Aspergillus Cryptococcus Pneumocystis
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- Gabriella Falcone
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1 UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA Aspergillus Cryptococcus Pneumocystis
2 Genere Aspergillus principali specie d interesse medico A. fumigatus A. flavus A. niger A. nidulans A. terreus A. versicolor etc. aspetto delle colonie in agar Sabouraud
3 Aspergillus: cenni di epidemiologia e ecologia Habitat: suolo, materiale organico vegetale e animale (legno, foraggio, alimenti ) miceti cosmopoliti Propagazione dei conidi attraverso l aria: un uomo inala normalmente 6x10 7 cellule fungine / die 8% Aspergillus. La percentuale sale in ambienti chiusi o ricchi di vegetali: 6 x 10 8 celllule fungine (80% Aspergillus e Mucor)
4 Morfologie delle ife conidiofore e fattori di virulenza Prodotti secreti da Aspergllus: Tossine: - aflatossina (epatotossicità e cancerogenicità) - gliotossina (inibisce la fagocitosi da parte dei macrofagi e l attivazione dei linfociti B) Enzimi: - elastasi - proteasi - catalasi conidi fialidi vescicola fialidi metule testa ifa conidiofora Morfologia delle teste conidiali Radiata a ventaglio Colonnare Radiata globosa
5 Patologie da Aspergillus Micotossicosi, per ingestione di cibi contaminati Otite ABPA, malattia broncopolmonare allergica Micetoma, colonizzazione micotica di cavità preesistenti Malattia sistemica, malattia invasiva coinvolgente uno o più organi IPA, aspergillosi polmonare (invasiva) aspergillosi disseminata deficit delle risposte innate (macrofagi e neutrofili) sono i principali fattori predisponenti
6 Difese immunitarie verso Aspergillus Immunità naturale Macrofagi alveolari verso CONIDI Neutrofili verso IFE Immunità specifica Cellulo-mediata Umorale Risposte mediate da cellule Th Th 1 = protezione Th 2 = suscettibilità?
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8 Patologie da Aspergillus Micotossicosi (aflatossina di A. flavus) Otite esterna (A. niger)
9 ABPA Aspergillosi Bronco-Polmonare Allergica (spesso in concomitanza con asma o fibrosi cistica) Reazione allergica agli antigeni delle spore dell aspergillo Sintomi: episodi intermittenti caratterizzati da malessere, tosse e dispnea. A lungo termine l ABPA, se non trattata, può provocare danni polmonari permanenti (fibrosi polmonare).
10 Aspergilloma (micetoma) Segni e sintomi nelle prime fasi di sviluppo dell aspergilloma, i malati non mostrano sintomi formazione di ife all interno di una cisti polmonare o di una cavità preesistente (tubercolosi, sarcoidosi), di solito nel lobo superiore. in seguito: - perdita di peso, - tosse cronica - debolezza - emottisi (50-80% dei casi)
11 IPA (Invasive Pulmonary Aspergillosis) = aspergillosi polmonare invasiva causata da inalazione di conidi Condizioni predisponenti neutropenia (<500/mmc): trapianto di midollo o di organo,. terapia con corticosteroidi infezione da HIV I segni clinici e i sintomi sono non specifici: febbre dispnea tosse non produttiva emottisi dolore toracico L infezione è rapidamente progressiva
12 ASPERGILLOSI DISSEMINATA La crescita miceliale si verifica inizialmente nel polmone poi, in seguito ad angioinvasione e/o broncoinvasione o per continuità, l infezione si diffonde ad altri organi come cervello, cuore, cute.
13 Aspergillosi Invasiva (IA) IA è la più frequente infezione fungina potenzialmente letale la mortalità è superiore all 80% è comune nei pazienti immunosoppressi, particolarmente quelli sottoposti a trapianto di organi solidi fino al 90% di tali pazienti con aspergillosi invasiva presentano infezione polmonare spesso con coinvolgimento del SNC (10-50%)
14 manifestazioni cliniche Infect Dis Clin North Am - 01-Dec-2002; 16(4):
15 Hope, WW, Walsh TJ, Denning DW. The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus species. Medical Mycology 2005, 43: S
16 ASPERGILLOSI POLMONARE / INVASIVA Diagnosi La diagnosi microbiologica è spesso difficile perché a) l espettorato e l emocoltura possono risultare negativi. Il campione migliore è il lavaggio broncoalveolare (BAL, >50% di positivi) b) Aspergillus può essere presente come contaminante (è ubiquitario) Per una diagnosi corretta occorrono i reperti microbiologici + istologia + Rx + Scan
17 Esame microscopico campioni: - espettorato o lavaggio broncoalveolare - frammenti bioptici espettorato/bal biopsie tessuti senza colorazione esame a fresco col. di routine col. per funghi col. fluorescenti Gram Calcofluor white Blankophor GMS, PAS GMS: Gomori Methenamine Stain PAS: Periodic acid Schiff (colorazioni istologiche)
18 Esame microscopico a fresco Espettorato: ife fungine (Aspergillus?) Lavaggio bronco-alveolare: ife e conidiofori (A. fumigatus)
19 Esame colturale Terreni "classici " come Sabouraud (+ antibiotici), (ma può crescere anche in agar sangue, agar cioccolato) a volte per l identificazione di specie non comuni si possono usare terreni "particolari" come malt-extract agar, corn-meal agar, Czapek agar Incubazione: temperatura atmosfera durata C aerobia 2-6 settimane
20 IDENTIFICAZIONE dei FUNGHI FILAMENTOSI a) osservazione delle colonie: colonie filamentose prima bianche, poi - verdi (A. fumigatus) - marrone (A. flavus) - nere (A. niger)
21 Identificazione dei FUNGHI FILAMENTOSI b) osservazione microscopica per osservare i corpi fruttiferi, ife e conidi (prelevati toccando il micelio aereo con del nastro adesivo che va attaccato su un vetrino dove c è una goccia di Blu Cotton) Esame microscopico
22 b) esame microscopico ife settate, conidiofori, vescicole, fialidi, conidi A. fumigatus A. flavus A. niger
23 Esame sierologico: ricerca di antigeni Test per la ricerca di antigeni fungini in circolo (galattomannani) Potenzialmente utili per la diagnosi di aspergillosi invasiva Sensibilità: 50% - 90% Specificità 81% - 93% In quali pazienti? Pazienti immunocompromessi Sospetto clinico: Aspergillosi invasiva
24 SIEROLOGIA nella ASPERGILLOSI anticorpi: in pratica utili solo nell ABPA IgM + IgG (precipitine) Aspergilloma ABPA Anticorpi IgE Malattie allergiche
25 PCR nella diagnosi di Aspergillosi invasiva Considerazioni BAL spesso contaminato da conidi aspergillari Ricerca sul sangue: scarse contaminazioni ambientali facilità prelievo possibilità di prelievi ripetuti ma Informazioni contrastanti: DNA aspergillare nel sangue e antigenemia Scarse informazioni: DNA aspergillare nel sangue e decorso clinico
26 Sezioni istologiche da aspergillosi polmonare Gomori-Grocott = impregnazione argentica (colorazione istologica) Aspergillosi polmonare 1000 x Aspergillosi polmonare
27 Advanced Studies in Medicine. 2003;3(1A):S12-S13
28 Trattamento ABPA: prednisone ASPERGILLOSI IPA: amfotericina B azolici (itraconazolo, voriconazolo) echinocandine Studio su possibile profilassi con Amfotericina B aerosolizzata Aerosolized liposomal amphotericin B for the prevention of invasive pulmonary aspergillosis during prolonged neutropenia: a randomized, placebo-controlled trial. Rijnders BJ et al. Clin Infect Dis May 1;46(9):1401-8
29 Genere Cryptococcus Crescita su agar Sabouraud
30 - Cryptococcus è sempre nella forma di lievito - nell ambiente è stato identificato il ciclo di riproduzione per via sessuata Fase asessuata: Cryptococcus neoformans Fase sessuata: Filobasidiella neoformans Riproduzione sessuata
31 Cryptococcus neoformans Esistono 4 sierotipi e 3 varietà di C. neoformans: C. neoformans var. neoformans (sierotipo D) Habitat: suolo, particolarmente in presenza di feci di piccione C. neoformans var. gattii (sierotipi B e C) Serbatoio naturale è rappresentato da piante di Eucalyptus camaldulensis ma... C. neoformans var. grubii (sierotipo A)
32 ...invece che C. neoformans var. gattii proposta nuova specie: Cryptococcus gattii Cryptococcus gattii: An Emerging Cause of Fungal Disease in North America A new strain had been discovered which is hypervirulent. 6 persons already died due to this deadly fungus... non-immunocompromised hosts are usually affected endemic in Australia, Papua New Guinea, etc Dixit et al Interdisciplinary Perspectives on Infectious DiseasesV, 2009
33 Fattori di virulenza di C. neoformans Capsula polisaccaridica (glucuronoxilomannano, GXM; galattoxilomannano, GalXM): azione antifagocitaria può sopprimere la funzionalità delle T-cells Produzione di fenolossidasi (o LACCASI) che catalizza la produzione di melanina ureasi (forse utilizzato per attraversare la barriera emato-encefalica) proteasi fosfolipasi
34 Cryptococcus spp - infezioni cutanee o di ferite - polmonite criptococcica - meningite criptococcica
35 infezioni cutanee lesioni nodulari, ombelicate in pazienti con AIDS
36 polmonite criptococcica Infezione opportunistica: importante causa di mortalità in pazienti con AIDS e in soggetti trapiantati. La via d ingresso è per inalazione Nell immunodepresso diffonde secondariamente al SNC: meningite criptococcica (cfr. assenza del complemento, e quindi di opsonizzazione, alta concentrazione di creatinina ed asparagina)
37 Diagnosi microbiologica esame microscopico dopo Gram: lieviti Gram + India ink
38 Diagnosi microbiologica esame colturale in agar Sabouraud: colonie bianche cremose in presenza di L-DOPA: l enzima laccasi induce sintesi di melanina (colonie scure) CGB agar (Canavanine-Glycine-Bromthymol blue) Terreno differenziale per C. gattii vs. C. neoformans: C. gattii cresce in presenza di L-canavanina e utilizza la glicina come unica fonte di carbonio. C. gattii C. neoformans
39 Diagnosi di meningite criptococcica Esame del CSF: - elevato contenuto di proteine - diminuzione di glucosio - presenza di cellule (monociti). È fondamentale la dimostrazione di cellule capsulate di Cryptococcus in preparati colorati con inchiostro di china (India Ink) Ai fini diagnostici è anche utile la determinazione dell ANTIGENE mediante il test di agglutinazione al Latex o test immunocromtografico NON è utile la ricerca di anticorpi.
40 Colorazioni istologiche (ad es nella Criptococcosi polmonare) PAS (acido periodico di Shiff) le cellule fungine si colorano di rosso Gomori-Grocott = impregnazione argentica le cellule fungine si colorano di nero
41 Meningite criptococcica in pazienti AIDS Trattamento: inizialmente Amfotericina B + 5-fluorocitosina (attraversa la barriera emato-encefalica) mantenimento con Fluconazolo Mortalità: senza trattamento: 100% con trattamento: 20%
42 Pneumocystis jiroveci (in precedenza noto come P. carinii)
43 Pneumocystis jiroveci è stato considerato per anni un protozoo a causa della sua morfologia della sua suscettibilità a farmaci antiprotozoari (pentamidina o trimethoprim-sulfamethoxazolo). Più recentemente analogie nei ribosomi (16SrRNA simile ad ascomiceti e basidiomiceti), nella struttura del cell wall (β-1,3-glucano, si colora con metenamina-nitrato d argento) e la presenza di Elongation Factor 3 (è presente solo nei funghi e per il 57% è identico a quello di Saccharomyces) hanno indicato che P. jiroveci deve essere incluso tra i FUNGHI.
44 Pneumocystis è trasmesso da persona a persona per via respiratoria. Circa il 60% della popolazione è venuta a contatto con Pneumocystis entro i 4 anni di età. Si ritiene che, dopo una lieve infezione nell infanzia, il microorganismo rimane in uno stato di latenza fino a che una immunosopressione può provocare una riattivazione. L infezione da Pneumocystis nei bambini immunocompetenti provoca manifestazioni leggere o subcliniche; tuttavia in neonati prematuri o immunocompromessi può causare una polmonite interstiziale a plasmacellule.
45 Pneumocystis e AIDS La polmonite da Pneumoncystis rappresenta la principale causa di morbidità e la più comune infezione opportunistica nei pazienti HIV+ (colpisce il 60-85% dei pazienti AIDS ). Polmonite interstiziale (immagine a vetro smerigliato) con infiltrato mononucleare (soprattutto plasmacellule) Dispnea, cianosi, febbre, tosse non produttiva che può evolvere a grave distress respiratorio. Infezioni extrapolmonari (linfonodi, milza, fegato, midollo osseo) da Pneumocystis sono descritte con aumentata frequenza.
46 Pneumocystis nel polmone A livello degli alveoli polmonari Pneumocystis può essere evidenziato nelle due forme di trofozoite e cisti. I trofozoiti hanno forma ameboide e possono essere colorati con May-Grünwald-Giemsa. Le cisti misurano 5-7 µm e, colorate con la colorazione di Gomori, assomigliano ad una pallina da ping-pong parzialmente collassata. I trofozoiti si moltiplicano, formano pre-cisti e infine cisti mature contenenti 8 trofozoiti.
47 Ciclo vitale di Pneumocystis jiroveci Il modo di replicazione di P. jiroveci non è conosciuto sebbene gli stadi del ciclo vitale sono ben caratterizzati. Gli sporozoiti vengono liberati grazie alla rottura della parete cellulare della cisti e sono chiamati trofozoiti. Come il trofozoita progredisce alla fase di cisti non è noto.
48 Pneumocystis jiroveci nel polmone trofozoiti cisti
49 La diagnosi di polmonite da Pneumocystis è basata sulla dimostrazione del microrganismo nel polmone o nei campioni prelevati mediante broncoscopia o nei liquidi di lavaggio broncoalveolare. cisti Tra i metodi più efficaci vi è l immunofluorescenza diretta (DFA), altamente sensibile e specifica
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