Crescita microbica. Aumento del numero di cellule di una popolazione

Transcript

1 Crescita microbica Aumento del numero di cellule di una popolazione

2 Reazione energetiche Membrana Parete Ribosomi Flagelli Biosintesi assemblaggio Reazioni di polimerizzazione macromolecole

3 Scissione binaria

4 (in E. coli 40 min) (in E. coli 20 min) Ma come fa E. coli ad avere un tempo di generazione di 20 min????

5 Ciclo cellulare in E.coli citochinesi Raggiungimento della lunghezza soglia Inizio del processo di divisione Proteine di divisione e precursori del setto Raggiungimento della massa critica Settazione Divisione Inizio della replicazione del DNA Replicazione e ripartizione del DNA Copie DNA ripartito Tempo di generazione: tempo necessario affinchè una cellula si duplichi (o affinchè la popolazione duplichi il numero di cellule che la compongono)

6 replisoma

7 Da J Cell Biol November 5; 179(3): , Il citoscheletro dei batteri L unico elemento del citoscheletro presente nei batteri a forma sferica come ad esempio S. aureus (in alto a sinistra) è la proteina della divisione cellulare simile alla tubulina FtsZ (in verde), che si localizza in un anello al momento della divisione ne definisce il piano e recluta le altre proteine della divisione. Molti batteri di forma bastoncellare (in alto a destra) contengono anche una o più proteine simili all actina chiamate MreB (in rosso), che assumono una struttura elicoidale e sono essenziali per il controllo della forma cellulare. C. crescentus, un batterio a forma di vibrione (in basso), contiene un terzo elemento del citoscheletro simile ai filamenti intermedi la crescentina (in azzurro), necessaria alla curvatura della cellula si localizza sull interno della curvatura.

8 Prot ancoraggio Min C Ftsz PBP ATPsi

9 Migrazione verso il centro della cellula del sito di origine del cromosoma Assemblaggio del replisoma Replicazione del DNA a doppia forcella Min E riconosce il centro della cellula e inibisce MinC inibitore di FtsZ FtsZ (proteina tubulina simile) in assenza di inibitore polimerizza in sede centrale per formare un anello fra i due nucleosomi figli che in un processo complesso a cui partecipa la proteina FtsK e soprattutto MreB migrano verso i poli della cellula MreB actino-simile determina la forma dei bacilli e la migrazione dei cromosomi FtsZ porta alla formazione del DIVISOMA. Costituito da numerose subunità (10000) di FtsZ, che una volta formato l anello richiama altre proteine: FtsA un ATPasi, ZipA necessaria per l ancoraggio di FtsZ alla membrana, FtsI una PBP implicata nella sintesi del peptidoglicano. Il divisoma dirige prima l allungamento della cellula poi si depolimerizza stringendosi e spingendo la sintesi del setto. (sepimentazione).

10 The prokaryotic cytoskeleton In the recent decade, our view on the organization of the bacterial cell has been revolutionized by the identification of cytoskeletal elements. Most bacterial species have structural homologs of actin and tubulin that assemble into dynamic, filamentous structures at precisely defined subcellular locations. The essential cell division protein FtsZ forms a dynamic ring at mid-cell and is similar in its structure to tubulin. Proteins of the MreB family, which are structural homologs of actin, assemble into helical or straight filaments in the bacterial cytoplasm. As in eukaryotic cells, the bacterial cytoskeleton drives essential cellular processes such as cell division, cell wall growth, DNA movement, etc Compounds that inhibit the polymerization of FtsZ, by this blocking bacterial cell division might not only be valuable tools for basic research, but might also lead to novel therapeutic agents against pathogenic bacteria.. Fig. 1 Cellular localization of bacterial cytoskeleton proteins required for cell division and maintenance of cell shape. The tubulin-like FtsZ and the actin-like FtsA are essential cell division proteins in spherical S. aureus (a), rod-shaped E. coli (b), and crescent-shaped C. crescentus (c) cells. During cell division, FtsZ and FtsA localize at mid-cell in a ring-like structure, the divisome (indicated by the dotted lines). The actinlike MreB is present in elongated (rod-shaped) cells and forms intracellular helical filaments (indicated by the dashed black line). The intermediate-filament-like CreS protein is responsible for the crescent shape of C. crescentus and localizes to the inner curvature of the cell (thick grey line)

11

12 Crescita esponenziale Tempo di generazione 30

13 The rate of growth of a microbial culture. (a) Data for a population that doubles every 30 min. (b) Data plotted on an arithmetic (right ordinate) and a logarithmic scale (left ordinate) Progressione geometrica: 2, 4, 8, 16, 32..

14 Tempo di generazione Può essere calcolato conoscendo il n. di cellule iniziali, il n. di cellule ad un tempo t di crescita esponenziale, l intervallo di tempo t.

15 In termini matematici N=Nox2n logn= logno+nlog2 logn-logno=nlog2 log2 n=logn-logno log2 n=logn-logn o Per ogni tempo t il numero di cellule è dato dal numero di c. iniziali moltiplicato 2 elevato al numero di generazioni avvenute dal tempo 0. N= numero di cellule No= numero di cellule iniziali n=numero di generazioni avvenute nel tempo t Risolvo per n = numero di generazioni conoscendo t= tempo, posso calcolare il tempo di generazione come: g(tempo di generazione)= t/n

16 Se un batterio come E.coli potesse mantenere la crescita esponenziale per 24h il numero di cellule figlie sarebbero: Circa Con un peso di 5200 tonnellate Lunghezza di circa x 109 Km Per un consumo di tonnellate di glucosio

17 Curva di crescita

18

19 Metodi misurazione della crescita microbica METODI DIRETTI Conta totale Conteggio diretto al microscopio Conta vitale Diluizione e conta su piastra METODI INDIRETTI Metodi fotometrici Metodi indiretti (ATP, proteine) Massa cellulare (p.s.)

20 Alcune precisazioni Conta microscopica La conc. microbica deve essere abbastanza grande Difficile distinguere cellule vive e morte Conteggio soggettivo Necessità di colorare le cellule o l uso del M.C.F. Metodo economico, rapido,semplice Per eucarioti e lieviti esistono sistemi automatizzati

21 Alcune precisazioni Conteggi su piastra Metodo sensibile Vitalita cellulare Permette conteggi su materiali torbidi e particolati Per ottimizzare i risultati i campioni devono produrre colonie Nella conta per inclusione la temperatura può uccidere i microrganismi Critica la formulazione del terreno Non esiste assoluta certezza che ogni colonia derivi da una singola cellula. Si parla di CFU

22 Alcune precisazioni Misurazione fotometrica Concentrazione minima in grado di provocare torbidità del mezzo : 107 /ml Perdita di linearità per sospensioni concentrate Necessità di conoscere le curve di repere Semplicità Riproducibilità

23 Alcune precisazioni In caso di campioni in cui i microrganismi sono presenti a concentrazione bassa (acqua) si utilizza il sistema delle membrane filtranti (0,45 um). Osservazione al microscopio a fluorescenza (DAPI) Trasferimento della membrana su terreno agarizzato

24 Alcune precisazioni Misurazione della massa cellulare Det. Peso secco Poco sensibile Per sospensioni diluite bisogna centrifugare grandi quantità di liquido

25 Conta diretta al microscopio 25 quadrati = 1 mm2 Direct microscopic counting procedure using the Petroff-Hausser counting chamber.

26 LIMITI della conta microscopica 1. Cellule morte indistinguibili (col speciali?) 2. Difficoltà di conta per cellule di piccole dimensioni 3. Soggettività della conta

27 Two methods of performing a viable count (plate count). In either case the sample must usually be diluted before plating.

28

29 Procedure for viable counting using serial dilutions of the sample and the pour plate method.

30

31

32 Metodi misurazione della crescita microbica METODI DIRETTI Conta totale Conteggio diretto al microscopio Conta vitale Diluizione e conta su piastra METODI INDIRETTI Metodi fotometrici Metodi indiretti (ATP, proteine) Massa cellulare (p.s.)

33 Alcune precisazioni Conta microscopica La conc. microbica deve essere abbastanza grande Difficile distinguere cellule vive e morte Conteggio soggettivo Necessità di colorare le cellule o l uso del M.C.F. Metodo economico, rapido,semplice Per eucarioti e lieviti esistono sistemi automatizzati

34 Alcune precisazioni Conteggi su piastra Metodo sensibile Vitalita cellulare Permette conteggi su materiali torbidi e particolati Per ottimizzare i risultati i campioni devono produrre colonie Nella conta per inclusione la temperatura può uccidere i microrganismi Critica la formulazione del terreno Non esiste assoluta certezza che ogni colonia derivi da una singola cellula. Si parla di CFU

35 Alcune precisazioni Misurazione fotometrica Concentrazione minima in grado di provocare torbidità del mezzo : 107 /ml Perdita di linearità per sospensioni concentrate Necessità di conoscere le curve di repere Semplicità Riproducibilità

36 Alcune precisazioni Misurazione della massa cellulare Determinazione del Peso secco Poco sensibile Per sospensioni diluite bisogna centrifugare grandi quantità di liquido

37 Alcune precisazioni In caso di campioni in cui i microrganismi sono presenti a concentrazione bassa (acqua) si utilizza il sistema delle membrane filtranti (0,45 um). Osservazione al microscopio a fluorescenza (DAPI) Trasferimento della membrana su terreno agarizzato

38

39 Coltura continua Chemostato

40 Nel chemostato possiamo controllare Concentrazione del nutriente limitante resa di crescita Velocità di diluizione D = f / V velocità di crescita

41 In batch limitante

42

43 Curva di crescita Espressioni dei geni della resistenza: res.radiazioni e calore, accumulo bhb, prod. Antib.) Cellule avviate a morte programmata Cellule vive non coltivabili

44 Curva di crescita Crescita bilanciata Shift-up

45 shift-down shift-up

46 Log cell Coltura sincrona tempo filtrazione privazione rifornimento nutrienti privazione rifornimento luce