PIANI DI SICUREZZA DELLE ACQ Nuove metodologie di analisi ed inquinanti emerg. Bologna 12 ottobre 2 Acea Elabori S

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1 PIANI DI SICUREZZA DELLE ACQ Nuove metodologie di analisi ed inquinanti emerg Bologna 12 ottobre 2 Acea Elabori S

2 CONTROLLI BATTERIOLOG

3 mici e Nemici Batteri elminti Virus microrganismi alghe Protozoi

4 ecniche Microbiologiche Coltura su terreni solidi/liquidi: batteri Tecnica MF: Enterococchi Stafilococchi Pseudomonas aeruginosa Clostridium perfringens Coltura su monostrato cellulare: Enterovirus Concentrazione su campo Ultrafiltrazione tangenziale in laboratorio Tecnica MPN: Escherichia coli Coliformi a 37 Semina su coltura cellulare (cellule BGM) Tecnica Inclusione: Conteggio colonie a 36 C e 22 C

5 ecniche Microbiologiche Immunofluorescenza: protozoi Giardia Esame microscopico Alghe Real-time PCR Legionella Criptosporidium Elminti Tecniche molteplici che hanno come unico scopo rilevare ed identificare microrganismi che differiscono per mezzi di crescita ed habitat.

6 arametri Microbiologici Indici di inquinamento fecale e patogeni enterici Altri parametri microbiologici Potabilizzazione dell acqua (controlli igienico-sanitari) Studio delle caratteristiche dell acquifero I parametri da analizzare debbono essere scelti in rapporto alle finalità da perseguire

7 etodi Rapidi Molte delle tecniche microbiologiche oggi in uso non sempre rispondono alle esigenze dei gestori nel coniugare rapidità e certezza del risultato per poter intervenire in caso di anomalie sull acquedotto, nel più breve tempo possibile. Esistono tuttavia da qualche anno metodi rapidi, i più utilizzati usano le tecniche riportate: Bioluminescenza Citometria a flusso Amplificazione degli acidi nucleici Tecnologia ottica Colorimetria Rilevazione diretta della fluorescenza Identificazione genotipica e fenotipica Prenderemo ora in considerazione una delle tecniche usate nel nostro laboratorio per la ricerca di Legionella.

8 eal - time PRC Real time PCR : identificazione e quantificazione di specie batteriche patogene (Legionella, Salmonella, ) mediante la duplicazione del DNA in tempo reale Unità di Misura: Unità Genomiche/L Criticità: non esiste ad oggi alcuna legislazione che riporti i limiti di accettabilità in UG/L o che metta in rapporto le UFC con le UG per i campioni ambientali.

9 egionella e Real Time PCR «...Quanto riportato ha lo scopo di suggerire una buona pratica di laboratorio per l attuazione della Real-Tme PCR, poiché al momento non esiste una procedura standard e la metodica rimane ancora oggi non validata per scopi diagnostici..la Real-Time PCR può essere utilizzata per una rapida analisi di routine, ma soprattutto in campioni ambientali correlati a focolai epidemici, per i quali è ancor più necessaria la tempestività delle indagini, al fine di attuare le opportune misure di controllo per il contenimento dei casi di malattia. «I campioni analizzati mediante Real-time PCR che hanno dato esito negativo possono non essere analizzati mediante coltura. In questo caso il risultato verrà espresso come «DNA di Legionella non rilevato mediante Real-Time PCR». Al contrario, se i campioni sono positivi per Real Time PCR devono essere analizzati mediante coltura.» Linee guida per la prevenzione e controllo della legionellosi (07/05/2015) all.6.

10 sperienza del Laboratorio

11 egionella e Real Time PCR Analizzati 270 campioni per legionella nell arco di 6 mesi con Real-Time PCR e metodo colturale PCR Real-time (qualitativa) L.pneumophila Metodo colturale (Unichim 1034) PCR Real-time (qualitativa) L.spp Metodo colturale (Unichim 1034) Campioni positivi Campioni dubbi Campioni negativi

12 egionella e Real Time PCR in conclusione sono stati confermati dall analisi colturale: Campioni risultati positivi con il metodo ufficiale rispetto alla Real-Time PCR Campioni risultati negativi con il metodo ufficiale rispetto alla Real-Time PCR L.pneumophila 34% 100% L.spp. 7% 100% Ciò conferma quanto riportato nelle Linee guida 2015, cioè che il metodo della Real-time PCR è un ottimo metodo rapido di screening per i campioni negativi, mentre i campioni positivi ad oggi debbono essere confermati dall esame colturale.

13 TEST DI TOSSICI

14 nalsi della Tossicità con Vibro fischeri (Microtox) Bioluminescenza: emissione di luce associata a reazioni chimiche, in Vibrio fischeri associata al sistema substrato-enzima luciferina luciferasi; Tossicità acuta: tossicità a breve termine di uno o più composti stimata, per Vibriofischeri, dopo un tempo di esposizione massimo di 30 minuti; EC50: concentrazione di effetto che produce l abbattimento del 50% della luce emessa dai batteri; % di abbattimento: differenza percentuale (della luce emessa) tra il controllo ed il campione.

15 nalsi della Tossicità con Vibro fischeri (Microtox) Microtox: rileva la tossicità chimica di un acqua potabile usando batteri bioluminescenti (Vibrio Fischeri) Il test dà il risultato di tossicità chimica di un acqua potabile in minuti Caratteristiche: veloce ma aspecifico (non indica la sostanza responsabile dell inquinamento chimico)

16 nalsi della Tossicità con Vibro fischeri (Microtox) Risultati in 90 min Emergenza idrica Rapidità di intervento Analisi di tossicità correla ad analisi chimica

17 Protocollo per il Monitoraggio della Tossicità (approccio di sceening per eventi di contaminazione chimica) Campioni acqua destinata al consumo umano Fase I tossicità (30 min) TEST TOSSICITA >10% Microtox Screening campione in doppio TEST TOSSICITA <10% Fase II indagini suppletive 60 min Non tossico SPME-GC/MS LC/MS/MS diretta ICP/MS semiquantitativa Test in cuvetta Microtox (completo)

18 aphnia Toximeter ENTRATA SISTEMA SOLUZIONE SALINA PER LA SOSPENSIONE ALGALE L INDICATORE LA SOSPENSIONE ALGALE USCITA SISTEMA

19 istema Integrato di Biomonitoraggio con Daphnia Sistema integrato di biomonitoraggio on line sulla rete acquedottistica Un sistema complesso ed evoluto, collocabile in punti nevralgici del sistema di distribuzione, consente di rilevare la Tossicità totale attraverso un indicatore biologico, un crostaceo cladocero: Daphnia Magna. Il vantaggio degli indicatori biologici è quello di poter dare una risposta sebbene aspecifica, alla presenza di una molecola o di più molecole presenti nel campione. Ogni piccolo crostaceo viene sottoposto ad uno studio comportamentale e i parametri comportamentali si traducono con un valore definito come Indice di Tossicità Totale.

20 arametri Comportamentali

21 ndice di Tossicità Totale Il sistema si avvale di un software integrato, raccoglie tutte le (10) informazioni comportamentali di ogni singolo organismo test ed elabora in tempo reale i dati registrati e definisce l Indice di Tossicità Totale. Dal grafico si può osservare l andamento dell Indice di Tossicità Totale

22 Bologna 12 ottobre 2 Acea Elabori S PIANI DI SICUREZZA DELLE ACQ Nuove metodologie di analisi ed inquinanti emerg GRAZIE..