Parassitologia (modulo 5CFU)

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Faustina Cortese
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EPIDEMIOLOGICHE e PARASSITOLOGICHE e Laboratorio Parassitologia

1 Corso di Laurea Magistrale in Scienze Biologiche Indirizzo Diagnostica molecolare Anno Accademico 2018/19 METODOLOGIE EPIDEMIOLOGICHE e PARASSITOLOGICHE e Laboratorio Parassitologia (modulo 5CFU) Prof. Anna Scandurra 1 Università degli Studi di Napoli Federico II

2 2 La tecnica più usata per la diagnosi di infezione è l osservazione al microscopio di campione di sangue periferico, allestito come goccia spessa (su cui cercare la presenza/assenza) e come striscio (per stabilire la specie). Nell osservare i parassiti al microscopio è necessario ricordare che possono trovarsi in diverse forme: ad anello (nucleo periferico e grande vacuolo) nelle fasi precoci, compatta con vacuolo più ridotto e ameboide, tipica degli stadi avanzati di P. vivax, con citoplasma diviso in piccole masse. Gli schizonti si possono identificare grazie alla presenza di un numero minimo di almeno 3 nuclei durante la replicazione schizogonica. I gametociti sono riconoscibili dalla deformazione che provocano negli eritrociti e dalla presenza delle emozoine. Tranne che per P. falciparum in cui sono presenti solo i trofozoiti e i gametociti nel sangue periferico, nelle altre specie sono rilevabili tutti gli stadi del parassita. Genere Plasmodium

fissarli troppo tempo per poter osservare i granuli tipici.

3 3 Genere Plasmodium P. malariae schizonte P. vivax schizonte I vetrini preparati con lo striscio sottile devono essere fissati con metanolo, facendo attenzione a non fissarli troppo tempo per poter osservare i granuli tipici. Con la colorazione di Giemsa si osserva un colore rosa uniforme, mentre il parassita ha citoplasma azzurro e nucleo rosso. La conta percentuale dei parassiti sul totale di globuli rossi si può calcolare come Num. di eritrociti parassitati/num. di eritrociti x 100.

4 4 Genere Plasmodium I vetrini preparati con la goccia spessa non devono essere fissati con metanolo. In seguito alla colorazione di Giemsa, si possono osservare i globuli bianchi e i parassiti eventualmente presenti. Con questa procedura si ha una maggiore concentrazione del preparato. Per l osservazione si selezionano i campi microscopici che contengono circa 20 leucociti (ingrandimento 1000x). Il calcolo della parassitemia si ottiene contando i leucociti e i parassiti presenti. Se sono presenti 1000 leucociti o 500 parassiti circa, il numero di parassiti su µl è dato da: (Num. parassiti contati/ Num. leucociti contati) x (Num. leucociti/µl).

5 Leishmania 5 Per le forme di leishmaniosi viscerale si possono prelevare campioni dalla milza, dal midollo, dal fegato e dai linfonodi ingrossati tramite agoaspirazione di sangue (puntato splenico o midollare) con rischi più elevati per il paziente, oppure tramite biopsia epatica con meno rischi ma anche minore sensibilità. Nella forma cutanea si possono effettuare prelievi diretti come biopsie o raschiamento del derma, facendo particolare attenzione a pulire accuratamente la cute e ad eliminare zone necrotiche. Al microscopio la colorazione con ematossilina-eosina rende gli amastigoti visibili come puntini nei macrofagi (o affianco nel caso di macrofagi rotti), mentre con la colorazione di Giemsa il nucleo e il citoplasto risultano rossi e il citoplasma azzurro.

6 Trypanosoma brucei (Tripanosomosi africana malattia del sonno) L osservazione di questi parassiti può essere fatta tramite prelievo di sangue, durante l accesso febbrile nel primo periodo dell

6 6 Trypanosoma brucei (Tripanosomosi africana malattia del sonno) L osservazione di questi parassiti può essere fatta tramite prelievo di sangue, durante l accesso febbrile nel primo periodo dell infezione, oppure tramite aspirato linfonodale se sono presenti linfonodi ingrossati. Negli stadi avanzati l osservazione può essere fatta tramite puntura lombare e prelievo del liquido cefalorachidiano. Le tecniche utilizzabili per l osservazione possono essere lo striscio sottile con colorazione di Giemsa, la goccia spessa, anche se i tripanosomi sono piuttosto fragili, oppure la centrifugazione e l osservazione nel buffy coat dei parassiti.

7 7 Trypanosoma cruzi (Tripanosomosi americana morbo di Chagas) I tripomastigoti possono essere osservati con un prelievo di sangue, mentre gli amastigoti possono essere prelevati solo dopo la morte nei linfonodi o nei granulomi. Il campione di sanguepuò essere osservato a fresco con colorazione di Giemsa e senza l uso di anticoagulanti. L isolamento del parassita può avvenire tramite crescita in terreni di coltura o tramite inoculo in animali da laboratorio. Un altro modo per isolare il parassita è tramite xenodiagnosi, ossia facendo pungere il soggetto infetto da triatomime (vettori) allevate in laboratorio e indenni, e ricercando i parassiti nei loro escementi o nel loro intestino.

8 8 Immunodiagnosi Molti parassiti possono essere diagnosticati grazie alla sierodiagnosi, ossia tramite lo studio delle interazioni tra gli antigeni del parassita e gli anticorpi. I risultati che si ottengono con tali tecniche devono comunque essere integrati con altre tipologie di analisi. Questa tipologia di analisi è effettuata per le forme di tripanosomosi, di leishmania viscerale, di toxoplasmosi, di amebosi, di schistosomosi, echinococcosi e trichinellosi.

9 9 Immunodiagnosi Generalmente le tecniche utilizzate sono: ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) IFA (immunofluorescenza indiretta) DAT (agglutinazione diretta)

10 10 Parassiti enterici I parassiti che albergano l intestino possono essere diagnosticati tramite l analisi delle feci al fine di rilevare la presenza di cisti o trofozoiti di protozoi, larve o proglottidi delle tenie, uova, adulti di nematodi. Se la loro concentrazione è alta nell ospite, si possono usare tecniche di osservazione diretta al microscopio. Se invece la concentrazione è bassa, si può ricorrere alla preparazione di colture cellulari specifiche oppure a tecniche di concentrazione. Le colorazioni con cui possono essere trattati i campioni possono variare a seconda delle caratteristiche del parassita. Per una corretta diagnosi è molto importante saper misurare le dimensioni dei parassiti osservati che hanno importanza diagnostica e terapeutica. L osservazione delle dimensioni può essere effettuata mediante un oculare micrometrico adeguatamente tarato.

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