Legionella IFA (In Italiano) IFA Legionella

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1 (In Italiano) IFA Legionella REF IF0950 Rev. L Test di Immunofluorescenza Indiretta (IFA) per la Ricerca nel Siero Umano di Anticorpi contro Legionella pneumophila Per uso diagnostico in vitro APPLICAZIONI L IFA Legionella di Focus Diagnostics viene usato per l individuazione qualitativa e semi-quantitativa nel siero umano di anticorpi contro Legionella pneumophila. SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST Le Legionelle sono bacilli gram negativi che non formano spore. Il genere Legionella include almeno 39 specie e 61 sierogruppi genus 1. Legionella pneumophila causa più del 90% dei casi della malattia del Legionario 1. La Legionella causa una malattia ad ampio spettro clinico, che va dall infezione asintomatica alla polmonite con progressione rapida. La Legionellosi è una condizione clinica da denunciare all autorità sanitaria (CDC) ed è associata a due malattie distinte clinicamente ed epidemiologicamente: la malattia del Legionario, caratterizzata da febbre, mialgia, tosse, polmonite, e la febbre di Pontiac, una malattia più lieve senza la polmonite 2. La malattia del Legionario non può essere distinta clinicamente o radiograficamente da una polmonite causata da altri agenti, e la dimostrazione di un infezione da altri patogeni respiratori non esclude la possibilità di una concomitante infezione da Legionella spp. Approssimativamente dal 5% al 30% dei casi di malattia del Legionario sono fatali 1. Si ipotizza che l inalazione di aerosol d acqua contaminata da Legionella spp. sia la via primaria d infezione. Non si è osservata trasmissione interpersonale 3. Il rischio per una persona di contrarre la legionellosi in seguito all esposizione dipende da un numero di fattori, inclusi il tipo e l intensità dell esposizione e lo stato di salute della persona esposta 3. L immunosoppressione, l età avanzata, una malattia renale in fase terminale, il cancro e la contrazione della malattia in nosocomio sono tutti fattori indipendentemente associati con un esito fatale 3. Il periodo d incubazione della malattia del Legionario va generalmente da 2 a 10 giorni 3. Per gli scopi epidemiologici dei Centri per il Controllo delle Malattie (Centers for Disease Control, CDC) negli USA, una legionellosi confermata in laboratorio e rilevata in un paziente che ha passato almeno 10 giorni di seguito in ospedale prima dell inizio della malattia è considerata una malattia del Legionario di sicura origine nosocomiale, e un infezione confermata in laboratorio che si rileva da 2 a 9 giorni dopo l ospedalizzazione è di possibile origine nosocomiale 3. La prevenzione delle infezioni nosocomiali da Legionella include l educazione del personale ospedaliero, la sorveglianza e altre misure 3. Se c è l evidenza di una trasmissione continua, allora si autorizzano un investigazione ambientale per determinare la(e) fonte(i) della Legionella e altre misure di controllo dell infezione 3. Secondo il CDC, i casi possono essere confermati usando i criteri seguenti: Conferma in Laboratorio (CDC) 2 1. Isolare la Legionella da secrezioni respiratorie, tessuto polmonare, fluidi pleurici o altri fluidi normalmente sterili, o 2. Rilevare un aumento 4 volte del titolo dell anticorpo con un test IFA fino ad un rapporto di almeno 1:128 contro il sierogruppo 1 di Legionella pneumophila tra campioni appaiati di siero in fase acuta e convalescente, o 3. Rilevare il sierogruppo 1 di L. pneumophila in secrezioni respiratorie, tessuto polmonare o fluidi pleurici testando l anticorpo con fluorescenza diretta, o 4. Dimostrare la presenza del sierogruppo 1 di L. pneumophila nell urina mediante saggio radioimmunologico o saggio con immunoassorbente legato all enzima (ELISA). Secondo il Gruppo di Lavoro Europeo per le Infezioni da Legionella, i casi possono essere confermati o presunti usando i criteri seguenti: Confermato Microbiologicamente (Gruppo di Lavoro Europeo) 4 1. Isolare la Legionella da secrezioni respiratorie, tessuto polmonare o sangue. 2. Rilevare un aumento 4 volte del titolo dell anticorpo contro il sierogruppo 1 di L. pneumophila con test IFA o microagglutinazione. 3. Rilevare l antigene specifico per Legionella nell urina usando reagenti validati. Presunti Microbiologicamente (Gruppo di Lavoro Europeo) 4 1. Rilevare un aumento 4 volte del titolo dell anticorpo contro L. pneumophila o altri sierogruppi o altre specie di Legionella con test IFA o microagglutinazione. 2. Rilevare un singolo titolo alto dell anticorpo del siero specifico per il sierogruppo 1 di L. pneumophila sierogruppo 1 o altri sierogruppi o altre specie di Legionella. 3. Rilevare l antigene specifico di Legionella in secrezioni respiratorie o con marcatura diretta con anticorpo fluorescente (DAF) dell organismo in secrezioni respiratorie o tessuto polmonare usando reagenti monoclonali valutati. 4. Rilevare il DNA di specie di Legionella con la reazione a catena della polimerasi (PCR). Un singolo titolo elevato dell anticorpo non conferma un caso di malattia del Legionario perché titoli IFA 1:256 vengono trovati in percentuali da 1 a 16% degli adulti sani 3. Gli anticorpi IgA, IgG e IgM vengono prodotti contro gli antigeni di Legionella 5. Complessivamente, solo l 80% delle persone positive in coltura sviluppano un aumento significativo del titolo 5. Di quell 80%, un aumento significativo del titolo può avvenire in 9 settimane 5. L anticorpo IgM può essere rilevabile per mesi 5. Il test IFA Legionella di Focus Diagnostics utilizza vetrini con dodici pozzetti; e ogni pozzetto ha due spot individuali. Uno spot contiene il sierogruppo 1 di L. pneumophila, e l altro contiene un pool dei sierogruppi 2, 3, 4, 5, 6 e 8 di L. pneumophila. L. pneumophila è fissata con formalina.

2 Pagina 2 PRINCIPIO DEL TEST Il test IFA Legionella è una procedura a "sandwich" in due fasi. Nella prima fase, il siero del paziente è diluito in PBS, aggiunto ai pozzetti del vetrino in contatto con l antigene e incubato. Dopo l incubazione, il vetrino è lavato in soluzione salina tamponata, che rimuove gli anticorpi non legati. Nella seconda fase, ogni pozzetto con l antigene viene incubato con un anticorpo marcato con fluoresceina e specifico per le immunoglobuline umane (IgG, IgM, IgA). Il vetrino è incubato per permettere ai complessi antigene-anticorpo di reagire con l anti-ig marcato con la fluoresceina. Dopo che il vetrino è stato lavato, essiccato e montato, viene esaminato mediante microscopia a fluorescenza. Le reazioni positive appaiono come dei bastoncini fluorescenti color verde mela. Una valutazione semiquantitativa dei titoli limite é ottenuta testando diluizioni seriali di campioni positivi. MATERIALI FORNITI Il kit test di Focus Diagnostics contiene materiali sufficienti per effettuare 120 determinazioni. Vetrini Substrato REF IF0951 Ag Dieci vetrini di dodici pozzetti ognuno. Ogni pozzetto ha due spot: uno spot contiene il sierogruppo 1 di L. pneumophila, e l altro contiene un pool dei sierogruppi 2,3,4,5,6 e 8 di L. pneumophila. Conservare le confezioni di vetrini sigillate tra i 2 e gli 8 C. I vetrini sigillati sono stabili fino alla data scritta sulle etichette della confezione. Per evitare la condensa, portare i vetrini a temperatura ambiente prima di aprire le confezioni sigillate. Nota: la maggior parte dei microscopi a fluorescenza inverte l immagine del vetrino. Visti al microscopio gli antigeni appariranno in ordine inverso, come mostrato qui sotto. Coniugato Polivalente, 3,5 ml REF IF0010 CONJ POLY Una fialetta di anticorpo, prodotto in capra, anti immunoglobulina (IgG, IgM, IgA) umana marcato con fluoresceina. Contiene controcolorazione Blu di Evans, stabilizzatore di proteine e conservanti. Pronto per l uso. Stabile tra 2 e 8 C fino alla data indicata sull etichetta. Non usare se torbidezza, decolorazione o altre indicazioni di contaminazione batterica sono presenti. Portare a temperatura ambiente prima dell uso. Controllo Rilevabile, 0,3 ml REF IF0914 CONTROL > Una fialetta di siero umano confezionato alla diluizione per lo screening. Contiene conservanti. Stabile tra 2 e 8 C fino alla data di scadenza scritta sull etichetta. Non usare se torbidezza, decolorazione o altre indicazioni di contaminazione batterica sono presenti. Portare a temperatura ambiente prima dell uso. Non pretrattare o diluire. Controllo Non Rilevabile, 0,25 ml REF IF0913 CONTROL < Una fialetta di siero umano confezionato alla diluizione per lo screening. Contiene conservanti. Stabile tra 2 e 8 C fino alla data di scadenza scritta sull etichetta. Non usare se torbidezza, decolorazione o altre indicazioni di contaminazione batterica sono presenti. Lasciar riscaldare a temperatura ambiente prima dell uso. Non pretrattare o diluire. Mezzo di Montaggio, 2,5 ml REF IF0007 REAG MONT Una bottiglia contagocce contenente glicerolo tamponato con PBS ph 7,2 ± 0,1. Contiene conservanti. Stabile tra 2 e 8 C fino alla data di scadenza scritta sull etichetta. Portare a temperatura ambiente prima dell uso. PBS REF IF0005 BUF Una fiala di polvere di soluzione salina in tampone fosfato (PBS). Ricostituire con 1 litro di acqua distillata (o purificata). La soluzione ricostituita è un tampone 0,01 M con ph 7,2 ± 0,1. Prima e dopo la ricostituzione, conservare il PBS tra 2 e 8 C. Portare a temperatura ambiente prima dell uso. Non usare se torbidezza, decolorazione o altre indicazioni di contaminazione batterica sono presenti. MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI 1. Vetrini coprioggetto 24 X 50 mm 2. Tubi per il test e portaprovette, tubi per microcentrifuga o piastra per microtitolazione per le diluizioni del siero 3. Centrifuga clinica 4. Incubatore o bagnomaria da 35 a 37 C per l incubazione del vetrino 5. Frigorifero con temperatura da 2 a 8 C 6. Bottiglia di plastica per lavaggio 7 Pipette calibrate o pipettatrici con pistone con punte monouso 8. Vaschetta Coplin o vassoio per la colorazione dei vetrini con portavetrini 9. Beuta volumetrica o cilindro graduato puliti, 1 litro 10. Camera umida per l incubazione dei vetrini 11. Acqua distillata o purificata 12. Timer 13. Carta assorbente per asciugare i vetrini 14. Microscopio a fluorescenza, parametri raccomandati Filtro di Eccitazione nm Filtro di sbarramento nm Fonte di Luce HBO 100W, mercurio Obiettivo 20-40X, qualità per fluorescenza, a secco AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Tutti i prodotti derivati dal sangue si devono trattare come potenzialmente pericolosi. La fonte dei materiali dalla quale questo prodotto (incluso il controllo non rilevabile) è stato ottenuto è stata testata per l antigene di superficie dell Epatite B, l anticorpo per l Epatite C e l anticorpo HIV-1/2 (AIDS) con

3 Pagina 3 metodi approvati dalla FDA ed è stata trovata negativa. Tuttavia, siccome nessun test può offrire l assicurazione al 100% che i prodotti derivati dal sangue umano non trasmettono questi o altri agenti infettivi, tutti i controlli, i campioni di siero e la strumentazione che entra in contatto con questi campioni deve essere considerata come potenzialmente infettiva e predisposta per l utilizzo di adeguate precauzioni per pericolo biologico. Il CDC e gli istituti nazionali di salute suggeriscono che gli agenti potenzialmente contagiosi sono maneggiati al Livello 2 di Biosafety. 11,12 2. Il Blu di Evans è cancerogeno. Evitare il contatto con pelle e occhi. 3. Non rimpiazzare reagenti con lotti di differenti kit o fabbricanti. 4. Usare solo i protocolli descritti in questo inserto. 5. La contaminazione incrociata dei campioni del paziente può causare risultati erronei. Aggiungere i campioni del paziente e manipolare il vetrino con cura per evitare di mescolare i sieri dei pozzetti adiacenti. 6. La contaminazione batterica dei campioni di siero o dei reagenti può produrre risultati erronei. Usare tecniche asettiche per evitare la contaminazione batterica. 7. Mezzo di Montaggio contiene una percentuale di glicerolo compresa tra 30 e 60% che può causare irritazione in caso di inalazione o di contatto con la pelle. In caso di inalazione o di contatto, prendere le misure di primo soccorso. PERIODO DI VALIDITÀ E MANIPOLAZIONE 1. I kit sono stabili fino alla fine del mese indicato sulla data di scadenza se conservati alla temperatura di 2-8 C. 2. Non utilizzare il kit o i reagenti del test dopo le date di scadenza. 3. Non esporre i reagenti ad una forte sorgente luminosa durante la conservazione o l'incubazione. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Il siero è il tipo di campione preferito. Non è stato fatto alcun tentativo per stabilire la compatibilità di questo saggio con altri tipi di campione. Risultati erronei possono derivare dall'uso di sieri iperlipemici, emolizzati o contaminati; pertanto il loro uso deve essere evitato. Raccolta e manipolazione del campione Raccogliere i campioni di sangue asetticamente utilizzando tecniche autorizzate di prelievo venoso da parte di personale qualificato 6. Lasciare coagulare i campioni di sangue a temperatura ambiente prima della centrifugazione. Asetticamente, trasferire il siero in un contenitore sterile a chiusura ermetica per la conservazione tra 2 e 8 C. Se il saggio viene effettuato dopo più di 5 giorni, congelare il campione ad almeno 20 C. Prima dell'uso scongelare e miscelare con cura i campioni. Preparazione del Campione La diluizione del siero per lo screening è di 1:16 in PBS. Per determinare i titoli limite, usare il PBS per diluire serialmente oltre la diluizione per lo screening. PROCEDURA DEL TEST 1. Rimuovere i vetrini dal frigorifero. Per evitare la condensa, consentire ai vetrini di raggiungere la temperatura ambiente prima di aprire i pacchetti. 2. Depositare 25µL del Controllo Rilevabile, prelevandolo direttamente dalla boccetta, in un pozzetto del vetrino. Non diluire. 3. Depositare 25µL del Controllo Non Rilevabile, prelevandolo direttamente dalla boccetta, in un pozzetto del vetrino. Non diluire. 4. Per ogni siero di paziente da analizzare, aggiungere in un pozzetto del vetrino circa 25µL di campione diluito (vedi sopra: Preparazione del campione). Usare un sistema di notazioni per identificare i vari pozzetti al momento di leggere i risultati. 5. Incubare il(i) vetrino(i) in camera umida per 45 ± 2 minuti a C. 6. Rimuovere i vetrini dalla camera umida e sciacquarli delicatamente, facendo scorrere del PBS su un vetrino alla volta. Non versare il PBS direttamente sui pozzetti. Sciacquare una fila alla volta per evitare il mescolamento dei campioni. Lavare poi i vetrini immergendoli per 20 minuti in vaschette di Coplin o in vaschette di colorazione per vetrini contenenti PBS. 7. Immergere brevemente i vetrini lavati in acqua distillata o purificata, e farli asciugare all'aria. 8. Aggiungere circa 25 µl di Coniugato in ogni pozzetto sul vetrino. 9. Incubare i vetrini in camera umida per 30 ± 2 minuti a C. 10. Ripetere le fasi di lavaggio 6 e Mettere qualche goccia del Mezzo di Montaggio sul vetrino e coprire con un vetrino coprioggetto di 24 X 50 mm. 12. Esaminare i pozzetti ad un ingrandimento finale di 400X con un microscopio a fluorescenza adeguatamente equipaggiato. Leggere i vetrini lo stesso giorno in cui si effettua il saggio per un risultato di fluorescenza ottimale. Se questo non fosse possibile, conservare i vetrini al buio a 2-8 C fino a 24 ore. CONTROLLO DI QUALITÀ Ogni analisi (ogni volta che si tratta un vetrino o un gruppo di vetrini) dovrebbe includere entrambi i controlli, rilevabile e non rilevabile. 1. Il Controllo Rilevabile dovrebbe mostrare una fluorescenza da 1+ a 4+ per entrambi gli spot di antigeni. 2. Se si vuole un Controllo di Lettura 1+, diluire il Controllo Rilevabile (vedi sopra: Procedura del test) 1:16 e leggere contro il Sierogruppo 1 di L. pneumophila. In seguito a differenti condizioni di laboratorio, come per esempio la strumentazione, il Controllo di Lettura 1+ può variare di un fattore di diluizione due in eccesso o in difetto. 3. Il controllo Non Rilevabile dovrebbe mostrare una reattività trascurabile o assenza di reattività su tutti i pozzetti in cui viene applicato. Una fluorescenza che non corrisponde al quadro fluoroscopico del controllo rilevabile va considerata non rilevabile. Se i controlli non mostrano questi risultati, non bisogna considerare validi i risultati del test del paziente e bisogna ripetere il saggio. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL TEST L ottica del microscopio, la fonte e il tipo di luce determinano l intensità totale della fluorescenza e i titoli limite. Leggere i pozzetti di controllo per primi durante ogni analisi per assicurare un interpretazione corretta. Lettura dei Vetrini Leggere l'intensità della fluorescenza dei bastoncelli e attribuirle i seguenti valori: da 2 a 4+ Fluorescenza verde-mela da moderata a intensa. 1+ Fluorescenza netta, ma debole. Negativo Nessuna fluorescenza oppure fluorescenza corrispondente a quella del pozzetto del Controllo Non Rilevabile.

4 Pagina 4 Interpretazione dei risultati dei campioni dei pazienti Il valore limite di titolazione è definito come il reciproco della più alta diluizione del siero che mostra una netta (1+) fluorescenza verde mela. 1:16 Il titolo limite 1:16 di un singolo campione dovrebbe essere considerato come prova dell esposizione in un periodo di tempo non definito. Un secondo campione, prelevato a distanza di giorni dal primo dovrebbe essere testato in parallelo con il primo. Se il secondo campione mostra un innalzamento del titolo di quattro volte rispetto al campione iniziale, c'è una indicazione di esposizione recente. Titoli inalterati indicano che vi e' stata un'esposizione passata. <1:16 Titoli limite inferiori a 1:16 suggeriscono che il paziente non ha subito esposizioni recenti. LIMITAZIONI 1. L esecuzione di questo saggio non è intesa per la popolazione generale. 2. L esecuzione di questo saggio non è intesa per eliminare la possibilità di esposizione ad altri organismi, come per es., Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Hantavirus e altri organismi. Invece, è consigliato usare anche altri metodi. 3. L esecuzione di questo saggio non è intesa per altre matrici diverse dal siero, o per monitorare una terapia antibiotica. 4. Tutti i risultati da questo ed altri test sierologici devono essere correlati alla storia clinica, ai dati epidemiologici e ad altri dati disponibili per valutare il paziente. 5. Un singolo risultato positivo indica solo un esposizione immunologica precedente; il livello di risposta anticorpale non può essere usata per determinare la presenza di un infezione attiva o lo stadio della malattia. VALORI ATTESI Gli anticorpi IgA, IgG e IgM sono prodotti contro gli antigeni di Legionella. Complessivamente, solo l 80% delle persone positive in coltura sviluppano un aumento significativo del titolo. Di quell 80%, un aumento significativo del titolo può avvenire in 9 settimane. L anticorpo IgM può essere rilevabile per mesi. Negli Stati Uniti, singoli titoli IFA 1:256 vengono trovati in percentuali da 1 a 16% degli adulti sani. CARATTERISTICHE DI ESECUZIONE Reattività con coppie di sieroconversione di Legionella fornite da un laboratorio federale degli Stati Uniti (n = 31) Uno sperimentatore interno ha valutato la sensibilità del test Focus con 31 coppie di sieroconversione fornite da un laboratorio federale di salute pubblica degli Stati Uniti. Ognuna delle 31 coppie è stata archiviata e ha presentato un aumento dell endpoint pari al quadruplo o superiore tra sieri acuto-convalescenti per Legionella pneumophila rispetto a un IFA di riferimento. L IFA di riferimento utilizzava antigene del sierogruppo 1 e coniugato polivalente (IgA, IgG e IgM). Dei 31 pazienti, l IFA Legionella di Focus ha presentato un aumento quadruplo della reattività pari al 93,5% (29/31) con uno o entrambi gli spot antigenici; un paziente ha presentato un basso endpoint (1:64) all'antigene dei sierogruppi 2-8 e un paziente è risultato negativo. Dei 29 positivi all IFA Legionella di Focus, 13 pazienti sono risultati positivi all'antigene del sierogruppo 1, 1 paziente è risultato positivo all antigene dei sierogruppi 2-8 e 15 pazienti sono risultati positivi a entrambi gli antigeni (positività a legionella indifferenziata). Reattività con coppie di sieroconversione di Legionella fornite da un laboratorio federale degli Stati Uniti (n = 31) Risultato L. pneumophila % Focus IC al 95% Aumento quadruplo 93,5%*(29/31) 78,6-99,2% Bassa reattività (<1:256) 3,2% (1/31) 0,1-16,7% Negativi 3,2% (1/31) 0,1-16,7% * 13 pazienti sono risultati positivi al sierogruppo 1, uno è risultato positivo ai sierogruppi 2-8 e 15 hanno presentato una positività a legionella indifferenziata (positivi al sierogruppo 1 e ai sierogruppi 2-8). Reattività con coppie di sieroconversione di Legionella fornite da un laboratorio dell Unione Europea (n = 29) Uno sperimentatore esterno ha valutato la sensibilità del test Focus con 29 coppie di sieroconversione fornite. Ognuna delle 29 coppie è stata archiviata e ha presentato un aumento dell endpoint pari al quadruplo o superiore tra sieri acuto-convalescenti per Legionella pneumophila rispetto a un IFA di riferimento per i sierogruppi Gli IFA di riferimento utilizzavano spot antigenici separati per i sierogruppi 1-10, mentre gli IFA di riferimento utilizzavano coniugato polivalente (IgA, IgG e IgM). Dei 29 presunti pazienti acuti positivi, l IFA di riferimento ha rilevato quattro pazienti del sierogruppo 1, 12 pazienti del sierogruppo 6, 1 paziente del sierogruppo 2, 1 paziente del sierogruppo 8 e 11 pazienti con positività indifferenziata a legionella. Dei quattro pazienti del sierogruppo 1 con l IFA di riferimento, l IFA di Focus ne ha rilevato uno come presunto paziente acuto dei sierogruppi 2-10 e tre come presunti pazienti acuti con positività indifferenziata a legionella. Dei 12 pazienti del sierogruppo 6 con l IFA di riferimento, l'ifa di Focus ne ha rilevati sei come presunti pazienti acuti del sierogruppo 1, due come presunti pazienti acuti dei sierogruppi 2-10, tre come presunti pazienti acuti con positività indifferenziata a legionella e uno negativo. Il paziente del sierogruppo 2 con l IFA di riferimento è risultato come presunto paziente acuto del sierogruppo 1 con l'ifa di Focus. Il paziente del sierogruppo 8 con l IFA di riferimento è risultato come presunto paziente acuto con positività indifferenziata a legionella con l'ifa di Focus. Degli 11 pazienti con positività indifferenziata a legionella con l IFA di riferimento, l IFA di Focus ne ha rilevato uno come presunto paziente acuto positivo al sierogruppo 1, tre come presunti pazienti acuti positivi ai sierogruppi 2-10 e sette come presunti pazienti acuti con positività indifferenziata a legionella. Reattività con coppie di sieroconversione di Legionella fornite da un laboratorio dell Unione Europea (n = 29) Risultato L. pneumophila % IFA Focus IC al 95% Aumento quadruplo 96,6%*(28/29) 82,2-99,9% Bassa reattività (<1:256) 0,0% (0/29) 0,0-11,9% Negativi 3,4% (1/29) 0,1-17,87% * Con l IFA di riferimento, 4 pazienti sono risultati positivi al sierogruppo 1, 12 al sierogruppo 6, 1 al sierogruppo 2, uno al sierogruppo 8 e 11 hanno presentato positività indifferenziata a legionella (positivi al sierogruppo 1 e ai sierogruppi 2-10). Elevata reattività a Legionella nei sieri forniti dall Unione Europea (n = 31) Uno sperimentatore esterno ha valutato la sensibilità del test Focus con 31 sieri con elevata reattività a un IFA di riferimento per Legionella. L IFA di riferimento utilizzava spot antigenici separati per i sierogruppi 1-10 e l IFA di riferimento utilizzava coniugato polivalente (IgA, IgG e IgM). Ognuno dei 31 sieri è stato archiviato e ha presentato un endpoint superiore a 1:128 con l'ifa di riferimento per Legionella. Dei 31 sieri, l IFA di riferimento ne ha rilevati 20 che sono risultati reattivi con uno degli spot antigenici dei sierogruppi 2-10, l IFA di riferimento ne ha rilevati 3 che sono risultati reattivi soltanto allo spot antigenico del sierogruppo 1 e l'ifa di riferimento ha rilevato 8 sieri di pazienti con positività indifferenziata a legionella (reattività nell ambito di una diluizione doppia tra sierogruppo 1 e un altro sierogruppo). La reattività generale dell IFA Legionella di Focus (reattività al sierogruppo 1 e/o ai sierogruppi 2-8) è rientrata in una diluizione doppia dell IFA di riferimento per il 96,8% (30/31) dei sieri. L IFA Legionella di Focus ha presentato un endpoint di almeno 8 volte inferiore in un siero.

5 Pagina 5 Reattività intermedia a Legionella nei sieri forniti dall Unione Europea (n = 30) Uno sperimentatore esterno ha valutato la sensibilità del test Focus con 30 sieri con reattività intermedia a un IFA di riferimento per Legionella. L IFA di riferimento utilizzava spot antigenici separati per i sierogruppi 1-10 e l IFA di riferimento utilizzava coniugato polivalente (IgA, IgG e IgM). Ognuno dei 30 sieri è stato archiviato e ha presentato un endpoint pari a 1:64 o a 1:128 con l'ifa di riferimento per Legionella. Dei 30 sieri, l IFA di riferimento ne ha rilevati 26 con reattività a uno degli spot antigenici del sierogruppo 2-10 e l'ifa di riferimento ha rilevato 4 sieri di pazienti con positività indifferenziata a legionella (reattività nell ambito di una diluizione doppia tra il sierogruppo 1 e un altro sierogruppo). La reattività generale dell IFA Legionella di Focus (reattività al sierogruppo 1 o ai sierogruppi 2-8) è rientrata in una diluizione doppia dell IFA di riferimento per il 93,3% (28/30) dei sieri. L IFA Legionella di Focus è stato inferiore del quadruplo con un siero e negativo con un secondo siero. Prevalenza in una popolazione normale (n = 30) Uno sperimentatore esterno (un laboratorio di riferimento con sede in Francia), ha valutato la prevalenza con 30 sieri di una popolazione normale con il test Focus. I sieri sono risultati sieronegativi con l IFA per legionella di riferimento dello sperimentatore. Dei 30 sieri, il 20% (6/30) ha presentato una bassa reattività (1:16 o 1:32) all antigene del sierogruppo 1 di Focus e il 10% (3/30) ha presentato una bassa reattività (1:16 o 1:32) all antigene dei sierogruppi 2-8 di Focus. Reattività crociata Uno sperimentatore esterno (un laboratorio di riferimento con sede in Francia), ha confrontato la reattività crociata dell IFA Legionella di Focus con un IFA per legionella di riferimento utilizzando 16 campioni sieropositivi agli agenti patogeni che causano la polmonite. Dei 16 sieri, cinque sono risultati IgM-positivi per Mycoplasma, cinque sieropositivi per Chlamydia (uno dei cinque è risultato inoltre IgM-positivo per C. ) e sei sono risultati IgG-positivi per Streptococcus. L IFA di riferimento ha utilizzato spot antigenici separati per i sierogruppi 1-10 e l IFA di riferimento ha utilizzato coniugato polivalente (IgA, IgG e IgM). L IFA di Focus e l IFA di riferimento hanno presentato una bassa reattività (endpoint 64) con il 33% (2/6) dei campioni positivi a S.. L IFA di Focus ha presentato una bassa reattività con il 40% (2/5) dei campioni positivi a M. (1 dei 2 campioni reattivi ha avuto un endpoint pari a 1:128) e l IFA di riferimento ha presentato una bassa reattività con il 60% (3/5) dei campioni positivi a M.. L IFA di Focus ha presentato una bassa reattività (endpoint 64) con l 80% (4/5) dei campioni positivi a C., mentre l IFA di riferimento ha presentato una bassa reattività con il 60% (3/5) dei campioni positivi a C.. Popolazione Sieropositivi a S. % di reattività con l IFA Legionella di Focus 33% (2/6) IC al 95% 4,3-97,7% % di reattività con l IFA Legionella di riferimento 33% (2/6) IC al 95% 4,3-97,7% Sieropositivi a M. Sieropositivi a C. 40% (2/5) IC al 95% 5,3-85,3% 80% (4/5) IC al 95% 28,4-99,5% 60% (3/5) IC al 95% 14,7-94,7% 60% (3/5) IC al 95% 14,7-94,7% Riproducibilità inter-assay Uno sperimentatore esterno la valutato la riproducibilità inter-assay sulla base dell endpoint di 3 sieri positivi in tre giorni diversi. Tutti gli endpoint sono rientrati in una diluizione doppia. Stabilità Uno sperimentatore interno ha valutato la stabilità dell IFA Legionella di Focus. I componenti sono stati accelerate a un equivalente di 2 anni a 2-8 C. I componenti accelerate sono stati confrontati con componenti non accelerati utilizzando 10 sieri archiviati. Dei dieci sieri, uno è risultato altamente reattivo ( 1:512), uno ha presentato una reattività intermedia (1:128), sei una bassa reattività (tra 1:16 e 1:64) e tre non hanno presentato alcuna reattività. Tutti gli endpoint accelerati sono rientrati in una diluizione doppia degli endpoint non accelerati. BIBLIOGRAFIA 1. CDC. Legionellosis: Legionnaires Disease (LD) and Pontiac Fever. (December 2003). 2. CDC. Case Definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance/Legionellosis (September 1996). 3. CDC. Guideline for Prevention of Nosocomial Pneumonia. MMWR. 46(RR-1): (January 1997). 4. European Working Group for Legionella Infections. Case Definition. (2004). 5. Edelstein, P. 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