeximide 0,10 Polimixina B solfato 76700 UI IMPIEGO PREVISTO Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti (ALOA) è un terreno selettivo, cromogenico e differenziale per la ricerca ed il conteggio di Listeria monocytogenes negli alimenti ed in altri campioni. Il terreno ALOA è raccomandato dalla norma ISO 11290-1 Amd.1:2004 (determinazione di L.monocytogenes negli alimenti) ed ISO 11290-2 Amd1:2004 (enumerazione di L.monocytogenes negli alimenti). PRINCIPIO L azione selettiva è dovuta alla presenza nel terreno di base del litio cloruro ed all aggiunta della miscela antimicrobica del supplemento selettivo contenente ceftazidime, polimixina B, acido nalidissico e cicloeximide. L azione differenziale è dovuta alla presenza nel terreno del composto Pag.18 di 22
cromogenico X-glucoside quale substrato per l evidenziazione dell enzima ß-glucosidasi, comune a tutte le specie di Listeria. L azione differenziale specifica è ottenuta con un substrato specifico per la fosfolipasi C (PIPLC), propria della sola specie L.monocytogenes e di alcuni ceppi di L.ivanovii. Con l azione combinata dei due substrati è possibile differenziare le seguenti colonie: L. monocytogenes: colonie verde-blu circondate da un alone opaco. Listeria spp. non monocytogens : colonie verde-blu senza alone TERRENO IN POLVERE: PREPARAZIONE Sospendere 35,3 g in 500 ml di acqua distillata fredda, portare ad ebollizione sotto agitazione. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti. Raffreddare a 48-50 C, aggiungere il contenuto di una fiala di ALOA Enrichment Supplement, preriscaldato a 48-50 C ed il contenuto di una fiala di ALOA Selective Supplement ricostituito con 5 ml di una miscela alcool etilico/acqua distillata sterile (1:1). Mescolare bene e distribuire in piastre sterili. ph finale 7,2 ± 0,2 DESCRIZIONE ALOA è un terreno cromogenico e selettivo per la ricerca ed il conteggio L. monocytogenes e per la sua differenziazione dalle altre specie di Listeria, anche in presenza di una flora mista. Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti (ALOA) è stato comparato con i terreni PALCAM ed Oxford e con diversi altri terreni cromogenici, da diversi autori: tutti i risultati confermano la superiorità del terreno ALOA sia rispetto ai terreni tradizionali (1,8,10,11,13) che rispetto ad altri terreni cromogenici (3, 9). Il terreno ALOA è raccomandato dalle norme ISO 11290-1 e ISO 11290-2 (Amendments del 24/10/2004) (5a, 5b) sia per la procedura di ricerca che per quella di conteggio di L.monocytogenes nei prodotti destinati al consumo umano ed animale; il terreno ALOA è inoltre raccomandato dall FDA-BAM. Lequerq (7) riporta che ALOA è risultato il terreno migliore tra i quattro esaminati e che la sua introduzione nei metodi d analisi in sostituzione di Oxford e PALCAM aumenta l isolamento ed il conteggio dei ceppi atipici di L.monocytogenes Gracieux e coll. (6) riportano con ALOA una percentuale di recupero superiore dei ceppi virulenti, ipovirulenti ed avirulenti di L.monocytogenes rispetto al terreno PALCAM e ad altro terreno cromogeno. Sacchetti e coll. (12) riportano che in una sperimentazione su 132 campioni di alimenti ALOA ed un secondo terreno cromogeno consentono di determinare L.monocytogenes in tempi più rapidi e con maggiore sensibilità e specificità rispetto al terreno PALCAM. Gli autori riportano risultati di conferma con Monocytogens ID Disc Biolife, comparabili con quelli delle gallerie del commercio, ma più rapidi. Il terreno ALOA pronto in piastra è stato validato da AFNOR (1) insieme ad un protocollo di lavoro semplificato che consente di eseguire l analisi in 48-72 ore (24 ore di arricchimento ed altre 24-48 ore di incubazione del terreno in piastra). LIMITI E PRECAUZIONI La lettura delle piastre con una crescita abbondante può essere facilitata comparando l opacità del terreno ai bordi dove può non esserci crescita con quella del centro piastra oppure comparando con una piastra non seminata. In caso di dubbi procedere al re-isolamento delle colonie. Alcuni ceppi di Bacillus cereus, resistenti agli agenti selettivi del terreno, possono produrre delle colonie piatte, rugose, di colore da bianco a blu non omogeneo, con un alone largo ed intenso. Alcuni ceppi di L.ivanovii PIPLC+, soprattutto dopo 48 ore di incubazione, possono presentare colonie verde-blu con alone opaco. ALOA : ALOA è un marchio registrato di Biolife Italiana S.r.l. Pag.19 di 22
LISTERIA PALCAM AGAR BASE PALCAM ANTIMICROBIC SUPPLEMENT Terreno di base in polvere e supplemento selettivo per l isolamento di Listeria spp. FORMULE TIPICHE Listeria PALCAM Agar Base terreno in polvere (g/l) Peptocomplex 10.00 Triptosio 10.00 Peptone 3.00 Estratto di lievito 3.00 Amido di mais 1.00 Sodio cloruro 5.00 Glucosio 0.50 Mannitolo 10.00 Esculina 0.80 Fe-ammonio citrato 0.50 Litio cloruro 15.00 Rosso fenolo 0.08 Agar 12.00 PALCAM Antimicrobic Supplement (x fiala) Polimixina B solfato 50.000 U.I. Ceftazidime 10 mg Acriflavina HCl 2.5 mg Listeria Selective Agar (PALCAM) - (piastre pronte) PALCAM Agar Base 1000 ml Polimixina B solfato 100.000 U.I. Ceftazidime 20 mg Acriflavina HCl 5 mg PREPARAZIONE Sospendere 35.4 g in 500 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione, autoclavare a 121 C per 15 minuti. Raffreddare a 50 C ed addizionare, con le precauzioni dell asepsi, il contenuto di 1 fiala di PALCAM Antimicrobic Supplement (4240042), ricostituito con 5 ml di acqua distillata sterile. Mescolare e distribuire in piastre sterili. ph finale 7.2 ± 0.2 DESCRIZIONE Il terreno PALCAM è indicato per l isolamento di Listeria spp. nei prodotti alimentari dai metodi ISO 11290, NF V08-55 ed in microbiologia clinica quando sia necessario l isolamento di Listeria spp. da campioni con flora saprofita. Il terreno di base ed il supplemento selettivo sono preparati in accordo alla formulazione descritta da Van Netten e coll. Il terreno completo PALCAM rappresenta un miglioramento del terreno Oxford e consente l isolamento ed una preliminare differenziazione di Listeria spp. La selettività è dovuta alla presenza nel terreno di base del litio cloruro e di polimixina B, ceftazidime ed acriflavina nel supplemento liofilizzato. Il terreno utilizza un doppio sistema indicatore: idrolisi dell esculina e fermentazione del mannitolo. Listeria spp. idrolizza l esculina e non fermenta il mannitolo e coltiva con colonie circondate da un alone nero. Sul terreno non è possibile differenziare L.monocytogenes dalle altre specie del genere Listeria. I contaminanti più comuni, stafilococchi e streptococchi fermentano il mannitolo, causano il viraggio dell indicatore e coltivano con colonie circondate da un alone giallo. Il terreno non consente la distinzione di L.monocytogenes dalle altre spedie del genere Listeria. Pag.20 di 22