CHIMICA FARMACEUTICA DEI PRODOTTI BIOTECNOLOGICI
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- Nicolo Castellano
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1 CHIMICA FARMACEUTICA DEI PRODOTTI BIOTECNOLOGICI TITOLARE del CORSO: Prof. Marzia Bianchi Tel: ; STRUTTURA del CORSO: Il corso si articola in lezioni teoriche (con orario indicativo: martedì ore e venerdì ore 9-11) ed esercitazioni di laboratorio (calendario da definire) Obbligo di frequenza delle attività di laboratorio per almeno i 2/3 della loro durata TESTI DI STUDIO: M.L. Calabrò - COMPENDIO DI BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE, Ed. EdiSES, D.J.A. Crommelin, R.D. Sindelar - BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE, Ed. Zanichelli, D.J.A. Crommelin, R.D. Sindelar, B. Meibohm PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY, Ed. Informa Healthcare, Articoli di approfondimento forniti durante il corso dal docente.
2 PROGRAMMA del CORSO (1/2): Scopi generali delle biotecnologie farmaceutiche Farmaci ottenuti mediante produzione biotecnologica e loro mercato mondiale Farmaci biotecnologici vs farmaci tradizionali: nuovi approcci per lo sviluppo di un farmaco La tecnologia del DNA ricombinante nella produzione di farmaci biotecnologici (cenni) Strumenti e fasi del clonaggio molecolare di un gene (vettori di espressione procariotici ed eucariotici) Sistemi biologici per l espressione del gene clonato (batteri, lieviti, cellule animali) Produzione su ampia scala di proteine ricombinanti: la bioindustria nel settore farmaceutico. Fermentazione Biostrumentazioni e lavorazioni a valle (recupero del prodotto) Tecniche di analisi e purificazione di macromolecole biologiche: cromatografia ed elettroforesi Formulazione dei prodotti biotecnologici Aspetti di farmacocinetica e farmacodinamica dei farmaci proteici e peptidici Farmacocinetica dei farmaci proteici Adsorbimento, distribuzione ed eliminazione dei farmaci proteici Il legame delle proteine con i farmaci proteici Adattamenti interspecie Le modificazioni chimiche dei farmaci proteici L'immunogenicità Aspetti farmacodinamici dei farmaci proteici
3 PROGRAMMA del CORSO (2/2): Applicazioni delle biotecnologie innovative nello sviluppo di nuovi farmaci e prodotti farmaceutici biotecnologici commerciali (cont) Ormoni polipeptidici (insulina, ormone della crescita, ormoni follicolo-stimolante e luteinizzante). Citochine (interleuchine, interferoni, fattori di crescita emopoietici). Proteine del sangue (fattori della coagulazione VII, VIII e IX; tpa). Enzimi con proprietà terapeutiche (desossiribonucleasi, beta-glucocerebrosidasi, alfa-galattosidasi). Vaccini biotecnologici (vaccini vivi attenuati, vettori vaccinici, vaccini subunità, vaccini coniugati, vaccini peptidici, vaccini a DNA nudo). Anticorpi monoclonali Ingegneria degli anticorpi monoclonali: anticorpi murini, chimerici, umanizzati, umani. Applicazioni cliniche degli anticorpi: terapia anticancro, profilassi del rigetto, terapia delle malattie autoimmuni; sistemi di indirizzamento del farmaco basati su anticorpi monoclonali. Terapia genica Terapia genica ex vivo ed in vivo. Produzione di animali transgenici. Applicazioni della transgenesi animale in campo farmaceutico (animali transgenici produttori di biofarmaci, donatori di tessuti ed organi nello xenotrapianto, modelli di malattie umane nella ricerca biomedica). Oligonucleotidi (Triple helix-forming Oligonucleotides-TFO, Transcription factor decoy, antisenso/ribozimi, sirna/mirna, aptameri). Aspetti regolatori della fabbricazione, sperimentazione e approvazione dei biofarmaci Farmaci biosimilari. Approfondimento con Esercitazioni di laboratorio: Il phage display e le librerie fagiche di anticorpi ricombinanti Esperienze pratiche di laboratorio con gli anticorpi ricombinanti (OBBLIGO DI FREQUENZA).
4 BIOTECNOLOGIE BIOTECNOLOGIE: dalle competenze scientifiche e tecnologiche ai bioprodotti agroalimentare medicina energia e ambiente zootecnia ricerca teorica bioindustria chimica farmacologia biologia cellulare immunologia genetica chimica biologia molecolare fisiologia microbiologia
5 What is Biotechnology? La parola "biotecnologia" si riferisce alla tecnologia che utilizza organismi viventi (specialmente a livello genetico), sistemi o processi biologici per ottenere prodotti utili. Le applicazioni biotecnologiche sono numerosissime e possono essere classificate in: RED biotechnology (biotecnologia rossa), applicata ai processi per la cura della salute. WHITE biotechnology o GREY biotechnology (biotecnologia bianca o grigia), applicata ai processi di interesse industriale ed ambientale. GREEN biotechnology (biotecnologia verde), applicata ai processi agroalimentari. BIOINFORMATICA, settore interdisciplinare che utilizza un approccio informatico per risolvere problematiche di tipo biologico. BLUE biotechnology (biotecnologia blu), usata per descrivere applicazioni marine ed acquatiche delle biotecnologie.
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16 BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE Il contributo delle biotecnologie è da considerarsi significativo soprattutto nel settore della cura della salute, sia in termini di prodotti terapeutici e diagnostici che di ricerca e sviluppo (R&D). In particolare ci si riferisce a: vaccini medicinali contro disfunzioni metaboliche a base genetica trattamenti contro diverse forme di epatite antitumorali più efficaci e meno dannosi per l'organismo stimolatori e regolatori delle difese immunitarie = Farmaci biotecnologici (farmaci progettati e prodotti tramite le biotecnologie) di natura proteica (maggioranza dei casi) basati su acidi nucleici (terapia genica, RNA interference, ribozimi) basati sui carboidrati e altri prodotti della glicobiologia (in corso di studio)
17 Farmaco: è una sostanza o un'associazione di sostanze con proprietà curative o profilattiche delle malattie; può essere utilizzato o somministrato allo scopo di ripristinare, correggere o modificare funzioni fisiologiche, esercitando un'azione farmacologica, immunologica o metabolica, ovvero allo scopo di stabilire una diagnosi medica. Il concetto di farmaco si adegua alle esigenze della società e si modifica in relazione ai progressi tecnologici e scientifici FARMACI BIOTECNOLOGICI
18 Differenze tra farmaci tradizionali e farmaci biotecnologici (1/3) DIMENSIONE SINTESI PURIFICAZIONE IMMUNOGENICITA STABILITA DIMENSIONE Un prodotto farmaceutico tradizionale ha dimensioni relativamente piccole, con pesi molecolari tra i 50 e i Dalton. Un prodotto biofarmaceutico ha dimensioni significativamente superiori, nell ordine dei kda. Analizzabili con tecniche diverse. Farmaci chimici Farmaci biotecnologici Ac. Acetil salicilico Paracetamolo Simvastatina Interferone alfa Eritropoietina alfa Rituximab 180 Da 151 Da 419 Da Da Da Da Interferone Interferone
19 Differenze tra farmaci tradizionali e farmaci biotecnologici (2/3) SINTESI La sintesi di un prodotto farmaceutico tradizionale è dipendente dall esperienza e capacità dell operatore, ma è per definizione ripetibile in laboratori diversi. Infatti, le sintesi iniziano da substrati commercialmente disponibili o reperibili, e si basa su proprietà canoniche e descritte della chimica. Chemically synthesized Un prodotto biotecnologico, per definizione, dipende dai tool utilizzati. Poiché tali tool non sono commercialmente disponibili, e per definizione ceppi batterici, di lievito, o linee cellulari crescono clonalmente generando unicità nei diversi laboratori, due prodotti biotecnologici non risulteranno mai identici. Le modifiche post-traslazionali, i livelli di glicosilazione, la percentuale di proteine incomplete e la resa, solo per menzionare alcune importanti variabili, genereranno differenze tra due prodotti biofarmaceutici ottenuti in due stabilimenti diversi. Biologically synthesized PURIFICAZIONE La purificazione di un prodotto farmaceutico tradizionale si basa spesso su procedure standardizzate composte da pochi passaggi, poiché il prodotto finale è la componente principale della reazione. In un prodotto biotecnologico, il prodotto voluto deve essere purificato da una cellula procariotica o eucariotica. La metodiche di purificazione di tali farmaci dovranno sempre essere adattate ad una situazione e la resa qualitativa e quantitativa non sarà mai identica.
20 Differenze tra farmaci tradizionali e farmaci biotecnologici (3/3) STABILITA La stabilità dei prodotti farmaceutici tradizionali e dei biofarmaceutici è un altro aspetto da monitorare. La maggior parte dei principi attivi vanno incontro a degradazione con una cinetica di ordine I, e normalmente questo comportamento può essere modellato tramite l equazione di Arrhenius per diverse temperature e per tempi prolungati. La grandezza delle molecole biotecnologiche, la complessità della loro struttura terziaria e le modificazioni post-traslazionali, rendono improbabile l applicazione degli stessi principi anche ai biofarmaceutici. IMMUNOGENICITA Un prodotto farmaceutico tradizionale può interferire con il sistema immunitario, dando, ad esempio, fenomeni di ipersensibilità, allergici o di autoimmunità. Queste reazioni al principio attivo o agli eccipienti, ben note ai farmacologi, sono intrinseche al paziente, e quindi difficilmente sono attribuibili ad una produzione farmaceutica specifica. E ovvio che gli eccipienti dei prodotti biotecnologici si comporteranno in maniera identica. L immunogenicità dei farmaci biotech è legata alla loro natura (umana e non), stato di glicosilazione, contaminanti etc.
21 FARMACOLOGIA CLASSICA: sviluppo di un farmaco La farmacologia classica tradizionale si avvale dei seguenti step: Estrazione di sostanze da fonti naturali basata sulla diversa solubilità: miscele complesse Ulteriore frazionamento in miscele meno complesse (separazione basata sul peso molecolare e/o carica elettrica mediante varie tecniche, ad es. cromatografiche): primi saggi di attività Ottenimento delle singole sostanze: determinazione del peso molecolare (spettrometria di massa) e della struttura (NMR) Confronto con sostanze note Test di attività biologica mirati o random: in vitro - colture cellulari - ex vivo - in vivo IDENTIFICAZIONE DI UN PRINCIPIO ATTIVO Messa a punto della metodica estrattiva e purificativa su larga scala del principio attivo identificato In alternativa messa a punto di un metodo di sintesi e purificazione del principio attivo Applicabilità del principio attivo come farmaco: prove di tossicità e di immunogenicità Prove pre-cliniche su animali da laboratorio Trials clinici
22 APPROCCIO BIOTECNOLOGICO: sviluppo di un farmaco Acquisizione del maggior numero possibile di informazioni su una funzione biologica (interazione proteina-recettore; interazione proteina-dna; funzione di un ormone; attività di peptidi funzione di un gene) IDENTIFICAZIONE DI UN BERSAGLIO MOLECOLARE Clonaggio del gene, espressione della proteina, sintesi di un peptide o di un oligonucleotide Studi in vitro e su colture cellulari Studi in vivo di una singola funzione genica: animali transgenici; knock out e knock in; modelli animali meno evoluti ricerca da una ragionevole sicurezza sulla funzione della proteina, del peptide o del gene di interesse Produzione su scala pilota del principio attivo e verifica della attività del prodotto: in vitro - colture cellulari - ex vivo - in vivo Produzione del principio attivo secondo le norme GMP e sua applicabilità come farmaco: tossicità, DL50, immunogenicità Produzione su larga scala Prove pre-cliniche su animali da laboratorio Trials clinici
23 Le conoscenze scientifiche e le nuove tecnologie per la ricerca e lo sviluppo dei farmaci Robotica Biomarcatori Bersagli molecolari Nanotecnologia Bioinformatica Genomica, proteomica Fonte: PhRMA, Innovation, 2007
24 Evoluzione delle nuove tecnologie nella ricerca farmaceutica 1) Biotecnologie Utilizzazione integrata di discipline biologiche, della chimica e della ingegneria allo scopo di produrre beni e servizi mediante organismi viventi, cellule o loro costituenti. Esse possono essere applicate sia come mezzo di produzione sia come mezzo di ricerca: possono originare nuovi prodotti o produrre in modo competitivo prodotti già noti, oppure rendere possibile la produzione industriale di sostanze note ma non disponibili (ad es. proteine umane). Fermentazione Bioconversione Coltura di cellule animali Ingegneria genetica Anticorpi monoclonali Sonde nucleotidiche Reazione a catena della polimerasi
25 Evoluzione delle nuove tecnologie nella ricerca farmaceutica 2) Genomica Si occupa dell identificazione dei geni, del loro studio e dell interpretazione dei processi che sono da essi regolati. Obiettivi: la determinazione del genoma umano la caratterizzazione funzionale dei geni lo studio delle proteine codificate la terapia genica la realizzazione di farmaci/vaccini l introduzione di nuovi strumenti diagnostici (geni, sequenza nucleotidiche e proteine)
26 Target biologici dei farmaci (417 target esclusi i target anti infettivi, Goodman & Gilman, 2006) Recettori 52% Enzimi 22% Ormoni, fattori di crescita 13% Sconosciuti 7% Canali ionici 6% 1999: 500 target biologici 2009: target biologici Il giusto target per la giusta malattia
27 Evoluzione delle nuove tecnologie nella ricerca farmaceutica 3) Chimica combinatoriale e tecnologia ad essa complementare dell High Throughput Screening Tecnologie di robotizzazione ed informatizzazione che consentono la sintesi di un gran numero di molecole e la valutazione delle loro proprietà farmacologiche in tempi estremamente rapidi grazie alla possibilità di effettuare saggi biologici simultaneamente per numerosi candidati farmaci. Vecchio modello: Nuovo modello: un chimico una settimana una molecola un chimico una settimana un computer molecole
28 Impatto della combinatorial chemistry e high throughput screening (CC-HTS) Chimica Tradizionale CC-HTS Composti generati Tempo impiegato (mesi) 3 3 Costo (migliaia di $) Costo per composto ($)
29 Chimica tradizionale vs. combinatorial chemistry- HTS Identificazione recettore - target 5 mesi 40 mesi Chimica Tradizionale Sintesi del composto Combinatorial Chemistry - HTS 2 mesi 61 mesi vs. 23 mesi 3 mesi Tossicologia 13 mesi
30 Evoluzione delle nuove tecnologie nella ricerca farmaceutica 4) Rational drug design Individuazione di un farmaco a partire da un accurato studio del target biologico su cui esso agisce grazie al progresso di tecniche applicate per lo studio della struttura delle molecole biologiche. Scoperta del target Generazione del composto guida Ottimizzazione del composto guida Nuovo farmaco
31 La Ricerca farmaceutica: un processo lungo, complesso, costoso Il percorso per la nascita di un nuovo farmaco anni di studi e sperimentazioni Probabilità di successo 1 su 5-10 mila Screening di 10mila molecole Test su 100 molecole Costi per centinaia di milioni di euro Dossier articolati e particolareggiati (200 volumi della Grande Enciclopedia Treccani) Solo 3 farmaci su 10 ammortizzano i costi Ricerca di base Test pre clinici 10 molecole Sperimentazione Clinica 0 5 anni 10 anni Deposito del brevetto Valutazione Autorità Sanitarie 2/3 anni autorizzazione al commercio di 1 farmaco Farmacovigilanza Più del 90% della Ricerca è sostenuto dall industria farmaceutica
32 Farmaci biotech Rappresentano circa il 30% dei nuovi farmaci approvati e si prevede la conquista di un'altra grossa fetta di mercato ad opera dei farmaci biotech equivalenti, in quanto quelli cosiddetti di prima generazione hanno i brevetti in scadenza. Sono presenti sul mercato nell'ordine di quasi 200 prodotti mentre 300 sono nell'ultima fase di sperimentazione clinica. Più dell 80% delle indicazioni terapeutiche nei farmaci biotech sono per patologie con esigenze di cura altamente insoddisfatte (tumori, diabete, fertilità, etc) = POTENZIALE DI CRESCITA ALTISSIMO Minore tossicità Meccanismo d azione noto Azione più mirata e specifica Maggiore sicurezza Vantaggi dei farmaci biotech Per migliorare l efficacia dei farmaci e ridurre l incidenza degli effetti collaterali, la biotecnologia ricerca l origine molecolare delle malattie, avvalendosi delle conoscenze della biologia, della chimica e della tecnologia dei processi. Potenzialità di personalizzare le terapie (grazie al miglioramento delle tecnologie diagnostiche) Sviluppo dei farmaci biotech Occorrono in media anni prima che nuovi preparati siano immessi sul mercato poiché necessitano di una lunga serie di esami e dell'approvazione negli USA della FDA (Food and Drug Administration) e nell'ue dell'emea (European Medicines Agency). La probabilità per ogni nuova molecola in fase avanzata di studio preclinico di entrare in commercio è del 10%, per proteine terapeutiche è del 40%.
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35 Fonte: PhRMA, 2007
36 Le proteine terapeutiche oggi CITOCHINE E ANTAGONISTI ORMONI E PEPTIDI FATTORI DI COAGULAZIONE INIBITORI ANTICORPI VACCINI PROTEINE DI FUSIONE ENZIMI Oggi tra i principali medicinali biotech si possono annoverare alcuni farmaci antitumorali, quelli per la cura delle malattie autoimmuni come l artrite reumatoide, farmaci per il diabete e per i difetti della coagulazione
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