Università degli studi di Firenze Dipartimento di Scienze per la Salute della Donna e del Bambino

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1 Università degli studi di Firenze Dipartimento di Scienze per la Salute della Donna e del Bambino TERAPIA DELLA INFERTILITA MASCHILE E TECNICHE DI PMA: LO STUDIO DELLA FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO NEI CASI DI MANCATA FERTILIZZAZIONE OVOCITARIA Responsabile della ricerca: Prof Ivo Noci Data di compilazione: 27 ottobre 2010

2 1. INTRODUZIONE 1.1. FATTORE MASCHILE E TECNICHE DI PROCREAZIONE ASSISTITA Circa il 30% delle infertilità di coppia riconoscono una causa maschile, costituita da una oligoastenoteratozoospermia (OAT) di grado variabile: da forme lievi (ad esempio, modesta riduzione della concentrazione degli spermatozoi, nella fascia da 10 a 20 x 10 6 /ml) a forme severe come le azoospermie. Nonostante i progressi, diagnostici e terapeutici, raggiunti in ambito andrologico, ad oggi non sono molte le reali possibilità di ottenere significativi miglioramenti della qualità del liquido seminale con terapie mediche; per cui molto spesso la coppia è indirizzata verso la effettuazione di tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA). Le tecniche di PMA sono sostanzialmente di due tipi: -di primo livello, decisamente più semplici: sono rappresentate dalla inseminazione intrauterina (IUI) -di secondo livello, più complesse, e sono rappresentate dalle tecniche di fertilizzazione in vitro: FIVET e ICSI. La scelta di un tipo di terapia, o dell altra, ad oggi non è ben codificata nell ambito della Medicina della Riproduzione. Alcuni Centri, infatti, con un ragionamento di tipo costo-beneficio, suggeriscono di iniziare sempre e comunque con un programma di IUI. Ma la maggior parte delle strutture che eseguiscono tecniche di PMA valutano, a fini decisionali, il valore del test di capacitazione spermatico. Nei casi in cui il test presenti valori superiori a quelli di soglia, è suggerita la effettuazione della IUI; nel caso contrario la coppia è indirizzata verso l alta tecnologia.

3 Nella nostra istituzione, il valore-soglia del test di capacitazione è pari a di spermatozoi normomobili. Una volta che la coppia con infertilità da causa maschile, avendo un test di capacitazione inferiore a quello di soglia, venga avviata a procedure di fertilizzazione assistita, la scelta della modalità più semplice (FIVET, fertilizzazione in vitro) o più complessa (ICSI, microiniezione intracitoplasmatica di un singolo spermatozoo) dipende, ancora una volta, dal test di capacitazione: nel senso che solo in presenza di valori di capacitato superiori a si procede a FIVET, e a ICSI nel caso contrario. Eseguendo tecniche FIVET nell ambito di coppie con infertilità da causa maschile, pur avendosi globalmente buoni risultati in termini di gravidanza, capitano in maniera occasionale casi di mancata fertilizzazione di tutti gli ovociti inseminati. Questo fenomeno biologico a volte può essere ricondotto a condizioni particolari e sfavorevoli: quali una bassa qualità ovocitaria, o una situazione seminale peggiore del consueto. Al contrario, altre volte è idiopatico, nel senso che non ha una spiegazione. Una possibile spiegazione di questa mancata, totale e idiopatica fertilizzazione ovocitaria ci è suggerita dalla ricerca di base e si incentra sul fenomeno biologico della frammentazione del DNA degli spermatozoi.

4 1.2. LA FRAMMENTAZIONE DEL DNA DEGLI SPERMATOZOI Gli spermatozoi umani eiaculati presentano, in proporzioni variabili, una serie di anomalie a livello genomico. Tali anomalie consistono in: -difetti nel numero di cromosomi (aneuploidia) -difetti nella condensazione della cromatina -ridotta deposizione delle protamine -aumentata sensibilità alla denaturazione in situ del DNA indotta da trattamento con acidi o con calore -presenza di tagli a singolo e a doppio filamento nella doppia elica del DNA -sostituzioni di basi azotate modificate, tra cui la 8-idrossideossiguanosina (8-OHdG), considerata un marker del danno ossidativo al DNA (Kodama H et al., 1997; Shen HM et al., 1999). La frammentazione del DNA, tra le anomalie genomiche menzionate, rappresenta un danno presente in maniera elevata negli spermatozoi di pazienti sub-fertili ed infertili e, si riferisce alla presenza di tagli a singolo e doppio filamento nell elica del DNA. Le ricerche nel campo della frammentazione del DNA negli spermatozoi umani ha subito un notevole incremento negli ultimi decenni, in quanto, quest anomalia genomica è considerata di notevole importanza per almeno due ragioni. La prima ragione si inserisce nella ricerca di parametri predittivi dello stato di fertilità maschile che siano di maggior valore, sia clinico che statistico, di quelli attualmente in uso, che sono essenzialmente i parametri seminali standard determinati dallo spermiogramma, secondo le direttive dell organizzazione mondiale della sanità (OMS o WHO) (1999). La seconda ragione risiede nel fatto che la frammentazione del DNA, come detto in precedenza, ha un incidenza particolarmente elevata in pazienti sub-fertili ed infertili, cioè,

5 pazienti in cui, le tecniche di fecondazione assistita (ART) rappresentano spesso l unica opzione terapeutica per il trattamento dell infertilità. Poiché queste tecniche, sia quelle meno invasive come la FIVET che quelle più invasive come la ICSI prevedono il superamento di molte delle barriere esistenti alla fecondazione naturale, è possibile supporre che spermatozoi con DNA danneggiato possano partecipare al processo di fertilizzazione. Questo a fronte di una conoscenza scarsa sulle conseguenze di una tale eventualità sul successivo sviluppo embrionale e in generale sulla salute della progenie. Quanto all origine della frammentazione del DNA degli spermatozoi, le cause ed i meccanismi alla base di questo fenomeno non sono stati ancora del tutto chiariti, sebbene la loro conoscenza risulti di notevole interesse in quanto potrebbero portare allo sviluppo di nuove terapie per i pazienti con ridotta fertilità, oppure al trattamento in vitro degli spermatozoi scelti per essere utilizzati per tecniche di fecondazione assistita (ARTs). Le teorie attualmente proposte nella letteratura scientifica sono tre, ciascuna delle quali spiega e attribuisce l origine della frammentazione negli spermatozoi a fenomeni diversi. Nello specifico,queste tre teorie sono: -Teoria dell apoptosi abortiva; -Teoria del difetto maturativo; -Teoria dello stress ossidativo. Attualmente non esistono verifiche definitive di tali teorie e, molti ricercatori ritengono che il danno del DNA negli spermatozoi sia il risultato di una combinazione di risultati diversi. Quanto alle conseguenze della frammentazione del DNA degli spermatozoi, la presenza di alterazioni del DNA potrebbe avere un impatto negativo nelle ART. La frammentazione del DNA potrebbe infatti alterare la capacità del DNA spermico di decondensare e di sostenere un corretto sviluppo embrionale. Sebbene sia noto che l oocita sia in grado di riparare i danni al DNA degli spermatozoi, alcuni danni specifici del DNA spermatico

6 potrebbero non essere riparabili, oppure, se tali danni sono eccessivi, potrebbero non essere riparati completamente. Infatti, la capacità dell ovocita di riparare a questi danni dipende, oltre che dall entità del danno, anche dalla sua qualità (e perciò dall età della donna). Nonostante sia stato dimostrato sperimentalmente che gli spermatozoi con DNA frammentato riescano a fertilizzare l oocita, formare il pronucleo maschile e permettere il seguente sviluppo embrionale, almeno fino a certi stadi; gli studi sull effetto della frammentazione del DNA sulle percentuali di riuscita delle tecniche di procreazione medicalmente assistita sono per lo più in contrasto tra di loro. Relativamente alle cause di queste discrepanze, una premessa ovvia ma necessaria è che l esito della fertilizzazione dipende non solo dalla struttura e funzionalità dello spermatozoo fecondante, ma anche nuovamente - da quelle dell oocita fecondato. Tale questione assume un importanza particolare soprattutto quando si parla di coppie che ricorrono alla fecondazione medicalmente assistita, in cui l età della partner femminile è piuttosto avanzata. Infatti l età della donna incide notevolmente sulla qualità oocitaria e quindi anche sulla capacità riparativa dell oocita nei confronti del danno al DNA. E dunque chiaro che molte delle discordanze dipendono dalle diverse casistiche degli studi, riferendosi segnatamente a differenze dovute ad una diversa incidenza del fattore femminile. Un alta possibile causa del disaccordo fra i dati pubblicati, è relativa alla tecnica usata per rivelare la frammentazione del DNA. Anche considerando solo le due tecniche più utilizzate, cioè il TUNEL e l SCSA, possiamo osservare che esse non misurano lo stesso tipo di danno al DNA. Infatti il TUNEL rivela il danno reale, gli effettivi tagli (a singola e doppia elica) del DNA. L SCSA invece misura un danno potenziale cioè misura la suscettibilità della cromatina alla denaturazione indotta. Considerando l interesse in campo andrologico su questo fenomeno, ogni miglioramento tecnico per la rilevazione della frammentazione del DNA risulta importante.

7 A questo proposito, presso il Laboratorio di Andrologia della Università di Firenze, tutta una serie di studi hanno evidenziato l utilità di accoppiare la TUNEL alla colorazione nucleare con ioduro di propidio (PI). Questa colorazione, infatti, oltre ad escludere i corpi apoptosici (M540 bodies) particolarmente abbondanti nei pazienti oligospermici e certamente interferenti con il valore finale della frammentazione del DNA nel campione in esame; ha permesso di identificare due popolazioni di spermatozoi: a bassa avidità per il PI (PI dimmer ) ad alta avidità per il PI (PI brighter ) La popolazione PI dimmer è composta interamente da spermatozoi con DNA frammentato, e la sua incidenza ha una significativa correlazione inversa con i parametri seminali tradizionali (concentrazione, motilità, morfologia). Al contrario, la popolazione PI brighter é composta solo parzialmente da spermatozoi con DNA frammentato, e la percentuale di questi ultimi risulta indipendente dai parametri seminali tradizionali. Sulla base di questi studi, da un lato possiamo spiegare le discrepanze attualmente esistenti in letteratura sull argomento frammentazione del DNA spermatico e fertilità maschile / PMA ; dall alto, potremmo ipotizzare che la frammentazione del DNA valutata indipendentemente nelle due popolazioni PI dimmer / PI brighter potrebbe svelare nuove e più significative associazioni con la capacità dello spermatozoo di fecondare l ovocita.

8 2. SCOPO DELLA RICERCA RISULTATI ATTESI 2.1. SCOPO DELLA RICERCA Scopo della presente ricerca è quello di valutare se la mancata fertilizzazione ovocitaria idiopatica all interno di un programma FIVET effettuato per fattore maschile possa essere in qualche modo correlata alla qualità/quantità di frammentazione del DNA degli spermatozoi, quale osservato applicando la tecnica combinata TUNEL / PI. Allo scopo, verranno selezionati casi consecutivi di mancata, totale fertilizzazione ovocitaria idiopatica, cioè riconducibile alle seguenti condizioni: Donna : età inferiore a 38 anni assenza di malattia endometriosica pelvica Uomo: OAT con test di capacitazione > FSH 7 UI/mL Cariotipo regolare 46XY Se eseguito, assenza di microdelezioni del cromosoma Y Assenza di fatti flogistici genitali (esami colturali negativi) In tutti questi casi il paziente eseguirà una raccolta di liquido seminale, sulla quale il Laboratorio di Andrologia valuterà la frammentazione del DNA spermatico mediante la tecnica TUNEL / PI: ottenendo in tal modo il valore della frammentazione PI dimmer e di quella PI brighter. Queste valutazioni percentuali (PI d / PI b ) saranno paragonate con quelle ottenute nel liquido seminale di due differenti campioni di riferimento/controllo, rappresentati da: -Uomini fertili (=gravidanza della partner in essere), che parteciperanno in modo volontario alla ricerca

9 -Pazienti sottoposti a FIVET per fattore maschile, ed in cui si sia osservata una normale fertilizzazione ovocitaria casi. Ognuno dei tre gruppi di uomini dovrebbe avere una composizione numerica minima di RISULTATI ATTESI / PROSPETTIVE CLINICHE Difficile una valutazione prospettica. Secondo i dati preliminari di cui abbiamo parlato prima, è possibile ipotizzare che nei casi di mancata fertilizzazione ovocitaria ci sia una frammentazione del DNA maggiore e di tipo PI brighter. Infatti i dati preliminari in nostro possesso indicano che è proprio una minore frammentazione del DNA nella popolazione PI brighter che distingue i soggetti fertili. Ciò è coerente col fatto che la frammentazione in quest ultima popolazione è indipendente dalla qualità del seme e pertanto uno spermatozoo frammentato può presentare buone caratteristiche di motilità e di morfologia. E comunque indispensabile, ovviamente, rafforzare questi dati incrementando sia il numero di soggetti fertili che confrontare questi con un gruppo di uomini infertili che abbiano però presentato una fertilizzazione ovocitaria FIVET. Un intervento terapeutico è al momento solo opinabile (antiossidanti?; terapia stimolante la spermatogenesi?).

10 2.3. ATTIVITA ASSISTENZIALE PREVISTA PER L ASSEGNISTA Per la conduzione della ricerca è indispensabile che l assegnista possa eseguire attività assistenziale, relativamente alle seguenti attività: -Attività ambulatoriale (visite ginecologiche, consulenze preconcenzionali, visite/consulenze per sterilità di coppia) -Ecografie ginecologiche -Ecografie ostetriche nel primo trimestre di gravidanza -Prelievo ovocitario -Transfer embrionario -Aspirazione ecografica transvaginale di cisti ovariche -Esecuzione di biopsie endometriali / prelievi citologici endometriali

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