Qualità e rintracciabilità nel laboratorio di PMA alla luce delle nuove normative vigenti in Italia

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1 Qualità e rintracciabilità nel laboratorio di PMA alla luce delle nuove normative vigenti in Italia Dott.ssa Alice Bruno Dott.ssa Giovanna Tomasi CRA Centro Riproduzione Assistita - Catania

2 Introduzione Direttiva madre 2004/23 DE 2004/86 direttiva tecnica DE 2004/17 direttiva tecnica le norme di qualità e di sicurezza per la donazione, l approvvigionamento, il controllo, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di tessuti e cellule umani

3 Introduzione Direttiva madre 2004/23 La direttiva dovrebbe applicarsi ai tessuti e alle cellule umane, comprese le cellule riproduttive fresche o congelate, destinati ad essere applicati al corpo umano. Staminali emopoietiche Riproduttive Sangue Cellule Tessuti Organi

4 Attuazione delle direttive in Italia Direttiva 2004/23 D.lgs 191/2007 Direttiva 2006/17 Direttiva 2006/86 D.lgs 16/2010 REQUISITI PER LA CONFORMITA AL D. LGS. 191/2007 NEL PRELIEVO, IL CONTROLLO, LA LAVORAZIONE, LA CONSERVAZIONE, LO STOCCAGGIO E LA DISTRIBUZIONE DI GAMETI, ZIGOTI ED EMBRIONI PER TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA

5 D.lgs 191/2007 Rischio mix-up PMA Perdita di vitalità di gameti o embrioni Perdita e danneggiamento del campione Contaminazione del campione con agenti microbiologici o chimico-fisici Danneggiamento del campione per inappropriate condizioni di lavorazione Contaminazione degli operatori da parte di campioni infetti Mancata identificazione del campione Rischi derivanti dall utilizzo di azoto liquido La semplice possibilità teorica di accadimento di questi eventi ha portato la PMA sotto il controllo della direttiva.

6 D.lgs 191/2007 Art. 1 Obiettivi Assicurare un elevato livello di protezione sulla salute umana Art. 2 Ambito di applicazione Donazione, approvvigionamento, controllo, lavorazione, conservazione, stoccaggio e distribuzione di tessuti e cellule umani destinati ad applicazioni sull'uomo, nonché ai prodotti fabbricati derivati da tessuti e cellule umani destinati ad applicazioni sull'uomo. Le disposizioni si applicano anche alla donazione, alla raccolta, al controllo, alla conservazione di cellule staminali emopoietiche. Alle cellule riproduttive, ai tessuti e alle cellule fetali e alle cellule staminali embrionali, si applicano le disposizioni vigenti in materia. Per la conservazione si applicano le disposizioni di cui al presente decreto in quanto compatibili.

7 D.lgs 191/2007 Art. 3 Definizioni cellule riproduttive: tutti i tessuti e le cellule destinati ad essere utilizzati ai fini della riproduzione assistita istituto dei tessuti: una banca dei tessuti, come prevista dalla L.91/99, o una unità di un ospedale pubblico, o un settore di un servizio trasfusionale come previsto dal D.lgs191/2005, o una struttura sanitaria senza fini di lucro, in cui si effettuano attività di lavorazione, conservazione, stoccaggio o distribuzione di tessuti e cellule umani, o una struttura sanitaria autorizzata ai sensi della L.40/2004, per le attività compatibili con la legge medesima. Un centro di PMA è anche un istituto dei tessuti

8 D.lgs 191/2007 Art. 8 Tracciabilità Sono fissate le disposizioni necessarie a garantire la tracciabilità del percorso dal donatore al ricevente e viceversa. Tale tracciabilità riguarda anche le informazioni concernenti prodotti e materiali che entrano in contatto con i medesimi tessuti e cellule. Art. 16 Gestione della qualità Ciascun istituto dei tessuti istituisca e aggiorni un sistema di qualità, fondato sui principi di buona pratica. Si dovrà assicurare una regolare revisione delle prestazioni del sistema di gestione della qualità per assicurare un miglioramento sistematico e continuo Procedure operative standard Linee guida Manuali di formazione e di riferimento Moduli per le relazioni Dati relativi ai donatori Informazioni sulla destinazione finale

9 D.lgs 16/2010 Lavorare in un sistema di qualità È obbligatorio un sistema di gestione della qualità. Devono esistere procedure convalidate e scritte per tutti i processi, compreso il verificarsi di incidenti o pericoli. È necessario garantire che tutti i supporti / reagenti / prodotti monouso siano testati per la qualità con il test appropriato Garantire la manutenzione e calibrazione delle attrezzature

10 D.lgs 16/2010 Screening Anti-HIV 1 e 2 HBsAg Anti-HBc Anti-HCV Ab E inoltre il VDRL TPHA ed eventuali altri markers relativamente alla storia anamnestica del paziente Validità o

11 M.C. Magli, 2011 D.lgs 16/2010

12 D.lgs 16/2010 Qualità dell aria specifica qualità e pulizia dell aria minimizzare i rischi di contaminazione qualità dell aria con numeri di particelle e numeri di colonie microbiche equivalenti a quelli di grado A in un background di grado D.

13 Qualità nel laboratorio di PMA GOOD LABORATORY PRACTICE QUALITY Invisible when good, impossible to ignore when bad People forget how fast you did a job but they remember how well you did it Howard W. Newton Quality is never an accident, it is always the result of intelligent efforts John Ruskin Quality is never an accident; it is always the result of high intention, sincere effort, intelligent direction and skilfull execution; it represents the wise choice of many alternatives William A. Foster

14 Qualità nel laboratorio di PMA Alti livelli di patients care Alti tassi di successo Quality Control (QC): L insieme delle azioni ed iniziative che consentono di definire e tenere sotto controllo gli standard qualitativi richiesti. Quality Assurance (QA): L insieme di tutte le attività pianificate e sistematiche richieste, in grado di garantire il soddisfacimento degli obiettivi della qualità

15 Qualità nel laboratorio di PMA Quality Improvement: Gestione del rischio Valutazione della qualità Risoluzione dei problemi PDCA CYCLE Say what you do do what you say and Show that you do as you say

16 Sistema di gestione della qualità

17 Sistema di gestione della qualità Sistema di gestione della qualità ISO 9001 o GMP per analizzare in modo critico ed eventualmente ridisegnare i processi principali per sviluppare un sistema strutturato che supporta nella crescita per misurare la performance dei processi ed attuare ulteriori miglioramenti per dare maggiori garanzie dei prodotti/servizi offerti per applicare le norme cogenti, le linee guida, le leggi

18 Sistema di gestione della qualità Nella PMA l erogazione del servizio non attiene al solo esito clinico, ma comprende piuttosto ogni singolo aspetto della pratica, visto come un processo unico e continuo. implementazione ISO 9001:2008 Miglioramento dei livelli di performance (pratica e finanziaria) mantenimento Un risultato si ottiene più efficacemente quando tutte le risorse e le attività sono gestite come un processo. Controllo di qualità Assicurazione di qualità Gestione della qualità

19 Good Laboratory Practice GOOD LABORATORY PRACTICE QUALITY Attraverso il controllo e la codifica delle fasi di ciascun processo, la dimostrabilità e la tracciabilità di gameti, zigoti ed embrioni. Manuale Qualità per il Laboratorio Procedure Operative Standard (POS) Moduli, protocolli, registrazioni dell addestramento e schede per il personale Registrazioni delle attività svolte e di un programma per la gestione delle attrezzature/strumentazione.

20 Good Laboratory Practice pregnancy rate customer satisfaction Indicatori di processo

21 Good Laboratory Practice Laboratory Performance Indicators ovociti previsti/recuperati % ovociti maturi cleavage rate % di frammentazione in terza giornata % embrioni ottimali in terza giornata fertilization rate % fertilization failure, % di ovociti degenerati post-inseminazione % di sopravvivenza allo scongelamento implantation rate % abnormal fertilization take home baby rate

22 Tracciabilità nel Laboratorio di PMA Tracciabilità e Rintracciabilità La tracciabilità consiste nella possibilità di ricostruire la storia di un qualsiasi prodotto, dalla sua produzione alla distribuzione o viceversa. Strumentazioni

23 Tracciabilità nel Laboratorio di PMA Reperire e individuare i tessuti o le cellule in ogni fase dell approvvigionamento, della lavorazione, del controllo e dello stoccaggio fino alla distribuzione al ricevente o al luogo di smaltimento, compresa la capacità di individuare i pazienti coinvolti e il Centro PMA, e il laboratorio che riceve, lavora o conserva i gameti, zigoti ed embrioni e, a livello di strutture mediche, la capacità di individuare i responsabili che effettuano il trattamento; la tracciabilità comporta inoltre la facoltà di reperire e individuare tutti i dati pertinenti relativi ai prodotti e ai materiali che entrano in contatto con tali gameti, zigoti ed embrioni

24 Tracciabilità nel Laboratorio di PMA Assegnare un codice univoco da mantenere e controllare in ogni fase del processo doppio cognome della coppia Registrare tutte le fasi del processo nei documenti di registrazione Data Ora Operatore

25 Tracciabilità nel Laboratorio di PMA Terreni di coltura USA EU Australia 24 h 48 h >48 h? Verificare corrispondenza lotto Verificare Refrigerazio ne ALIQUOTARE

26 Qualità nel Laboratorio di PMA I principi base: Favorire la fertilizzazione e lo sviluppo embrionale in vitro Normale fertilizzazione Normale sviluppo embrionale Selezionare gli embrioni per il replacement in utero Elevato birth rate e bassa percentuale di gravidanze multiple Ottenere embrioni disponibili per la crioconservazione (???) Evitare i fattori che possono influenzare lo sviluppo embrionale dopo l impianto (epigenetica) A. Sunde, 2010

27 Qualità nel Laboratorio di PMA Mantenere la vitalità embrionale in vitro Gli embrioni in vitro sono esposti a stress significativamente più alti che non in vivo La vitalità embrionale in vitro dipende da: Composizione dei terreni di coltura Qualità dei terreni di coltura Caratteristiche fisico-chimiche dei terreni di coltura ph osmolarità temperatura Ambiente gassoso: O2 & CO2 Condizione di coltura E. Van den Abbeel, 2010

28 Qualità nel Laboratorio di PMA Conseguenze dello stress in vitro Ritardi nello sviluppo embrionale Arresto nello sviluppo spesso prima dell attivazione del genoma embrionale Alterazione della fisiologia embrionale, in particolare del metabolismo Alterazione dell espressione genica Alterazione dell imprinting di alcuni geni Alterazione della vitalità E. Van den Abbeel, 2010

29 Qualità nel Laboratorio di PMA Prima settimana dello sviluppo embrionale Prima divisione Attivazione del genoma materno Compattazione della morula Formazione della Blastocisti Eventi esattamente programmati Riprogrammazione epigenetica, attivazione del metabolismo e cell allocation G. Vayta, et al., 2010

30 Qualità nel Laboratorio di PMA Definizione di un buon terreno di coltura Definire i criteri di valutazione: 1) Performance Risultati clinici gravidanze Sicurezza Documentazione 2) Produttore Documentazione Design philosophy Affidabilità e convenienza - Distribuzione e trasporto Scadenza

31 Qualità nel Laboratorio di PMA Scelta del terreno di coltura PERFORMANCE OUTCOMES COSTI/BENEFICI TAKE HOME BABY

32 Qualità nel Laboratorio di PMA Successo clinico Un buon sistema di coltura dovrebbe garantire: Alto tasso di fertilizzazione Clivaggio corretto e buona morfologia embrionale Un alto numero di embrioni con buona morfologia Un alto pregnancy rate con transfer da fresco Un basso tasso di aborti Un alto cumulative delivery rate (fresh + frozen) Un basso tasso di gravidanze multiple A. Sunde, 2010

33 Problema: Temperatura Gli ovociti non tollerano l ipotermia ph Esiste una relazione intrinseca tra regolazione del ph e concentrazione di CO 2 Osmolarità può verificarsi evaporazione Luce La luce diretta può danneggiare il terreno di coltura I raggi UV possono danneggiare gli embrioni A. Sunde, 2010 Qualità nel Laboratorio di PMA Challenges In Vitro Soluzione: Lavorare velocemente Controllo continuo della T (sonde, termometri, piani riscaldati, etc); Coltura con olio Lavorare velocemente Utilizzare buffers (HEPES etc ) Coltura con olio Lavorare velocemente Coprire con olio Aggiungere osmoliti? Evitare l esposizione alla luce

34 Qualità nel Laboratorio di PMA Problema: Challenges In Vitro Soluzione: Contaminanti chimici - Componenti dei terreni di coltura o i terreni stessi Utilizzare terreni con certificazioni di qualità del produttore - Volatile Organic Components (VOC) Air quality in laboratorio e quindi negli incubatori Pulire e/o sterilizzare i nuovi strumenti A. Sunde, 2010

35 Qualità nel Laboratorio di PMA Challenges In Vitro Problema: Microrganismi I follicoli aspirati contengono spesso flora vaginale Il liquido seminale può contenere microrganismi. Gli operatori, le colture e le metodiche di preparazione possono introdurre microrganismi nel sistema Gli embrioni sono sensibili alle endotossine Soluzione: Aggiungere antibiotici Penicillina Streptomicina Gentamicina Good working routines Tenere puliti le superfici di lavoro, microscopi ed incubatori Monitorare la qualità dell aria Utilizzare materiale monouso destinato all ART. A. Sunde, 2010

36 Qualità nel Laboratorio di PMA Embryo tested disposable MEA Test e HSSA Test (embrio-citotossicità) Rintracciabilità e controllo di tutti i lotti LAL Test (endotossine batteriche) ISO e ISO (Sterile R) Ames Test (per le mutazioni geniche) Marchio CE USP Classe VI (reazione cellulare al contatto diretto o indiretto con la plastica)

37 Qualità nel Laboratorio di PMA Migliorare la coltura embrionale Gocce da 10-80µl QUESTIONS TO ANSWER Umidità all interno dell incubatore Coltura sotto olio Mantiene separate le gocce le une dalle altre Previene la rapida evaporazione Previene le variazioni di ph e temperatura Monocolture o terreni sequenziali? Supplementazione con macromolecole G. Vajta, 2010 Rinnovare il terreno? Communal o individual culture Mantenere il microambiente??? Incrementare la formazione di blastocisti e l I.R.? Concentrazione dell O 2 Bassa concentrazione? Aumentare il numero di blastomeri e l impianto?

38 Qualità nel Laboratorio di PMA Periodo critico per determinare la competenza dell ovocita Condizioni di coltura non ottimali possono alterare irreversibilmente accrescimento e sviluppo fetale e postnatale Periodo critico per determinare la qualità della blastocisti EMBRIONE CONDIZIONI DI COLTURA??? Parti pretermine Mortalità prenatale Basso peso alla nascita Doyle, 1992 Hansen, 2002 Oliveness, 2002 Estremamente vulnerabile

39 Qualità nel Laboratorio di PMA La chiave per il successo della coltura embrionale è minimizzare le perturbazioni dell ambiente attorno all embrione. Incubatori TEMPERATURA QUALITA DELL ARIA COMPOSIZIONE DEI TERRENI DI COLTURA GAS

40 Qualità nel Laboratorio di PMA ph Osmolarità Condizioni ottimali per i gameti Gas phase e ph Misurazione del ph: Standard gas ph probes ISFET probes ph meter MTG ph meter Bloodgas analyser Garantita da: 5-6% CO 2 all interno dell incubatore Utilizzo di sistemi tampone Temperatura di 37 C Rapide variazioni di CO 2 non sono evidenziabili dal cambiamento del ph Occorre Misurare la CO 2 Difficoltà: accuratezza, errore, contaminazione, non utilizzabili nella routine R. Janssens, 2010

41 Qualità nel Laboratorio di PMA Metodo riproducibile e affidabile, Veloce e facile da ripetere, Rileva rapidi variazioni nella concentrazione della CO 2 (malfunzionamento dell incubatore). Dal 1969 è ampiamente dimostrato che la temperatura più adatta alle colture embrionali è di 37 C. Misurare la CO 2 e la temperatura Colture sotto olio per ridurre le variazioni di ph osmolarità e temperatura Gli strumenti per taratura e controllo devono essere certificati dal Sistema di Taratura Italiano (SIT) R. Janssens, 2010

42 Qualità nel Laboratorio di PMA Il massimo controllo della contaminazione viene garantito limitando al minimo il rischio di contaminanti presenti nell aria, nell acqua e sulle superfici. DEFINIZIONE DELLA QUALITÀ DELL ARIA Le classificazioni della qualità dell aria sono definite dalle norme Federal Standard 209E e dallo Standard internazionale ISO (Classe 1, 10, 100 e ISO Classe 1, 2, ). Il numero della classe definito dal Federal Standard rappresenta il massimo numero consentito di particelle di 0,5 micron o di dimensioni maggiori presenti in un piede cubo d aria. La classe 2 ISO è quella che meglio corrisponde alla classe 100 dello Standard federale. Filtrazione HEPA 100% per ottenere rapidamente condizioni di qualità dell aria di classe 100. Il filtro HEPA cattura i contaminanti biologici e particolati aero-dispersi impedendone la diffusione. HEP A Sistema di filtrazione dei VOC Composti Organici Volatili I VOC possono dividersi in due categorie: Antropogenici (benzene, toluene, metano, CCl 4, etano, etc ). Biogenici (terpeni, isoprene, alcoli, aldeidi e chetoni) Le emissioni biogeniche dominano spesso quelle di carattere antropogenico, soprattutto nel periodo estivo in concomitanza dell'aumento del quantitativo di ozono. Membrane a Carbonio Attivo

43 Qualità nel Laboratorio di PMA Sistema di filtrazione dei composti organici volatili (VOC). Elimina i composti organici volatili tossici che entrano in laboratorio dall ambiente esterno : aria.incubatori.colture.embrioni! Potenzialmente presenti anche negli articoli in plastica che vengono introdotti nell incubatore. Uso di plastica Embryo tested

44 Qualità nel Laboratorio di PMA Good Laboratory Practice Temperatura: 37 C ± 0.1 Umidità > 90% Daily record di temperatura e CO 2 Controllare il ph dei terreni di coltura quando si introduce un nuovo lotto Sostituire l acqua una volta alla settimana (acqua ultrapura) Pulire i ripiani degli incubatori una volta alla settimana Campionamenti microbiologici ogni trimestre Sostituire i filtri HEPA e VOC ogni anno Cosa fare e non fare Leggere sempre il manuale prima di utilizzare le strumentazioni If it is not broken, do not fix it (controlli di routine) Non introdurre contenitori con etichette Ricordare che l ambiente del laboratorio può avere effetti sull ambiente dell incubatore

45 Qualità nel laboratorio di PMA La differenza tra un laboratorio ed un altro è data dalla qualità Il ricordo è un modo d incontrarsi, Kahlil Gibran Loredana Papale