La Fertilizzazione in-vitro: Procedure Cliniche ed Aspetti Normativi.

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1 La Fertilizzazione in-vitro: Procedure Cliniche ed Aspetti Normativi Prof. Marco FILICORI GynePro Riproduzione Centri Medici GynePro

2 Tecniche di procreazione medicalmente assistita primo livello inseminazione intrauterina (IUI) secondo livello fecondazione in vitro (FIV) tradizionale intracytoplasmic sperm injection (ICSI) tecniche ancillari trasferimento embrioni a stadio di blastocisti intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) congelamento degli ovociti diagnosi pre-impianto (PGD) screening pre-impianto (PGS) aspetti normativi

3 Tecniche di procreazione medicalmente assistita primo livello inseminazione intrauterina (IUI) secondo livello fecondazione in vitro (FIV) tradizionale intracytoplasmic sperm injection (ICSI) tecniche ancillari trasferimento embrioni a stadio di blastocisti intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) congelamento degli ovociti diagnosi pre-impianto (PGD) screening pre-impianto (PGS) aspetti normativi

4 GnRH analog regimens in gonadotropin ovulation induction menstrual day -7 cycle day day +2 day +6 hcg/lh GnRH agonist FSH/hMG GnRH antagonist FSH/hMG

5 Currently available gonadotropin preparations for ovulation induction HUMAN DERIVED HP hfshfsh 75 IU HP hmg FSH 75 IU hcg FSH absent LH activity <0.1 IU LH activity <0.1 IU Fostimon, activity 75 IU Meropur, hcg 250-5,000 IU Fostimon, Bravelle 5,000 IU Gonasi, Meropur, Menopur, Merional Gonasi, Choragon, Pregnyl RECOMBINANT rfshα FSH IU LH absent rfshα α + rlh FSH 150 IU LH 75 IU rfshβ FSH IU LH absent rlh FSH absent LH 75 IU rcg FSH absent CG 250 µg Gonal F Pergoveris Puregon, Follistim Luveris Ovitrelle, Ovidrel

6 Stimolazione della follicologenesi multipla nei protocolli di procreazione medicalmente assistita dose iniziale di FSH: IU/die durata del trattamento: giorni aggiustamenti di dose: dal 5-7 giorno di trattamento monitoraggio ecografie pelviche transvaginali misurazione dell estradiolo sierico eseguito nelle giornate 0, 5 e poi ogni 2-3 giorni fino all ottenimento dei parametri ottimali di maturazione follicolare

7 Monitoring controlled ovarian stimulation with tri-dimensional ultrasound and follicle measuring software

8 Fertilizatione in-vitro con la intracytoplasmic sperm injection (ICSI) rimozione del cumulo ooforo e della corona radiata per mezzo di digestione enzimatica con ialuronidasi ricombinante ed una delicata aspirazione con pipette di plastica valutazione della maturità nucleare ovocitaria (metafase II) iniezione degli spermatozoi con tecnica ICSI iniezione degli spermatozoi con tecnica ICSI negli ovociti maturi incubazione degli ovociti iniettati fertilizzazioni verificate a 24 ore ulteriore incubazione degli zigoti per ore valutazione del numero dei blastomeri e della qualità embrionaria embryo transfer 2-3 giorni dopo l OPU 5-6 giorni dopo l OPU (blastocisti)

9 Tecniche di procreazione medicalmente assistita primo livello inseminazione intrauterina (IUI) secondo livello fecondazione in vitro (FIV) tradizionale intracytoplasmic sperm injection (ICSI) tecniche ancillari trasferimento embrioni a stadio di blastocisti intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) congelamento degli ovociti diagnosi pre-impianto (PGD) screening pre-impianto (PGS) aspetti normativi

10 Trasferimento degli embrioni in 2-3 giorno o a stadio di blastocisti (5-6 giorno) trasferimento embrionario al giorno 2-3 vantaggi maggiore probabilità di aver embrioni disponibili per l ET svantaggi minori informazioni disponibili sulle potenzialità evolutive degli embrioni coltura prolungata e transfer di blastocisti al giorno 5-6 vantaggi maggiore probabilità che gli embrioni sopravvissuti abbiano più elevate potenzialità di sviluppo maggiori tassi di impianto e gravidanza svantaggi più tecnicamente complesso meno efficace in donne di età più elevata applicabile solo a pazienti con buona risposta ovarica (discreto numero di ovociti/embrioni) solo il 40-50% degli ovociti fertilizzati raggiungono lo stadio di blastocisti necessità di eventuale congelamento delle blastocisti in soprannumero

11 Linee guida 2008 dell American Society for Reproductive Medicine (ASRM) per il trasferimento embrionario

12 Comparison of cleavage stage vs. blastocyst embryo transfer Reh et al, Fertil Steril, in press, 2009 day 3 ( ) 99) day 5 ( ) 06) patients age 35.3± ±4.1 NS embryos transferred 3.7± ±0.7 <0.001 implantation 29.9% 38.9% <0.001 clinical pregnancies 57.1% 58.0% NS twins 21.5% 24.3% NS triplets 11.1% 2.5% <0.001 miscarriages 6.4% 10.2% NS live births 52.6% 51.4% NS P

13 Tecniche di procreazione medicalmente assistita primo livello inseminazione intrauterina (IUI) secondo livello fecondazione in vitro (FIV) tradizionale intracytoplasmic sperm injection (ICSI) tecniche ancillari trasferimento embrioni a stadio di blastocisti intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) congelamento degli ovociti diagnosi pre-impianto (PGD) screening pre-impianto (PGS) aspetti normativi

14 tecnica Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection (IMSI) x ingrandimenti (o più) rispetto ai x ingrandimenti della ICSI classica eseguita in tempo reale identificazione degli spermatozoi di morfologia ottimale forma regolare superficie liscia vacuoli piccoli o assenti applicazioni cliniche miglioramento terapeutico in caso di ripetuti fallimenti ICSI (fertilizzazioni e/o impianto) riduzione tassi abortività applicazioni controverse severissima oligoastenoteratospermia

15 Tecniche di procreazione medicalmente assistita primo livello inseminazione intrauterina (IUI) secondo livello fecondazione in vitro (FIV) tradizionale intracytoplasmic sperm injection (ICSI) tecniche ancillari trasferimento embrioni a stadio di blastocisti intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) congelamento degli ovociti diagnosi pre-impianto (PGD) screening pre-impianto (PGS) aspetti normativi

16 Slow cooling Vitrification Vitrifikation 1 sec C/min - 50,000 C/min

17 Tecniche di procreazione medicalmente assistita primo livello inseminazione intrauterina (IUI) secondo livello fecondazione in vitro (FIV) tradizionale intracytoplasmic sperm injection (ICSI) tecniche ancillari trasferimento embrioni a stadio di blastocisti intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) congelamento degli ovociti diagnosi pre-impianto (PGD) screening pre-impianto (PGS) aspetti normativi

18 Patologie diagnosticabili con la diagnosi pre-impianto (PGD) malattie autosomiche recessive fibrosi cistica atrofia muscolare spinale talassemia anemia falciforme malattie autosomiche dominanti distrofia miotonica corea di Huntington malattia di Charcot-Marie-Tooth rene policistico sindrome di Marfan malattie legate al cromosoma X sindrome da X fragile distrofia muscolare di Duchenne emofilia A

19 Diagnosi Genetica Pre-impianto (PGD) Screening Genetico Pre-impianto (PGS) procedure embriologiche perforazione della zona pellucida (laser, soluzione acida Tyrode, ago) aspirazione di 1-2 blastomeri (cellule dell embrione) genetiche polymerase chain reaction (PCR) per amplificare un segmento del genoma, seguita da analisi del materiale genetico ottenuto (primers, restriction enzymes, heteroduplex analysis) fluorescence in-situ hybridization (FISH) per identificare specifiche sequenze del DNA nei cromosomi o il numero di copie dei cromosomi

20 Quali e quante cellule biopsiare? primo o secondo globulo polare meno invasiva ma non offre informazione sul contributo paterno giorno 3 un blastomero lieve riduzione dei tassi di impianto (Munnè et al, 2009; Cohen et al, 2007) giorno 3 due blastomeri maggiore riduzione dei tassi di impianto (Munnè et al, 2009; Cohen et al, 2007) giorno 5 biopsia della blastocisti biopsia della parte esterna dell embrione (trofoectoderma) numero embrioni più limitato tecnica più complessa

21 Problematiche legate alla PGD/PGS necessità di un numero elevato di embrioni (almeno 6) di buona qualità (6-8 blastomeri) problemi potenzialmente legati all età materna avanzata spesso ridotto numero di ovociti/embrioni da analizzare maggiore fragilità embrionaria danneggiamento dell embrione al momento del prelevo dei blastomeri più frequente nel caso di prelevo di 2 rispetto a 1 blastomero e nelle donne di età più elevata possibile riduzione dei tassi di gravidanza limitazioni legate al numero di cellule analizzabili (1-2) alla quantità di materiale genetico disponibile ai tempi tecnici delle analisi possibilità di falsi negativi 2% per le patologie recessive 11% per le patologie dominanti necessità di riconfermare la normalità del concepito con villocentesi o amniocentesi

22 Potenziali indicazioni per il preimplantation genetic screening (PGS) identificazione di embrioni con aneuploidia associata a elevata età del partner femminile aborto ricorrente fallimenti ripetuti dell impianto sterilità da fattore maschile tuttavia, gli studi prospettici randomizzati finora eseguiti selezionando gli embrioni euploidi con la PGS non hanno mostrato un aumento dei tassi di successo della PMA Donoso et al, Hum Reprod Update 13:15, 2007 raccomandazione del Practice Committee dell ASRM (2008) available evidence does not support the use of PGS for these indications

23 Tecniche di procreazione medicalmente assistita primo livello inseminazione intrauterina (IUI) secondo livello fecondazione in vitro (FIV) tradizionale intracytoplasmic sperm injection (ICSI) tecniche ancillari trasferimento embrioni a stadio di blastocisti intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) diagnosi pre-impianto (PGD) screening pre-impianto (PGS) aspetti normativi

24 Art 13 Legge 40, 19 Febbraio 2004 Comma 3b. Sono, comunque, vietati:. ogni forma di selezione a scopo eugenetico degli embrioni e dei gameti, ad eccezione degli interventi aventi finalità diagnostiche e terapeutiche, Art 14 Comma 1. È vietata la crioconservazione e la soppressione di embrioni, fermo restando quanto previsto dalla legge 22 maggio 1978, n Comma 2. Non devono creare un numero di embrioni superiore a quello strettamente necessario ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre. Comma 3. Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione è consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile.

25 Sentenze tribunali ordinari e regionali Diagnosi pre-impianto sentenza Tribunale di Cagliari, 22 settembre 2007 deve essere dunque affermata la liceità della diagnosi preimpianto quando, come nel caso di specie, la stessa risponda alle seguenti caratteristiche: sia stata richiesta dai soggetti indicati nell art. 14, 5 comma, l. n. 40/2004; abbia ad oggetto gli embrioni destinati all impianto nel grembo materno; sia strumentale all accertamento di eventuali malattie dell embrione e finalizzata a garantire a coloro che abbiano avuto legittimo accesso alle tecniche di procreazione medicalmente assistita una adeguata informazione sullo stato di salute degli embrioni da impiantare. sentenza TAR del Lazio, 31 ottobre 2007 annulla le Linee Guida di cui al D. M nella parte contenuta nelle Misure di Tutela dell embrione laddove si statuisce che ogni indagine relativa allo stato di salute degli embrioni creati in vitro, ai sensi dell'articolo 13, comma 5, dovrà essere di tipo osservazionale.

26 Revisione linee guida PMA 30 Aprile 2008

27 Sentenze tribunali ordinari e regionali Numero embrioni creati e loro trasferimento ordinanza Tribunale di Firenze, 26 Agosto ) solleva questione di legittimità costituzionale dell'art. 14, comma 2, della legge 19 febbraio 2004, n. 40, limitatamente alle parole «ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre», per contrasto con gli artt. 2, 3 e 32 della Costituzione; 2) solleva questione di legittimità costituzionale dell'art. 14, comma 3, della legge 19 febbraio 2004, n. 40, limitatamente alle parole «Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile» «di forza maggiore» «non prevedibile al momento della fecondazione» «fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile», per contrasto con gli artt. 2, 3, 13 e 32 della Costituzione; 3) solleva questione di legittimità costituzionale dell'art. 6, comma 3, della legge 19 febbraio 2004, n. 40, nella parte in cui non contiene, in fine, le parole «e, dalla donna, anche successivamente», per contrasto con gli artt. 2, 3, 13 e 32 della Costituzione; 4) solleva d'ufficio questione di legittimità costituzionale dell'art. 14, comma 4, della legge 19 febbraio 2004, n. 40, per contrasto con gli artt. 2, 3, 13 e 32 della Costituzione;

28 Effetti della sentenza della Corte Costituzionale del 31 Marzo 2009 relativa alla Legge 40/2004 eliminazione: del limite relativo al numero di embrioni che possono essere creati per ogni ciclo di PMA della necessità di impianto (trasferimento) unico e contemporaneo degli embrioni ottenuti raccomandazione che: il trasferimento degli embrioni, da realizzare non appena possibile, debba essere effettuato senza pregiudizio della salute della donna per estensione rispetto alla legge 194/1978, sia la salute fisica che mentale della donna

29 Eventi che possono portare a pregiudizi per la salute psicofisica della donna nel corso di PMA sindrome di iperstimolazione ovarica (OHSS) o altri gravi problemi sanitari non prevedibili al momento della fecondazione possibilità di congelamento embrionario già prevista dalla legge 40/2004 concepimento di embrioni affetti da gravi patologie genetiche gravidanze gemellari aumento di morbilità e mortalità fetale rischi e disagi connessi a stimolazioni ovariche ripetute problematiche psicologiche ed economiche relative alle complicanze e fallimenti delle procedure di PMA

30 Sentenze tribunali ordinari e regionali Diagnosi pre-impianto sentenza Tribunale di Bologna, 29 Giugno 2009 relativa a paziente portatrice sana di Distrofia Muscolare di Duchenne,.. che tale gravissima patologia è stata purtroppo trasmessa al figlio G., avuto dalla coppia in data 8 settembre 1999, sentenzia che: il Centro esegua a favore dei ricorrenti l applicazione delle metodiche della procreazione medicalmente assistita,, previa diagnosi preimpianto di un numero minimo di sei embrioni, e provvedendo a trasferire nell utero della Signora B. gli embrioni creati che non presentino la specifica patologia di cui la stessa è portatrice, in base alle direttive impartite dalla medesima paziente,, provvedendo alla crioconservazione per un futuro impianto degli embrioni risultati idonei che non sia possibile trasferire immediatamente e, comunque, di quelli risultati affetti della patologia di cui la Signora B. è portatrice.

31 Conclusioni sono stati rimossi gli ostacoli legislativi relativi alle limitazioni nel numero degli embrioni che possono essere creati con tecniche di PMA il trasferimento degli embrioni creati può non essere contemporaneo e comunque deve essere rispettoso della salute della paziente e delle richieste della coppia è consigliabile che il congelamento degli embrioni sia limitato a condizioni necessarie per prevenire problematiche per la salute materno-infantile alla luce delle sentenze emesse negli ultimi anni, appare ormai legittima la possibilità di applicare le tecniche di diagnosi pre-impianto per identificare gravi patologie genetiche embrionali è auspicabile che la coppia fornisca consenso scritto per ogni decisione relativa a procedure che coinvolgono la creazione ed il trattamento degli embrioni

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