INFEZIONI DA RHODOCOCCUS EQUI NEL PULEDRO A LOCALIZZAZIONE EXTRAPOLMONARE: DESCRIZIONE DI TRE CASI CLINICI

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1 Ippologia, Anno 13, n. 1, Marzo INFEZIONI DA RHODOCOCCUS EQUI NEL PULEDRO A LOCALIZZAZIONE EXTRAPOLMONARE: DESCRIZIONE DI TRE CASI CLINICI EXTRAPULMONARY RHODOCOCCUS EQUI INFECTION IN THE FOAL: THREE CLINICAL CASES MARCO PEPE, RODOLFO GIALLETTI, FRANCO MORICONI, SARA NANNARONE, GIOVANNI VITELLOZZI* Dipartimento di Patologia, Diagnostica e Clinica Veterinaria, Università degli Studi di Perugia (I) * Dipartimento di Scienze Biopatologiche Veterinarie Università degli Studi di Perugia (I) Riassunto Il Rhodococcus equi è l agente patogeno di una delle malattie più frequentemente riscontrabili nel puledro di età compresa tra 1-6 mesi i cui segni clinici si evidenziano, nella maggior parte dei casi, prima dei 4 mesi di età. La localizzazione polmonare con i suoi risvolti clinici è quella meglio conosciuta, mentre le forme extrapolmonari con le loro differenti manifestazioni sono state meno approfondite. L articolo descrive tre casi di infezioni extrapolmonari nel puledro a localizzazione addominale, articolare e cutanea. Summary Rhodococcus equi is the pathological agent of one of the most common diseases encountered in foals between 1-6 months of age and in most cases the clinical signs are present before 4 months of age. The pulmonary form with its clinical manifestation is well studied whereas the extrapulmonary diseases are less investigated. The article describes three clinical cases of extrapulmonary disease in foals (abdominal, articular and cutaneous). INTRODUZIONE Il Rhodococcus equi è l agente patogeno di una delle malattie più frequentemente riscontrabili nel puledro di età compresa tra 1-6 mesi i cui segni clinici si evidenziano, nella maggior parte dei casi, prima dei 4 mesi di età. 8 L agente è un germe gram +, immobile, asporigeno, aerobio obbligato e pleomorfo, responsabile di lesioni polmonari suppurative e di enteriti ulcerative associate a linfoadeniti mesenteriche con formazioni ascessuali. Nella maggior parte dei casi, sebbene il microrganismo possa infettare tutti i giovani puledri, i segni clinici non sono sempre evidenti, a volte sono subdoli ed altre devastanti. Questo è probabilmente dovuto alle diverse condizioni ambientali (temperatura, polvere, terreno, ph, ecc.), alle differenti condizioni di management, oltre alla maggiore o minore virulenza del microrganismo ed allo stato immunitario del soggetto. Nel cavallo adulto, generalmente, anche se è presente l infezione, non sono manifesti i segni clinici della malattia: l intestino è un mezzo di trasporto passivo del germe con conseguente contaminazione del terreno mentre nel puledro il microrganismo a livello intestinale può INTRODUCTION Rhodococcus equi is the causative agent of one of the most common diseases of foals between 1-6 months of age. In most cases the clinical signs are present before the 4 th month of age. 8 The aetiological agent is a gram + germ, immobile, non sporigenous, pleomorphic aerobe, and obligate which causes suppurative pulmonary lesions and ulcerative enteritis associated with mesenteric lymphadenitis with abscess formation. The infection can occur in all young foals, before clinical signs are present. In other circumstances, a severe disease can develop. This is probably due to different environmental conditions (temperature, dust, earth, ph, etc), different management conditions, microorganism virulence and the host immune system. In the adult horse, infection is very often inhapparent or subclinical being the intestine a simple means of passive transport for the microbe and ground contamination. On the contrary in foal the microorganism can also replicate in the intestine. The most important route of infection is by inhalation of contaminated dust. The most common

2 4 Infezioni da rhodococcus equi nel puledro a localizzazione extrapolmonare anche moltiplicarsi. La più importante via di infezione è quella inalatoria per contaminazione della polvere. Le manifestazioni cliniche più frequenti sono rappresentate da broncopolmoniti piogranulomatose croniche con ascessi caseosi, associate a linfoadenite purulenta. Nelle forme sia a decorso acuto che cronico è presente diminuzione dell appetito, abbattimento, aumento della temperatura corporea (38,8-40 C fino a 41,5 C), tachipnea con notevole difficoltà respiratoria. Altre manifestazioni cliniche più rare, determinate dal Rhodococcus equi, possono essere rappresentate da entero-coliti ulcerative multifocali, tifliti piogranulomatose o infiammazione suppurativa del mesentere e delle colonie linfonodali, polisinoviti non settiche, artriti settiche, osteomieliti, linfangiti ulcerative, celluliti ed 3; 8;15;16 ascessi sottocutanei. CASO 1 Un puledro PSI, maschio, di 40 giorni di età, è stato presentato alla visita con un quadro da addome acuto. L anamnesi riferiva la presenza, da qualche ora, di dolori colici intensi anche in seguito a trattamento con flunixin meglumine (1 mg\kg IV), frequenza cardiaca di 80/bpm, che dopo la somministrazione di detomidina (30 µg/kg IV) per facilitare il trasporto, era scesa a 63/bpm. Al momento della visita il puledro presentava sudorazione diffusa, dolori intensi, frequenza cardiaca di 100/bpm, frequenza respiratoria 25/bpm, temperatura 38,8 C, mucose iperemiche con tempo di riempimento capillare superiore ai due secondi. La disidratazione era stimata intorno al 7% con 37,1% di ematocrito e 5,44 gr/dl di proteine totali. L addome si presentava aumentato di volume, e all auscultazione non vi erano rumori di peristalsi su alcun quadrante. L esame emocromocitometrico rivelava: leucocitosi (G.B con il 96% di granulociti neutrofili e il 4% di linfociti); G.R. 12 milioni, piastrine L ematochimico invece metteva in evidenza solo un incremento del CK (5540 U/L) e dell LDH (964U/L). Al passaggio della sonda rino-esofagea non vi era reflusso gastrico. Il liquido peritoneale, prelevato mediante abdominocentesi, si presentava di aspetto torbido e di colore giallo-arancio, con 4,37 gr/dl di proteine totali ed un incremento di cellule della serie bianca > con il 98% di neutrofili ed un aumento del CK 2260 U/L e dell LDH 759U/L. Visto che i dolori permanevano costanti anche in seguito a somministrazione di xilazina (0.5 mg/kg IV) e vi era un progressivo aumento del volume dell addome, la terapia chirurgica si riteneva obbligatoria. Con la laparotomia esplorativa è stato possibile evidenziare una porzione del piccolo intestino interessata da gravi disturbi di circolo per la torsione di un tratto del digiuno e dell ileo attorno ad una massa: un linfonodo meseraico di aspetto ascessuale (Foto 1, 2). Il segmento intestinale coinvolto si presentava iperemico, di colore rosso-violaceo, edematoso e friabile. Si è quindi reso necessario l intervento di enterectomia con asportazione di circa 5 metri di digiuno e dell ileo ed una anastomosi digiuno-ciecale. Sulla massa addominale, una volta asportata, sono stati eseguiti gli esami istologici e di laboratorio (Foto 3). Dopo lavaggio peritoneale con soluzione poliionica si è proceduto alla chiusura della breccia laparotoclinical manifestations of the infection in the foal are chronic suppurative broncopneumonia with extensive abscesses associated with purulent lymphoadenitis. In both the acute and chronic forms there is disorexia, depression, fever ( to 41.5 C) and labored tachypnea. Othe r, more rare, clinical manifestations of R h o d o c o c c u s e q u i infection are multifocal ulcerative entero-colitis, granulomatosus typhlitis, suppurative infection of the mesenteric lymph nodes, non septic polysynovitis, septic arthritis, osteomyelitis, ulcerative lymphangitis, cellulitis 3;8; 15;16 and subcutaneous abscesses. CASE 1 A 40 days old TB male foal, was presented with acute abdomen. At the presentation an abdominal pain has been present for some hours and it didn t stop after treatment with flunixin meglumine (1 mg/kg IV). The heart rate was 80 bpm and it slowed to 63 bpm after the administration of detomidine (30 µg/kg IV) given to facilitate transport. On phisical examination, the foal presented diffuse sweating, intense pain, heart rate 100 bpm, respiratory rate 25 per min, temperature 38.8 C, hyperemic mucous membranes and capillary filling time over 2 seconds. Dehydration was estimated around 7% with a PCV of 37.1% and 5.44 gm/dl total proteins. The abdomen was distended and no peristaltic sounds were detected during auscultation in any quadrant. Hematology re v e a l e d : leukocytosis (White Blood Cell WBC- 22 x 10 3 /µl with 96% neutrophils and 4% lymphocytes); Red Blood Cell RBC- 12 x 10 6 /µl and Platelets PLT- 406 x 10 3 /µl. Serum biochemical examination only revealed an increase in CK 5540 U/L and LDH 964 U/L. No gastric re f l u x was present The abdominocentesis collected peritoneal fluid was cloudy and yellow-orange in colour, with total protein at 4.37 gm/dl and an increase in WBC >60 x /µl with 98% neutrophils, increased CK 2660 U/L and LDH of 759 U/L. As the abdominal pain did not improve after administering xylazine (0.5 mg/kg IV) and t h e re was a gradual increase in abdominal distention, surgery was considered mandatory. Explorative laparotomy revealed a portion of torsed around part of the jejunum and ileum involving an abscessed mesenteric lymph node mass (photo 1,2). The intestinal segment was hyperemic, red-violet in color, edematous and fragile. Resection was necessary and 5 meters of jejunum and ileum w e re removed and a jejuno-caecal anastomosis was performed. Histological and laboratory exams were carried out on the excised abdominal mass (photo 3). After peritoneal lavage with polyionic solution, the laparotomy wound was closed in a routine manner. The surgery went on for 160 minutes, the foal re c o v e red from anaesthesia without any difficulty, but the abdominal pain re c u r re d shortly afterwards, due to a paralytic ileus characterized by an increase in abdominal volume, gastric reflux and absence of peristaltic sounds. After initial tre a t m e n t aimed at correcting endotoxemia and ileus, the foal was euthanized and a pathological examination was carried out. Apart from changes in the small intestine, necropsy revealed involvement of nearly all the mesenteric lymph

3 Ippologia, Anno 13, n. 1, Marzo mica secondo le metodiche consuete. L intervento ha avuto una durata complessiva di circa centosessanta minuti, il puledro si è risvegliato e rialzato senza difficoltà, ma i dolori addominali si sono ripresentati successivamente per l insorgenza di un ileo paralitico caratterizzato da depressione del sensorio, frequenza cardiaca elevata, progressivo aumento di volume dell addome, reflusso gastrico ed assenza di rumori peristaltici. Dopo un primo trattamento volto a correggere l endotossiemia e l ileo, il puledro è stato soppresso e sottoposto ad esame anatomo-patologico. Tale esame ha messo in evidenza, oltre alle alterazioni a carico del piccolo intestino, l interessamento di quasi tutti i linfonodi meseraici che si presentavano congesti, emorragici con, in alcuni, un nucleo caseoso centrale. Inoltre a carico del lobo basale del polmone destro è stato isolato un nodulo di 3-4 cm di diametro caratterizzato da necrosi caseosa con suppurazione centrale. Gli esami colturali della massa asportata durante l intervento e dei reperti anatomo-patologici, hanno permesso di emettere diagnosi di infezione da R h o d o c o c - cus equi. nodes which were congested, hemorrhagic, and in some cases, with a central caseosus nucleus. A 3-4 cm nodule, characterized by caseosus necrosis with central suppuration, was also isolated from the basal lobe of the right lung. Culture of the mass excised during surgery and the anatomical specimens of the lung identified a Rhodococcus equi infection. CASE 2 The second 4 months old thoroughbred foal, was admitted to the hospital due to a left fore hoof infection of 2 months duration. On presentation the foal had grade 4 lameness of the limb and a swollen, hot and painful hoof at the level of the coronary band and a sore in the pastern (photo 4). The hoof was smaller than the other front hoof. Blood tests revealed an increased WBC (16 x 10 3 /µl with 93% neutrophils). Arthrocentesis was unsuccessful. Radiological examination showed signs of second phalanx (P2) and pedal bone osteomyelitis with severe degenerative disease of the interphalangeal joints, more severe in the distal joint. The structure of P2 was completely altere d and there was a large central lytic area surrounded by a multifocal sclerosis together with reduced areas of density at the level of the pedal bone (photo 5). Considering the clinical and radiological findings, the poor prognosis and the future purpose for which the horse was intended, it was euthanized, and laboratory exams were carried out. No signs of lesions related to R. equi were found in respiratory and intestinal apparatus. Culture of osteoarticular samples enabled a diagnosis of extrapulmonary Rhodococcus disease. CASE 3 FOTO 1 - Torsione piccolo intestino. PHOTO 1 - Torsion of small intestine. The third, 5-month-old foal was presented because of recurring fever, associated with lack of appetite and cutaneous abscesses in both front limbs. Hot, painful, nodular FOTO 2 - Linfonodo mesenterico. PHOTO 2 - Mesenteric lymph node mass. FOTO 3 - Massa (linfonodo) mesenterico. PHOTO 3 - The excised abdominal mass.

4 6 Infezioni da rhodococcus equi nel puledro a localizzazione extrapolmonare CASO 2 Il secondo puledro, sempre PSI di circa 4 mesi di età, è stato riferito per un infezione della regione del piede anteriore sinistro presente da oltre due mesi. Al momento della visita il puledro presentava una zoppia di IV grado all arto interessato, il cui piede a livello di cercine coronario e di pastoia si presentava aumentato di volume, caldo, molto dolente con una piaga a livello di corona (foto 4) e con lo zoccolo più piccolo del controlaterale. Gli esami ematomorfologici hanno messo in evidenza una sola minima leucocitosi neutrofila ( G.B. con 93% neutrofili). Tramite artrocentesi dall articolazione interfalangea distale non è stato possibile prelevare il liquido sinoviale per i controlli di laboratorio. L esame radiografico ha invece permesso di evidenziare i segni di una osteomielite della seconda e della terza falange, con una gravissima malattia degenerativa articolare dell interfalangea distale e meno di quella prossimale. A carico della seconda falange, la cui struttura era completamente alterata, era presente una grossa zona litica centrale circondata da sclerosi, ed aree a ridotta densità erano presenti anche a livello di terza falange (foto 5). Visto il quadro clinico-radiografico, la prognosi e l attitudine a cui il cavallo era destinato è stato sottoposto ad eutanasia e sono stati effettuati gli esami colturali e di laboratorio. Nessuna lesione riferibile a R. equi è stata individuata a carico del sistema respiratorio e gastro-enterico. Solo grazie ai reperti anatomici osteoarticolari e dai loro esami colturali è stata emessa diagnosi di rodococcosi in sede extrapolmonare. lesions formed spontaneously opened abscesses (photo 6, 7). Starting at the level of the right axillary region, abaxial elbow and at the level of the dorsal radius near the radiocarpal joint with no involvement of articular structure s. The foal had been treated with a cyclic therapy of sodium cefalexine (8-10 days for three times) (10 mg/kg t.i.d. IM) which gave temporary reduction of the cutaneous symptoms, which recurred as soon as the therapy was reduced or suspended. On examination the foal, was in poor general condition with a temperature of 39.2 C and slightly d e p ressed and presented slight lameness of the left fore limb where 2 open abscesses were present. Blood tests revealed leuckocytosis with neutrophilia (WBC 19.6 x /µl, 91% neutrophils) and an increase in fibrinogen 550 mg/dl. Surgical debridment and culture of the lesions was carried out on the same day. Rhodococcus equi was isolated and a diagnosis of extrapulmonary infection was made, following negative clinical and radiological pulmonary investigations. The subject was treated with erythromycin (25 mg/kg orally t.i.d.) and rifampin (10 mg/kg orally b.i.d.), the latter also applied locally at the cutaneous lymph node abscesses responded rapidly and healed in about 30 days. DISCUSSION AND CONCLUSION Rhodococcus equi infection still represents one of the major causes of disease in foals from 1 to 6 months of age. 8 Scarce reports on this infection in Italy, at least until the beginning of the 1990 s, may be related to the breeders lack of attention to this insidious disease which can be clinically silent until a stress event brings it to the fore in a dramatic manner. The environmental conditions (intense heat, poorly ventilated stables, etc.) and manage- FOTO 4 - Lesione cutanea. PHOTO 4 - Sore lesion. FOTO 5 - Esame radiografico del piede. PHOTO 5 - Distal limb radiographic examination.

5 Ippologia, Anno 13, n. 1, Marzo CASO 3 Il terzo puledro, di 5 mesi, è stato osservato per la presenza di rialzi febbrili ciclici, associati a inappetenza e ascessi cutanei che avevano interessato ambedue gli arti anteriori. Si erano formate delle lesioni nodulari, calde dolenti, esitate in ascessi apertisi spontaneamente (foto 6, 7). Il tutto era iniziato a livello della regione ascellare destra, poi si erano formati a livello di parte esterna del gomito ed infine a livello di porzione dorsale del radio fino in prossimità della articolazione radiocarpica, senza però mai coinvolgere le strutture articolari. Il puledro era stato trattato con una terapia ciclica a base di cefalessina sodica (10 mg/kg t.i.d. IM) che, secondo il proprietario, aveva dato solo una riduzione transitoria della sintomatologia cutanea, la quale si riproponeva appena la terapia veniva ridotta o sospesa. Al momento della visita il puledro in scadenti condizioni generali, con 39.2 C di temperatura corporea e lievemente depresso rispetto agli altri puledri del gruppo, presentava una lieve zoppia all anteriore sinistro dove erano presenti due lesioni ascessuali aperte. Nella stessa giornata, oltre agli esami ematomorfologici ed ematochimici, che hanno evidenziato una leucocitosi neutrofila (GB , 91% neutrofili) ed un incremento del fibrinogeno (550 mg/dl), è stata effettuata anche la pulizia chirurgica delle lesioni. Sono stati eseguiti dei tamponi che hanno permesso di isolare, dopo qualche giorno, un germe riferibile a Rhodococcus equi, per il quale è stata emessa una diagnosi di infezione extrapolmonare confermata successivamente da un quadro clinico e radiografico polmonare ment of many breeding farms in our regions (of small to medium size, with few fields and with high percentage of horses per hectare, poor cleaning of the paddocks where contaminated feces remain on the ground and there is no irrigation, etc.) are very close to the ideal conditions for the survival and spread of the organism responsible for the disease 1. Passive transport of the casual agent in the intestine of adult horses, coming from the contaminated ground, transmits the disease to the foal, by means of inhalation or simple contact, and can cause extrapulmonary i n f e c t i o n. 1 0 The latter, indeed, for a series of factors not yet completely understood, manifests itself mainly at the pulmonary level but also in extrapulmonary re g i o n s which frequently are responsible for serious pathology, probably because they are not rapidly diagnosed and therefore not treated. Generally the most common clinical manifestation of infection, already widely described, is characterized by suppurative chronic broncopneumonia associated with pulmonary abscesses and sometimes with suppurative lymphoadenitis. 1 ; 8 ; 1 0 Clinical findings, often mild in the initial phases, are characterized by depression, anorexia, fever, tachypnea and modification of the auscultatory finding in the thorax. In addition, findings are not always directly related to the degree of pneumonia and it is only by stimulating the foal (by obstructing its nostrils) that it is possible to significantly modify the auscultatory results. The diagnosis of these forms, not very differe n t from other causes of pneumonia, in the foal, is confirmed together with the hematological exams and blood gas FOTO 6 - Ascesso cutaneo. PHOTO 6 - Cutaneous abscess. FOTO 7 - Ascesso cutaneo. PHOTO 7 - Cutaneous abscess.

6 8 Infezioni da rhodococcus equi nel puledro a localizzazione extrapolmonare negativo. Al soggetto è stata somministrata una terapia a base di eritromicina (25 mg/kg per OS t.i.d.) e rifampicina (10 mg/kg per OS b.i.d.), quest ultima anche localmente sugli ascessi, con rapida risposta che, nel giro di 30 giorni, ha determinato la risoluzione del processo linfoascessuale cutaneo. DISCUSSIONI E CONCLUSIONI Le infezioni da Rhodococcus equi nel puledro rappresentano ancora una delle maggiori cause di malattia nei soggetti di età compresa tra 1 e 6 mesi. 8 La loro scarsa descrizione in Italia, almeno sino agli inizi degli anni 90, è probabilmente legata alla minor sensibilità degli allevatori nei confronti di questa insidiosa patologia che talvolta, soprattutto nelle forme polmonari, può anche passare inosservata almeno sino alla comparsa di un episodio stressante che la fa esplodere in maniera eclatante. Infatti le condizioni climatiche (caldo intenso, box poco areati, ecc.) ed il management di molti allevamenti tipo, soprattutto nelle nostre zone (medio-piccoli, con pochi prati e con un elevato carico di animali per ettaro, scarsa pulizia dei paddock, privi di irrigazione e dove residuano le feci contaminate, ecc.), non si allontanerebbero molto da quelle che sono le condizioni ottimali per la sopravvivenza e la diffusione dei germi responsabili della malattia 1. Per questa infatti il trasporto passivo degli agenti eziologici nell intestino di cavalli adulti, provenienti da terreni contaminati, rappresenterebbe il veicolo attraverso il quale i puledri svilupperebbero la malattia, dopo l inalazione o addirittura, per alcune forme di infezione extrapolmonare,dopo il semplice contatto. 10 La malattia, per una serie di fenomeni non ancora completamente chiariti, si manifesterebbe prevalentemente a livello polmonare, ma anche, come visto, in sedi extrapolmonari che molto spesso sono responsabili di gravi patologie anche perché non velocemente diagnosticate né quindi trattate. In linea generale le manifestazioni cliniche più comuni della rodococcosi, come ormai ampiamente descritto, sono caratterizzate da una broncopolmonite cronica suppurativa associata ad ascessi polmonari e talvolta a linfoadeniti suppurative. 1 ; 8 ; 1 0 I segni clinici, spesso inconsistenti nelle fasi iniziali, sono caratterizzati da depressione, disoressia, febbre, tachipnea e modificazione dei parametri auscultatori del torace che possono variare dalla presenza di rantoli umidi sino alla riduzione della fonesi nelle aree dove sono presenti ascessi o epatizzazioni polmonari. Inoltre i reperti non sempre sono direttamente correlati al grado di polmonite e, soltanto stimolando i puledri (ostruendone le narici), è possibile modificare significativamente i reperti auscultatori. La diagnosi per queste forme, non molto dissimili da altre cause di polmonite del puledro, si avvale parallelamente all esame ematologico ed emogasanalitico (leucocitosi neutrofila e iperfibrinogenemia, riduzione degli scambi respiratori), di quello radiografico, di quello ecografico (presenza di un quadro alveolare caratterizzato da zone di maggior compattezza fino ad ascessualizzazioni vere e proprie) e di quello citologicocolturale di un aspirato transtracheale o tracheo-bronchiale. 1;8 Il germe è stato isolato a partire da campioni freschi, prelevati prima della terapia antibiotica, su comuni terreni di coltura addizionati a sangue di montone o siero equino, analyses (increase in WBC with neutrophilia, and hyperfibrinogenoemia, decreased gas exchange), the radiological exam, the ultrasound exam (presence of an alveolar picture characterized by regions of major consistency or the formation of true abscesses) and of the cytologic exam and c u l t u re of the transtracheal or tracheo-bronchial aspirate. 1;8 R. equi has been isolated from fresh specimens, taken prior to antimicrobial therapy, using common medium additioned with ram s blood or equine serum, at 37 C aerobically and identified within hours. The germ exhibits its characteristic salmon mucoid colonial appearance not before 48 hours of incubation. It is Gram-positive with a coccus-rod form. 1 8 However the examination of the tracheo-bronchial aspirate, even if it is considere d to be the most diagnostically indicative, must always be interpreted in the clinical context as it has been demonstrated in regions where the disease is enzootic, that approximately 35% of the tracheal aspirate of the examined foals can be positive in the absence of clinical signs of the d i s e a s e 1. Serological tests, Agar gel diffusion (AGID), Synergistic hemolysis inhibition (SHI) and Enzyme-linked immunosorbed assay (ELISA) can be added. 8 A foal exposed to the disease can produce immunoglobulins which can be revealed by the ELISA test, whereas when the infection is in progress, equi factor antibodies can be revealed with the SHI and AGID test. Such tests can be used especially in regions where the disease is endemic. In fact a decrease in the antibody titer revealed by ELISA at birth can indicate foals at risk of the disease, while a seroconversion with AGID at 8 and 12 weeks of age, can indicate candidates suitable for treatment due to early recognition of the disease. Diagnosis of pneumonia caused by Rhodococcus equi can be made more rapidly by use of a polymerase chain reaction (PCR) assay than by use of conventional bacteriologic culture techniques. 23 Use of a PCR assay aids in the d i f f e rentiation between virulent and avirulent strains of R. equi, and the assay may be used to identify R. equi in feces and soil of suspected breeding farms. Concerning the extrapulmonary localization it is not clear which infection route the bacterium will take, or why it brings about such serious and complex infections when it is so wide spread in nature. In about 50% of foals with pulmonary problems presented for postmortem examination, intestinal lesions characterized by a multifocal ulcerative enterocolitis, typhlitis and involvement of the mesenteric lymph nodes were present. Concerning intestinal forms, differential diagnosis should include acute diseases (salmonellosis, acute peritonitis) as well as, more rarely, a group of chronic diseases like parasitic infestion, granulomatous enteritis, chronic liver diseases. Inhalation of the bacterium could have been followed by a lymphohematogenic diffusion, in other case a direct gastro-enteric introduction could be hypothesized. However it is clear that the foal is susceptible to develop the disease, because of the natural decrease of humoral and cellular maternal immunity during the first 8 weeks. 1;22 Other studies have led to the discovery of proteins that could be related to the virulence represented by polysacaride capsule (able to inhibit the leuckocyte phagocytic function), by choles-

7 Ippologia, Anno 13, n. 1, Marzo in condizioni di aerobiosi a 37 C per ore. Il caratteristico aspetto mucoide e color salmone delle colonie si appalesa solo dopo 48 ore. Alla colorazione di Gram appaiono positivi di forma cocco-bastoncellare. 18 L esame batteriologico dell aspirato tracheo-bronchiale, tuttavia, anche se considerato diagnosticamente il più indicativo, deve essere sempre interpretato nel contesto clinico in quanto è stato dimostrato, in zone ove la malattia è enzootica, che circa il 35% degli aspirati tracheali dei puledri esaminati può essere positivo in assenza dei segni clinici di malattia. 1 A questi possono essere associati dei test sierologici quali Agar gel immunodiffusione (AGID); inibizione dell emolisi (SHI); test immunoenzimatici (ELI- SA). 8 Puledri esposti alla malattia possono produrre delle immunoglobuline di tipo G individuabili con il test di ELISA, mentre in corso di infezione possono essere individuati degli anticorpi nei confronti dell Equi factor solubile con i test di SHI e AGID. Tali test possono essere utilizzati soprattutto in zone ove la malattia è endemica. Infatti una riduzione del titolo anticorpale individuato con l ELI- SA alla nascita, può identificare i puledri a rischio di malattia, mentre un incremento di quelli individuati in sieroconversione con AGID a 8 e 12 settimane di età, può indicare i candidati ad un trattamento grazie al riconoscimento precoce di malattia. Un altro metodo rapido ed efficace, più che l uso delle convenzionali tecniche batteriologiche, molto importante nella diagnosi di questa infezione, è rappresentato dalla PCR (polymerase chain reaction). 23 Questa tecnica permette, oltre alla differenziazione tra le forme virulente e non del germe, anche l identificazione dello stesso dalle feci e dai terreni provenienti dagli allevamenti sospetti. Per le localizzazioni extrapolmonari rimangono ancora non completamente chiariti sia la via di infezione che il germe segue, sia il motivo per cui, pur essendo così diffusi in natura, le infezioni che determinano risultino così gravi e complesse. Circa il 50% dei puledri con problemi polmonari presentati all esame necroscopico mostrava lesioni intestinali caratterizzate da enterocoliti multifocali ulcerative, tifliti ed interessamento dei linfonodi meseraici. La diagnosi differenziale nelle forme intestinali deve essere rivolta verso una categoria di forme acute (salmonellosi, peritoniti acute) oppure più raramente verso una categoria di malattie croniche quali infestioni parassitarie, enterite granulomatosa, malattie epatiche croniche. Per quel che concerne il R. equi, in una buona percentuale dei soggetti la via d ingresso inalatoria potrebbe essere seguita da una diffusione per via linfoematogena, nei restanti casi potrebbe ipotizzarsi una diretta entrata attraverso il tratto gastroenterico. È comunque chiaro che il puledro presenta una suscettibilità elevata allo sviluppo della malattia, forse in virtù di una sua ancora ridotta risposta umorale e cellulomediata in un momento in cui l immunità materna si riduce naturalmente (8 settimane circa). 1 ; 2 2 Alcune ricerche hanno inoltre permesso di individuare delle proteine correlate alla maggior virulenza del germe rappresentate dalla capsula polisaccaride, in grado di inibire la funzione fagocitaria dei leucociti, dalla colesterolo-ossidasi, che aumenta la stabilità della membrana cellulare ed infine dall acido micolico della parete batterica che induce la formazione del granuloma. L insieme di queste proteine troverebbe nel puledro una maggior efficacia in corso di uno stato anterol-oxidase which increase the stability of the cellular membrane and finally by mycolic acid of the bacterial cell wall which induces the formation of the granuloma. All these proteins would be more efficient when the foal undergoes immunologic changes, even if only for a short per i o d. 1 Bone or joint localization would indicate bacterial transport from a pulmonary and/or intestinal form. Diff e rential diagnosis, in those cases, must consider poliarthritis/osteomyelitis, traumas, aseptic synovitis. However, as in the cases presented, foci in such sites are not always revealed and the foal did not come from a breedingfarm in which pulmonary infections had been observed, so the way of introduction of the disease is still unclear. In the first case it is sure that the metaphysis was initially involved (osteomyelitis type P) which later propagated through the metaphyseal cortex and the surrounding tissue into the joint cavity. When it is not possible to demonstrate this route, it is very likely that bacterial contamination of an open wound proximal to the osteocartilagineous segment involved was the cause. 17;21 The subcutaneous lesions should be always differentiated from ulcerative or aseptic limphangities, sporothrycosis, hystoplasmosis etc. The presence of such lesions indicates a direct means of introduction from outside into the subcutaneous tissue, if other internal lesions are not pre s e n t. However if the usual pulmonary or gastro-enteric foci are not present to justify a lympho-haematic diffusion of the process, the contamination with feces or other contaminated material of the open skin wounds should be considered the most probable. As regards treatment and prevention of the disease one should keep in mind that the aetiological agent is intracellular and so the drug should reach a good minimal inhibitory concentration (MIC) in the phagocyte. Different drugs have been used and the best therapy from the end of the 1980 s is still erythromycin in association with rifampine due to their liposolubility and the fact that they remain in high concentration in most tissues, but especially in the pulmonary parenchyma and its secretions. 8 Erythromycin ethylsuccinate can be admini s t e red at doses of 25 mg/kg orally t.i.d. or q.i.d. even though recent studies on healthy adult horses have demonstrated that the phosphate and stearate salts can be administered every 12 hours, maintaining their pharmacokinetic efficacy. 6 As erythromycin can lead to drug re s i s- tance even when considering the duration of the therapeutic cycles (6-8 weeks minimum), Rifampin is used in association to reduce this risk and also because it has optimal penetration capability in pulmonary tissue where it reaches a MIC at dosages of 10 mg/kg orally b.i.d. When faced with polymicrobic infections, it may be necessary to add another antibiotic to the two already stated, usually sulfa trimethoprim (unless cultures indicate differently). In skin infections rifampin applied topically gives a very high local MIC in comparison to parenteral treatment, to such an extent that a reduction in treatment times could be considered. The treatment period should not be less than 6-9 weeks and should only be stopped when, together with clinical improvement, the fibrinogen concentration has been normalized for at least one week. 8 As it has been proved that the bacteria are capable of remaining alive in feces and on the ground for quite a long time and in par-

8 10 Infezioni da rhodococcus equi nel puledro a localizzazione extrapolmonare che transitorio di immuno-alterazione. 1 La localizzazione ossea o articolare farebbe supporre una diffusione del germe da un focolaio polmonare e/o gastroenterico. La diagnosi differenziale, in tali casi, dovrebbe essere rivolta nei confronti di poliartrite/osteomielite, traumi, sinoviti non settiche. Comunque non sempre sono individuabili focolai in tali sedi, come verificatosi nel puledro da noi esaminato che peraltro proveniva da un allevamento in cui non si erano verificate infezioni polmonari. Ciò conferma la difficoltà ad individuare la via di ingresso. Nel caso delle infezioni ossee sembra accertato un interessamento primario della metafisi (osteomielite di tipo P) che successivamente, attraverso la cortex metafisaria e i tessuti circostanti, diffonderebbe il processo all interno della camera articolare. Quando non è possibile dimostrare questa via è verosimile ipotizzare una contaminazione da parte del germe di soluzioni di continuo della cute in prossimità del segmento osteocartilagineo interessato. 17;21 La presenza di sole lesioni sottocutanee, che andrebbero differenziate da linfangiti ulcerative asettiche, sporotricosi, istoplasmosi, ecc., ad andamento cronico ripetitivo in più parti del corpo, come sopra descritto, prevede, quando non associate ad altre sedi di lesioni interne, una via di ingresso diretta dal mondo esterno nel tessuto sottocutaneo. Tuttavia se non sono presenti i soliti focolai polmonari o gastro-enterici che giustifichino una diffusione linfo-ematica del processo, la contaminazione delle soluzioni di continuo cutanee con particelle di feci o altro materiale infetto deve essere considerata la più probabile. Per quello che interessa il trattamento e la prevenzione della malattia bisogna tener conto che l agente eziologico è un germe intracellulare per cui il farmaco deve raggiungere una concentrazione inibente minima (MIC) adeguata all interno del fagocita. Benché siano stati utilizzati diversi farmaci la terapia di scelta, dalla fine degli anni 80, rimane un associazione tra eritromicina e rifampicina, grazie alle loro caratteristiche di liposolubilità e di rimanere a concentrazioni elevate in molti tessuti, ma soprattuto nel parenchima polmonare e nelle sue secrezioni. 8 L eritromicina etilsuccinato può essere somministrata alla dose di 25 mg/kg per OS t.i.d. o q.i.d., anche se studi recenti su cavalli adulti e sani hanno dimostrato che i loro sali fosfati e stearati possono essere somministrati ogni 12 ore mantenendo la loro efficacia farmacocinetica. 6 Vi s t o che l eritromicina può dare origine a delle resistenze anche in virtù della lunghezza dei cicli terapeutici (6-8 settimane minimo), per ridurre questo rischio si associa della rifampicina che, inoltre, ha delle ottime capacità di penetrazione a livello di parenchima polmonare ove raggiunge una MIC alle dosi di 10 mg/kg b.i.d. per OS. Quando ci si trova di fronte a delle infezioni miste, polimicrobiche, è necessario associare un altro antibiotico ai due già utilizzati che di solito è rappresentato da sulfamidico-trimethoprim 15 mg/kg b.i.d. IV (almeno sino a quando l esame colturale non dia delle indicazioni diverse). Nelle infezioni cutanee la rifampicina ad uso topico permette di raggiungere delle MIC locali molto elevate rispetto alla via parenterale tanto da poter pensare anche ad una riduzione dei tempi di trattamento. La durata del trattamento non deve essere inferiore alle 6-9 settimane e comunque sarebbe meglio sospenderlo solo quando, anche in concomitanza ad un miglioramento clinico, la fibrinogenemia si sia normalizzata da almeno una settimana. 8 Infine, dimostrato ormai che ticular environmental conditions, different methods have been proposed to reduce the incidence and diffusion of the disease. This involves improving the breeding-farm conditions, such as temperature control, reduction of animals per pasture, encourage pasture rotation and irrigation. 9 Various methods of passive and active immunization of the foals with hyperimmune serum administered once or twice during the first weeks of life, or even vaccination of the foal and the pregnant mare, have been proposed. On farm with endemic infection, administration of hyperimmune plasma intravenously to foals in the first month of life may significantly reduce the incidence of R. equi p n e u m o n i a. 1 3 Harvested plasma was frozen for subsequent administration of one litre per foal between 1 and 30 days after birth. In the other hand vaccination of pregnant mares with bacterin did not provide passive protection in experimentally or naturally induced R. equi pneumonia in foals. 14 Making veterinary practitioners aware of the syndromes associated with the episodes of pneumonia in the foal could help in treating the affected subjects. Sometimes the signs of an extrapulmonary localization can proceed the respiratory form or even, as seen here, the latter may not even be present. It could also happen that an extrapulmonary form appears during the treatment of a respiratory form and even if the latter improves or heals, it can alter the course of the disease negatively. Finally one must not forget that any episode of the extrapulmonary form (abdominal form) can give aspecific symptoms which are not so easy to diagnose. 3 i batteri sono in grado di rimanere vitali nelle feci e sui terreni per molto tempo ed in particolari condizioni climatiche, sono state proposte diverse metodiche che tendono a ridurre l incidenza e la diffusione della malattia. Fondamentale è modificare al meglio le condizioni di allevamento legate alle elevate temperature, alla riduzione del carico dei pascoli, favorendo la rotazione e rendendoli irrigui. 9 Sono stati infine anche proposti dei metodi di immunizzazione passiva ed attiva dei puledri con siero iperimmune, da somministrare per una o due volte durante le prime settimane di vita o con vaccinazioni del puledro e della madre in gestazione. In zone endemiche la somministrazione per via endovenosa di plasma iperimmune nel primo mese di vita dei puledri, può ridurre drasticamente l incidenza della m a l a t t i a. 1 3 Invece la vaccinazione delle fattrici gravide sembra non essere in grado di dare una protezione passiva dalla malattia in puledri con forme polmonari da rodococco indotte sperimentalmente in casi di infezione naturale. 14 Sensibilizzare i veterinari pratici sulle sindromi associate agli episodi di polmonite nel puledro può aiutare nel trattamento dei soggetti affetti. Talvolta i segni di una localizzazione extrapolmonare possono precedere la forma respiratoria o addirittura, come visto, quest ultima può anche non presentarsi. Può anche verificarsi che una forma extrapolmonare può comparire durante il trattamento della forma respiratoria e, anche se quest ultima migliora o guarisce, può alterare il decorso del caso in senso negativo. In-

9 Ippologia, Anno 13, n. 1, Marzo fine, non va dimenticato che qualche episodio della forma extrapolmonare (forme addominali) può dare dei sintomi aspecifici che sono diagnosticamente non semplici da inquadrare. 3 RINGRAZIAMENTI Ringrazio vivamente Claudia Floridi per la sua cortese as - sistenza per la parte laboratoristica. Bibliografia/References 1. Ainsworth D.M. (1999) Rhodococcal infections in foals. Equine Ve t. Educ. 11, Chaffin M.K., Honnas C.M., Crabil M.R., Schneiter H.L., Gordon W.B., Briner P.R. (1995) Cauda equina syndrome, diskospondilitis, and a paravertebral abscess caused by Rhodococcus equi in a foal. JAVMA 206, Chaffin M.K., Martens R.J. (1997) Extrapulmonary disorders associated with Rhodococcus equi pneumonia in foals: retrospective study of 61 cases ( ). Proc. Am. Ass. Eq. Pract. 43, Davis J., Gaskin J.M., Hietela S.K., Ragland W.L. (1995) Oral administration of concentrated equine serum to newborn foal prevents failure of passive transfer of immunoglobulin and provides passive immunity for Rhodococcus equi. Proc. Am. Ass. Eq. Pract. 41, Dewes H.F. (1972) Strongiloides We s t e ry and Corynebacterium equi in foals. New Zel. Vet. J. 20: Dewes H.F. (1989) The association between weather, frenzied behav i o u r, percutaneous invasion by Strongiloides We s t e ry larvae and Corynebacterium equi disease in foals. New Zel. Vet. J. 37: Ewing P.J., Burrows G., MacAllister C., Clarke C. (1994) Comparision of oral erythromycin formulations in the horse using pharmacokinetic profiles. J. Vet. Pharmacol. Ther. 17: Ellemberg M.A., Genetzky R.M. (1986) Rhodococcus equi Infections: literature review. Compendium Contin. Educ. Vet. Practice. 8, Giguère S., Prescott J.F. (1997) Clinical manifestations, diagnosis, treatment and prevention of Rhodococcus equi infections in foal. Vet. Microbiology 56, Giguère S., Prescott J.F. (1997) Strategies for the control of Rhodococcus equi infections on enzootic farms. Proc. Am. Ass. Eq. Pract. 43, Hondulus M.K., (1997) Rhodococcus equi; pathogenesis and virulence. Proc. Am. Ass. Eq. Pract. 43, Hurley J.R., Beeg A.P. (1995) Failure of hyperimmune plasma to prevent pneumonia caused by Rhodococcus equi in foals. Aust. Vet. J. 72, Lakritz Y., Wilson W.D. (1997) Erythromycin: pharmacokinetics, bioav a i l a b i l i t y, nonantimicrobial activity, and possible mechanisms associated with adverse reactions. Proc. Am. Ass. Eq. Pract. 43, Madigan J.E., Hietala S., Muller N. (1991) Successful protection against naturally acquired Rhodococcus equi pneumonia in foals by administration of hyperimmune plasma. J. Reprod. Fert. Suppl. 44, Martens R.J, Martens J.G, Fiske R.A, (1991) Failure of passive immunization by colostrum from immunized mares to protect foals against Rhodococcus equi pneumonia. Equine Vet J. 12 Suppl: Olchowy T. W.J. (1994) Vertebral body osteomyelitis due to Rhodococcus equi in two Arabians foal. Equine Vet. J. 26, Nay T.S. (1996) Extra- pulmonary Rhodococcus equi in a Thoroughbred foal. Can. Vet. J. 37, Prescott J.F. (1987) Epidemiologic of Rhodococcus equi infection in horses. Vet. Microb. 14, Prescott J.F, Hoffman A.M., (1993) Rodococcus equi. Vet Clin North Am Eq. Pract Takai S. (1997) Epidemiology of Rhodococcus equi infections: a review. Vet. Microbiology 56, Takai S., Sasaky Y., Tsubaki S. (1995) Rhodococcus equi infection in foals current concept and implication for future research. Journal of Equine Sci. 6, Takai S., Fujimori T., Katsuzaki K., Tsubaki S., (1987) Ecology of Rhodococcus equi in horses and their environmental on horse-breeding farm. Vet. Microb. 14, Takai S., Ikeda T., Sasaki Y., Watanabe Y., Ozawa T., Tsubaki S., Sekizaki T., (1995) Identification of virulent Rhodococcus equi by amplification of gene coding for 15-to 17-kilodalton antigens. J. Clin. Micro. 33, Vivrette S.L, Sellon D.C, Gibbons D.S (2000) Clinical application of a polymerase chain reaction assay in the diagnosis of pneumonia caused by Rhodococcus equi in a horse. JAVMA 1;217(9): Wada R., Kamada T., Anzai T., Nakanishi A., Kanemaru T., Takai S., Tsubakin S. (1997) Pathogenicity and virulence of Rhodococcus equi in foals following intratracheal challenge. Vet. Microbiology 56, Wilkins P.A., Lesser F.R., Gaskin J.M. (1997) Rhodococcus equi Pneumonia in Foals: Comparison of ELISA and AGID Serology on a Comm e rcial Thoroughbred Breeding Farm Proc. Am. Ass. Eq. Pract. 43, 79-80

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