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1 Tecniche di Procreazione medicalmente Assistita PMA Paola Anserini Centro di Fisiopatologia della Riproduzione Umana Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino - Genova

2 Tecniche di Procreazione medicalmente Assistita PMA Paola Anserini Centro di Fisiopatologia della Riproduzione Umana Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino - Genova

3 Tecniche di Procreazione medicalmente Assistita PMA Paola Anserini Centro di Fisiopatologia della Riproduzione Umana Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino - Genova

4 Tecniche di 1 livello IUI (Inseminazione Intra Uterina) Tecnica ambulatoriale Indicazioni: Fattore maschile medio-lieve Fattore cervicale Infertilità inspiegata Fattori permittenti: Almeno una tuba pervia Almeno 5 milioni di spermatozoi mobili

5 INSEMINAZIONI INTRA UTERINE

6 RISULTATI CUMULATIVI ANNO 2008 OSPEDALI SAN MARTINO E GALLIERA N DI PAZIENTI TRATTATE 213 N CICLI INIZIATI 698 N CICLI SOSPESI 75 N IUI EFFETTUATE 620 N GRAVIDANZE 30 (4.8%)

7 CONSENSO PER IL PROGRAMMA PROCREAZIONE MEDICA ASSISTITA ai sensi di Legge n. 40 del 24 febbraio 2004 Linee guida del Ministero i della Salute del 14 luglio li 2004 Decreto del Ministero della Giustizia e del Ministero della Salute del Sentenza n.151 della Corte Costituzionale

8 Tecniche Maggiori di PMA : INDICAZIONI FIV/ET = Fertilizzazione in Vitro e trasferimento in utero di embrioni 1. ostruzione tubarica bilaterale 2. endometriosi 3. fattore maschile medio 4. infertilità et tàinspiegata 5. precedente insuccesso delle tecniche minori (Inseminazione intrauterina IUI). ICSI = Microiniezione intracitoplasmatica di spermatozoi 1. fattore maschile grave o gravissimo. 2. l endometriosi 3. fattore maschile medio 4. infertilità inspiegata 5. precedente insuccesso delle tecniche minori (Inseminazione intrauterina IUI).

9 La Tecnica ICSI Applicata per la prima volta nel 1992 Ha risolto il problema della fertilizzazione nei gravi fattori maschili Spermatozoi eiaculati Spermatozoi epididimari Spermatozoi testicolari Spermatozoi crioconservati

10 Le fasi delle Tecniche Maggiori di PMA : FIVET e ICSI 1. Fase preparatoria 2. Stimolazione ormonale ovarica controllata e Monitoraggio ecografico e ormonale 3. Induzione dell ovulazione 4. Prelievo ovocitario 5. Raccolta e preparazione del liquido seminale 6. Inseminazione degli ovociti e fertilizzazione in vitro FIVET <> ICSI 7. Trasferimento di embrioni in utero 8. Supporto della fase luteale

11 Descrizione delle Tecniche: Fase preparatpria e Stimolazione CICLO PRECEDENTE CICLO DI TRATTAMENTO Pillola? Pillola? Gn-Rh antagonista Gn-Rh agonista flare-up SOPPRESSIONE IPOTALAMO IPOFISARIA Gn-Rh agonosta blocking Inizio stimolazione Induzione ovulazione PU ET Test di Gravidanza giorni 36 h 2/3 gg 12 giorni Supplementazione fase luteale Monitoraggio USG e E 2

12 Meccanismo d azione degli agonisti e degli antagonisti del GnRH o Legame e attivazione dei recettori o Fase immediata rilascio di FSH e LH dall ipofisi o Desensibilizzazione recettori ipofisari o Fase tardiva Stato ipogonadotropo o Prolungamento stato ipogonadotropo per giorni dopo la sospensione o Legame recettori senza attivazione o Leganme reccettoriale competitivo o Recettori integri o Inibizione della risposta ipofisaria o Stato ipogonadotropo immediato o Rapida reversibilità (30-90 ore) GnRH antagonist Livelli di LH [U/L] giorni Livelli di LH [U/L] ore 30-90

13 Protocollo Standard Protocollo Lungo con agonista del GnRH Inizio della Stimolazione Giorno 2-3 del ciclo mestruale FSH: UI/die per gg MONITORAGGIO giorni del ciclo mestruale Agonista del GnRH Giorno 21 del precedente ciclo mestruale Conferma della down-regulation (Ε 2 <50 pg/ml etc) Induzione dell ovulazione Prelievo delgli Ovociti (36 ore dopo HCG) giorni complessivi trattamento

14 Protocollo Standard Protocollo Lungo con agonista del GnRH Inizio della Stimolazione Giorno 2-3 del ciclo mestruale FSH: UI/die per gg MONITORAGGIO giorni del ciclo mestruale Agonista del GnRH Giorno 21 del precedente ciclo mestruale Conferma della down-regulation (Ε 2 <50 pg/ml etc) Induzione dell ovulazione Prelievo delgli Ovociti (36 ore dopo HCG) giorni complessivi trattamento

15 Protocollo GnRH Antagonista Inizio della Stimolazione Giorno 2-3 del ciclo mestruale FSH: UI/die per gg MONITORAGGIO giorni del ciclo mestruale Antagonista GnRH 025 0,25 mg/die Induzione dell ovulazione Prelievo delgli Ovociti (36 ore dopo HCG) giorni complessivi di trattamento

16 Stimolazione ormonale ovarica controllata piu follicoli FOLLICOLI OVOCITI MATURI OVOCITI 85% 80% OVOCITI FECONDATI 85% OVOCITI MATURI EMBRIONI 80% Resa embrionaria media: 50%

17 Stimolazione ormonale ovarica controllata OBIETTIVI Ottenere un buon numero di ovociti di buona qualità DURATA In media giorni COMPLICANZE Sindrome da iperstimolazione FARMACI : Citrato di clomifene : Clomid o Serofene Gonadotropine Fostimon Meropur Puregon Gonal-F Pergoveris Il ciclo può essere sospeso durante la stimolazione per : 1-rischio di iperstimolazione 2-risposta inadeguata (N follicoli < 3-4; risposta troppo lenta; formazione di cisti ecc ) 3-brusco calo ormonale

18 Stimolazione iniziale Lun Mar Mer Gio Ven Sab Dom Decapeptyl 0,1 1 fiala Eco basale Decapeptyl 0,1 1 fiala Gonal-F Bassado Decapeptyl 0,1 1 fiala Deb lavanda Gonal-F... Bassado Decapeptyl 0,1 1 fiala Deb lavanda Gonal-F Bassado Decapeptyl 0,1 1 fiala Deb lavanda Gonal-F Bassado Decapeptyll 0,1 1 fiala Deb lavanda Gonal-F Bassado Decapeptyl 0,1 1 fiala Deb lavanda Gonal-F Monitoraggio Lun Mar Mer Gio Ven Sab Dom Bassado Decapeptyl 0,1 1 fiala Deb lavanda Gonal-F Eco + E2 Bassado Decapeptyll 0,1 1 fiala Deb lavanda Gonal-F Eco + E2 Decapeptyl 0,1 1 fiala Gonal-F Eco + E2 Decapeptyl 0,1 1 fiala Gonal-F Eco + E2 Decapeptyl 0,1 1 fiala Gonal-F Eco + E2 Decapeptyl 0,1 1 fiala Gonal-F Eco + E2 Decapeptyl 0,1 1 fiala Gonal-F Eco + E2 Monitoraggio e intervento Lun Mar Mer Decapeptyl Decapeptyl 0,1 1 Decapeptyl 0,1 1 Decapeptyl 0,1 1 Decapeptyl 0,1 1 Decapeptyl 0,1 1 0,1 1 fiala fiala fiala fiala fiala fiala Gonal-F Gonal-F Gonal-F.. Gonal-F Gonal-F Gonal-F.. Eco + E2 Eco + E2 Eco + E2 Eco + E2 Eco + E2 Pick up Pick up Pick up Transfer Gio Pick up Transfer Ven Pick up Transfer Sab Transfer Dom Transfer

19 Induzione dell ovulazione Quando i follicoli sono maturi si somministra l hcg (Gonasi, Ovitrelle, Pregnyl) che ha lo scopo di: Completare la maturazione ovocitaria Preparare il follicolo all ovulazione Un vantaggio dell uso degli antagonisti è quello di poter indurre l ovulazione senza usare l hcg (Gonasi HP, Ovitrelle, Pregnyl) Utilizzando un picco endogeno di LH indotto da un bolo di GnRh agonista POSSIBILE RIDUZIONE DELLA SINDROME DA IPERSTIMOLAZIONE OVARICA

20 Prelievo ecoguidato di ovociti h dopo la somministrazione dell hcg 1. sonda vaginale 2. guida dell ago 3. sistema di aspirazione 4. Ecografo RISCHI E COMPLICANZE Emorragie Infezioni Perforazione di organi addominali ANESTESIA Sedazione conscia Generale Blocco paracervicale

21 RECUPERO E PREPARAZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER FIVET/ICSI /CS Lo stesso giorno in cui si prelevano gli ovociti è necessario ottenere il liquido id seminale per l inseminazione i i in vitro. La raccolta del liquido seminale avviene per masturbazione come per un comune spermiogramma Astinenza non superiore ai 5 giorni e non inferiore ai 3 giorni Il momento della raccolta viene definito i con i biologi i gli spermatozoi vengono sottoposti a procedimenti che hanno lo scopo di selezionare la popolazione dotata delle migliori caratteristiche, ti di ti d tti di it i questi procedimenti detti di capacitazione richiedono circa 45 minuti.

22 Recuperi testicolari nei casi di assenza di spermatozoi nell eiaculatoeiaculato TESE (Silber et al., 1996) ESTRAZIONE DI SPERMATOZOI DA UN FRAMMENTO DI POLPA TESTICOLARE TeFNA-TESA (Craft et al., 1997) ASPIRAZIONE DI SPERMATOZOI DAL TESTICOLO

23 A questo punto, i passi successivi i differiscono i a seconda della tecnica adottata.

24 GIORNO O Prelievo ovocitario Coltura di ovociti Inseminazione extracorporea ICSI FIVET

25 Controllo fecondazione GIORNO 1 Coltura di embrioni GIORNO 2 Trasferimento in utero (ET) dopo 2-5 giorni

26 SCONGELAMENTO DI OVOCITI Coltura di ovociti Inseminazione extracorporea Controllo fecondazione Coltura di embrioni Trasferimento in utero (ET) dopo 2-5 giorni

27 POSSIBILI STOP!! Prelievo ovocitario Scongelamento ovocitario Inseminazione i n extracorporea Controllo fecondazione Sviluppo di embrioni

28 18-19 h post inseminazione zigote 2 PN Trasferimento di embrioni in utero h post inseminazione: embrione bi a 2 blastomeri h post inseminazione embrione bi a 4 blastomeri h post inseminazione embrione a 8 blastomeri Tecnica ambulatoriale non invasiva che viene effettuata in genere due o tre giorni dopo il prelievo ovocitario

29 Trasferimento di embrioni in utero 2-3 giorno dopo il Prelievo ovocitario Procedimento ambulatoriale Ambiente sterile Guida ecografica Catetere Vescica Mantenimento posizione supina per almeno 20

30 Supporto Luteale La supplementazione della fase luteale l è sempre indicata FARMACI nei cicli di stimolazione con Prontogest fiale i.m. 100 mg GnRH agonisti Crinone 8 appl. vaginali 90 mg Non ci sono evidenze Prometrium cpr x os o vaginali sufficienti per non 100 mg supplementare i cicli di Progeffik cpr x os o vaginali 100 Stimolazione con GnRH mg antagonisti Esolut crema vaginale 30 gr L HCG va limitato it t ai cicli senza ovuli vaginali 200 mg rischio di iperstimolazione Il progesterone può essere Lentogest fiale i.m. da 341 mg somministrato i.m. o i.v. Proluton Depot fiale i.m. 250 mg

31 RISULTATI

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33 RISULTATI CUMULATIVI ANNO 2008 OSPEDALI SAN MARTINO E GALLIERA PAZIENTI TRATTATE 383 (8.8% 8% fuori regione) CICLI INIZIATI 471 CICLI SOSPESI PRIMA DEL PICK-UP UP 76 (16%) PRELIEVI OVOCITARI 395 TRASFERIMENTI DI EMBRIONI 357 GRAVIDANZE CLINICHE ,0 PERCENTUALE DI GRAVIDANZA 35,0 30,0 25,0 20,0 15, % PER CICLO, 31.6 % PER PU 10,0 5,0 0,0 % Gravidanza per ciclo iniziato % Gravidanza per pick up % Gravidanza per ET 35 % PER ET

34

35 Ultima relazione Ministeriale sull applicazione della Legge 40

36 RISULTATI CUMULATIVI ANNO 2008 OSPEDALI SAN MARTINO E GALLIERA % Percentuale di gravidanza per ciclo iniziato in relazione all età delle pazienti totale <30 anni anni anni anni 15 3 D Column 5 3 D Column 6 10 totale 5 0 <

37 RISULTATI CUMULATIVI ANNO 2008 OSPEDALI SAN MARTINO E GALLIERA Gemellari 26.4 % Trigemine 5.6 %

38 RISULTATI CUMULATIVI ANNO 2008 OSPEDALI SAN MARTINO E GALLIERA Follow-up delle gravidanze ottenute nei cicli a fresco Aborti 12.8 % Ectopiche % Parti 107 Singoli 70 Gemellari 31 Trigemini 6 Bambini nati 153

39 CRIOCONSERVAZIONE DI OVOCITI Dati Italiani 2007 dall ultima Relazione Ministeriale sui dati del Registro ISS PMA In Italia solo il 50% dei Centri congela ovociti. Il congelamento ovocitario i si può effettuare in circa 1/4 dei prelievi ovocitari BISOGNA SAPERE CHE: Nel 2% dei Pick up non si recupera nessun ovocita Il 20-30% degli ovociti recuperati non sono idonei alla crioconservazione Le probabilità di riuscire a fare almeno 1 trasferimento di embrioni sono molto basse se non si riescono a crioconservare almeno 5 ovociti

40 RISULTATI CUMULATIVI ANNO 2008 OSPEDALI SAN MARTINO E GALLIERA Cicli di congelamento ovocitario 60 Cicli di scongelamento ovocitario 29 Gravidanze da scongelamento 5

41 CONGELAMENTO LENTO Chen, 1986 Van Uem et al, 1987 Chen, 1988 Porcu et al, 1997 Polak de Fried, 1998 Porcu et al, 1998a Tucher el al, 1998 Porcu et al, 1999a Wurfeel et al, 1999 Kyono et al, 2001 Chen et al, 2002 Huttelova et al, 2003 Miller et al,2004 Notrica et al, 2004 Tyer et al, 2005 Montag et al, 2006 Barritt et al,2007 Gook et al, 2007 Yang et al, 2007 Porcu et al, 2008 Borini et al,1998 Porcu et al, 1998b Porcu et al, 1999b Porcu et al 2000 Winslow et al, 2001 Yang et al, 2002 Quintans et al,2002 Boldt et al, 2003 Fosas et al, 2003 Borini et al, 2004 Azambuja et al, 2005 Chen et al, 2005 Li et al, 2005 Porcu, 2005 Boldt et al, 2006 Borini et al, 2006 Chamayou et al, 2006 La Sala et al, 2006 Levi Setti et al, 2006 Petracco et al, 2006 Bianchi et al, 2007 De Santis et al, 2007 Konc et al, 2007 Lavori Pubblicati VITRIFICAZIONE Kuleshova et al, 1999 Katayama et al, 2003 Kyono et al, 2005 Yoon et al, 2003 Chian et al, 2005 Kim et al, 2005 Okimura et al, 2005 Kuwayama et al, 2005 Ruvalcaba et al, 2005 Locena et al, 2006 Antinori et al, 2007 Cobo et al, 2008

42 RISULTATI CONGELAMENTO LENTO RISULTATI VITRIFICAZIONE OVOCITI SCONGELATI 5435 OVOCITI SCONGELATI 308 BAMBINI NATI (Pubblicati) 224 BAMBINI NATI (Non Pubblicati) 289 BAMBINI NATI (Pubblicati) 103 BAMBINI NATI (Non Pubblicati) TOTALE 532 TOTALE 392 Numerosità dei lavori (senza bias di pubblicazione) Riproducibilità dei risultati Applicazione della tecnica su larga scala e non su casi selezionati (surplus ovociti) La maggior parte delle pubblicazioni sono Italiane (restrizioni della Legge 40) Pochi lavori Non riproducibilità Programmi g di ovodonazione Non restrizioni di Legge Noyes et al, 2008 RBM on line

43 Fertility & Sterility 2009 Studio Multicentrico Italiano: 8 Centri Cicli di scongelamento Sopravvivenza 58 % Fertilizzazione 72 % GRAVIDANZE: per ciclo di scongelamento 13,7 % per trasferimento di embrioni 17,1 % 88 PARTI (9.3% per ciclo di scongelamento)

44 I risultati della ICSI con ovociti scongelati sono significativamente inferiori ai risultati dei cicli con ovociti freschi.

45 CRIOCONSERVAZIONE DI OVOCITI Centro Fisiopatologia della Riproduzione Umana Ospedale San Martino anni % MII scartati Totale ovociti prelevati 3318 immaturi 24% 38% inseminati 28% congelati Ovociti inseminati Ovociti immaturi scartati Ovociti congelati Ovociti maturi (MII) scartati

46 Casistica scongelamenti ovocitari anni 2008 e 2009 SCONGELAMENTI GRAVIDANZE % GRAVIDANZA % % TOTALE % Centro di Fisiopatologia della Riproduzione Umana Azienda Ospedale Università San Martino

47 RISCHI E COMPLICANZE Iperstimolazione i ovarica Complicanze p emorragiche Gravidanza tubarica Gravidanze multiple

48 Classificazione Clinico-Strumentale secondo Golan (1989) Grado 1 OHSS Lieve Gonfiore e tensione addominale OHSS Moderata OHSS Grave Grado 2 Grado 1 + nausea, vomito e/o diarrea. Ovaie di ø tra 5-12 cm Grado 3 OHSS lieve + pres. Ascite all ecografia Grado 4 OHSS moderata + evidenza clinica di ascite o versamento pleurico con dispnea Grado 5 Grado 4 + alteraz. coagulaz, ipotensione, riduzione della diuresi, emoconcentraz, ovaie ø>12 cm

49 DATI sui bambini Nati con PMA La casistica mondiale sui nati viene raccolta dal 1978 per la FIVET dal 1995 per l ICSI. Inati con l utilizzo di ovociti scongelati sono ancora troppo pochi (circa 400) per poter trarre conclusioni su eventuali rischi perinatologici di questa tecnica. I dati della letteratura, anche se non perfettamente concordi, indicano un aumento del rischio di malformazioni nei nati da PMA del 30 % rispetto ai nati della popolazione normali

50 Razionale per lo studio delle anomalie fetali dopo PMA 1. Manipolazione gameti 2. Esposizione degli ovociti a livelli soprafisiologici di ormoni ipofisari i 3. Esposizione a terreni di coltura ed ambiente di laboratorio 4. In caso di ICSI iniezione forzata negli ovociti di spermatozoi di bassa qualità, talvolta immaturi, scelti tra quelli vitali 5. Prevalenza della patologia genetica nella popolazione infertile

51 Results of the meta-analyses analyses Pooled odds ratio : 1.40 (95% CI ) for the 7 selected studies 1.29 (95% CI ) For all the 25 studies Pooled odds ratio incorporate estimates of BD risk calculated from studies that variously collected informations on major and minor defests, singletons and multiples separated and combined IVF and ICSi children Sub-group analyses of studies assessing separately major BD and BD in singletons confirmed the higher risk Hansen M et al Hum Reprod 2005

52 For a given 30 40% increased risk of Birth Defects: Baseline Birth Defect prevalence Expected Birth Defect prevalence in IVF/ICS children 1 % 1.3 % 1.4 % 2 % 2.6 % 2.8 % 3 % 3.9 % 4.2 % 4 % 5.2 % 5.6 % 5% 65% 6.5 7% 6 % 7.8 % 8.4 %

53 Possibili fonti di errore I neonati da PMA vengono esaminati con maggiore attenzione Classificazioni diverse di malformazioni maggiori e minori Effetto della gemellarità (malformazioni : 1,9 % gr. Singole, 4,8% gr. Gemellari, 6,7 % gr. Trigemine) Possibile sottostima dovuta alle gravidanze interrotte dopo la diagnosi prenatale Alcuni dei fattori di rischio per l infertilità sono associati anche ad un aumento delle malformazioni Nel caso di malformazioni rare sono necessari grandi g numeri per evidenziare una differente incidenza

54 Anomalie Genetiche nei nati da ICSI (per grave fattore maschile) delle aneuploidie dei cromosomi sessuali 0,6-0,8% vs 0,2% anomalie cromosomiche autosomiche (de novo) 0,4 % vs 0,07% delle aberrazioni cromosomiche strutturali (ereditate dal padre) Microdelezioni cromosoma Y Mutazioni della fibrosi cistica (CBAVD) Ipotetica ti trasmissione i di altre mutazioni i autosomiche associate a sterilita maschile Ipotetico delle anomalie genetiche associate a difetti della spermatogenesi (atrofia muscolare spinobulbare, tumori del colon a struttura non polipoide)

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