STORIA DEL LINGUAGGIO GENETICO

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1 Corso: Storia delle scienze Docente: Prof. Zingales UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PALERMO MASTER IN DIDATTICA DELLE SCIENZE PER INSEGNANTI DELLE SCUOLE ELEMENTARI E MEDIE STORIA DEL LINGUAGGIO GENETICO Corsiste: G.Chiofalo G. Croce R. Rinaldi Dalle teorie ingenue Da sempre l uomo l ha intuito alcune leggi della trasmissione ereditaria dei caratteri, grazie all osservazione ovvia che simile produce simile,, cioè che i gatti nascono da altri gatti, le rose da altre rose, gli esseri umani da altri esseri umani, e che i figli rassomigliano ai genitori. Tuttavia fino alla seconda metà dell Ottocento non vi era alcuna spiegazione scientifica dei meccanismi che governano la trasmissione dei caratteri ereditari, piuttosto vi era la convinzione che i caratteri di un individuo fossero il risultato di una semplice mescolanza di quelli dei due genitori. L assenza di teorie scientifiche lasciava spazio alle credenze popolari, olari, come quelle dei contadini russi che circondavano di specchi la stalla di una pregiata cavalla gravida affinché,, guardandosi, potesse generare un puledro bello e pregiato come essa stessa, o quella delle mamme italiane alle quali si suggeriva di guardare foto di bimbi e bimbe belle affinché il nascituro fosse bello come loro. Eppure sin dai tempi iniziali dell'agricoltura e della pastorizia l'umanità era stata capace di selezionare, in modo intuitivo ma attraverso incroci, piante e animali più pregiati, più fruttiferi, più adatti alle crescenti esigenze di cibo e di spostamenti di popolazioni in larga espansione.

2 all L'evoluzione della specie Nei primi del 1800 diverse scoperte contribuirono direttamente e indirettamente a gettare le basi della futura scienza chiamata genetica. - Nel 1838 Matthias Jakob Schleiden e Theodor Schwann scoprono che la cellula è l'unità fondamentale della vita. - Nel 1859 Charles Darwin pubblica L'origine delle specie. Egli fu il primo ad osservare una successione temporale di organismi sulla Terra dal più semplice al più complesso e a cercare di formulare una teoria rispetto a questo. Nel suo libro "L'evoluzione della specie" del 1859 parla di selezione naturale,, ossia la selezione degli organismi più adatti a sopravvivere in un dato ambiente. Ma a Darwin manca una soddisfacente teoria sull'ereditarietà. per arrivare alle Basi della Genetica Moderna (fine 1800) A. leggi di Mendel e la genetica classica, B. scoperta del DNA, C. descrizione dei cromosomi

3 A. 1865: Gregor Mendel termina i suoi esperimenti (pubblicati nel 1866). Si dovette attendere la seconda metà dell'ottocento perché il mistero della trasmissione ereditaria dei caratteri genetici venisse svelato dal lavoro del monaco austriaco Gregor Johann Mendel ( ) 1884) che mediante esperimenti di fecondazione artificiale sulle piante (cioè di trasporto del polline di una pianta sul pistillo di un'altra), durati quasi dieci anni e condotti su circa piante di pisello (Pisum( sativum) ) nel giardino del monastero di Brno, stabilì le leggi di base dell'ereditarietà. Mendel fu il primo che si pose, e seppe risolvere, un problema basilare: come si trasmette un singolo carattere ereditario da un u organismo all altro altro lungo le generazioni? Invece di affrontare un organismo nella sua interezza, si focalizzò su alcuni particolari, i, come il colore della pianta, o la dimensione della pianta, o la forma dei semi e così via. Egli scoprì un comportamento stabile nella modalità di trasmissione di questi caratteri e quindi fonda, con le sue leggi, la Genetica Moderna. L'importanza di Mendel sta anche nel fatto che egli tra i primi portò nelle scienze della natura il concetto che fosse loro compito scoprire le leggi naturali. Esse dovevano basarsi su criteri sperimentali prestabiliti e dimostrabili in base a criteri matematici rigorosi; e le conclusioni dovevano permettere di prevedere i fenomeni che si sarebbero verificati durante la ricerca. Ma queste scoperte non divennero patrimonio comune dell'umanità e della scienza che molti anni più tardi.

4 L impatto storico di questa scoperta è molto grande. Prima di Mendel la Biologia era una non- scienza: l altissima l complessità degli aspetti chimico-fisici della organizzazione dei viventi scoraggiava talora in partenza la ricerca di leggi semplici. Mendel per la prima volta dimostra che almeno alcuni aspetti basilari della Biologia possono essere invece compresi a livello meccanico. Ad esempio, egli riesce a prevedere con la statistica come alcuni caratteri si trasmettono da una generazione all altra, altra, semplicemente osservando i fatti ed elaborando una legge che li spiega, pur senza avere ancora la nozione del substrato materiale alla base di questa trasmissione. Le leggi di Mendel Mendel ipotizza che caratteri alternativi (per esempio il colore del seme di pisello, giallo o verde) sono determinati da "fattori particolati" - quelli che oggi chiamiamo geni - trasmessi dai genitori alla prole attraverso i gameti (le cellule riproduttive). Ogni fattore deve esistere in forme alternative (gli alleli), ognuna delle quali determina il tipo di carattere (giallo o verde). Poiché è sempre visibile uno solo dei caratteri, anche nel risultato di incroci tra linee diverse, deve esistere un allele dominante, che determina la forma fisica (o fenotipica) e uno recessivo, che pur presente, viene mascherato a livello del fenotipo

5 Legge della dominanza: Mendel incrociò due linee pure (omozigote dominante e omozigote recessivo), di cui una a fiori rossi e una a fiori bianchi. Nella prima generazione F1 tutti i figli mostravano solamente uno dei caratteri presenti nei genitori; l altro l carattere era completamente scomparso; queste caratteristiche furono chiamate da Mendel dominanti. Quindi: incrociando tra loro due individui di linea pura che differiscono per un solo carattere, si ottengono nella prima generazione filiale (F1) individui che manifestano il carattere dominante mentre quello recessivo rimane nascosto. Legge della segregazione: Dall'analisi della «seconda generazione filiale» o F2, riapparivano i caratteri scomparsi nella generazione precedente. Mendel chiamò questi caratteri recessivi. La F2 era composta da caratteri sia dominanti che recessivi, legati dal rapporto 3:1. Ciò si spiegava ammettendo che le caratteristiche fossero determinate da fattori separati. Questi fattori si trovavano nelle piante F1 in coppie: un componente è ereditato dal padre e l'altro dalla madre.

6 Legge dell assortimento indipendente: Mendel considerò incroci tra piante che differivano per due caratteri: un genitore produceva semi lisci e gialli (dominanti) e l'altro rugosi e verdi (recessivi). La F1 era composta per intero da componenti genotipicamente eterozigoti, mentre fra i componenti della F2 Mendel notò un rapporto in media di 9:3:3:1. Affermò che quando si formano i gameti, gli alleli di un gene si separano indipendentemente dagli alleli di un'altro gene. Oggi si sa che i fattori di Mendel sono i geni, piccoli segmenti di DNA ognuno dei quali esprime un carattere ereditario secondo un linguaggio chimico detto codice genetico.. Le coppie di geni, detti alleli che, proprio come i fattori di Mendel, codificano per uno stesso carattere, sono localizzati sui due cromosomi di una stessa coppia. In questo modo si spiega la segregazione dei caratteri: gli alleli, trovandosi su cromosomi diversi, vengono separati al momento della meiosi e trasmessi indipendentemente l'uno dall'altro.

7 B. 1869: Friedrich Miescher isola il DNA. Miescher era uno studente di Chimica a Zurigo. Mentre lavorava sul pus (un liquido infiammatorio ricchissimo in globuli bianchi degenerati), per caso aggiunse dell alcool etilico a questa sostanza e osservò la pronta precipitazione di una massa biancastra: il DNA. Egli in realtà non poteva sapere di che si trattasse, ma si accorse presto che la sostanza precipitata aveva due principali caratteristiche: era una sostanza acida (bastava determinarne il ph), e si trovava nel nucleo (che è il principale costituente delle cellule presenti nel pus, povere di citoplasma). Lo chiamò quindi "acido nucleico. ALLA SCOPERTA DEL DNA Il DNA era stato isolato per la prima volta. La sostanza isolata da Miescher era bianca, zuccherina, leggermente acida e conteneva fosforo. Poiché era stata trovata soltanto nei nuclei delle cellule, venne chiamata acido nucleico. Tale nome fu in seguito modificato in acido desossiribonucleico (DNA) per distinguere questa sostanza da una simile, l'acido ribonucleico (RNA).

8 C. 1879: il biologo tedesco Walter Fleming descrive il comportamento dei "cromosomi". Con il miglioramento dei microscopi e grazie ad una particolare tecnica di colorazione, Fleming comincia ad osservare cellule in divisione e nota la comparsa, nel nucleo cellulare, di alcuni bastoncini microscopici nettamente delineati, visibili come barrette nere, intensamente colorate. Il termine è quindi puramente descrittivo: sono dei corpuscoli (soma = corpo) colorati (croma = colore), o cromosomi. Tutta la Genetica è nata da queste tre osservazioni quasi casuali; Esiste una correlazione tra: il fatto che una pianta è costituzionalmente di un colore piuttosto che di un altro, cioè possiede un particolare "carattere"; l esistenza l di una sostanza acida nel nucleo delle cellule; l esistenza l di bastoncini nelle cellule che si distribuiscono in modo regolare tra le due cellule figlie.

9 1900: Correns, DeVries e Tschermak riscoprono le Leggi di Mendel. Per trentaquattro anni, cioè dal 1866, il lavoro scientifico di Mendel, è stato completamente ignorato fino al 1900, anno in cui tre genetisti diversi, nessuno dei quali a conoscenza del lavoro degli altri, riscoprono indipendentemente le Leggi di Mendel. Per correttezza scientifica, decidono di chiamarle ugualmente "Leggi di Mendel", avendo la semplicità di ammettere che il primo ad osservarle e formularle era stato Mendel. Le basi della Genetica dei caratteri patologici sono poste quando si osserva che anche le malattie possono essere trasmesse lungo le generazioni, con le stesse modalità definite per i caratteri ereditari normali. MUTAZIONI Nel 1902 il botanico olandese,, Hugo de Vries, notò che a volte in una pianta da lui analizzata si presentava un fenotipo del tutto nuovo; egli ipotizzò che un carattere nuovo comparisse in seguito a improvvisi cambiamenti avvenuti nei geni, e chiamo questi cambiamenti mutazioni e gli organismi con tali mutazioni furono detti mutanti. INTERAZIONI ALLELICHE Dominanza incompleta e codominanza A mano a mano che gli studi di genetica procedevano, divenne chiaro che le caratteristiche dominanti e recessive non sono sempre così nette come i sette caratteri studiati da Mendel nella pianta di pisello. Alcune caratteristiche sembrano mescolarsi: per esempio, incrociando una pianta di bocca di leone con fiori rossi con un'altra con fiori bianchi si producono eterozigoti di colore rosa. Questo fenomeno, in cui il fenotipo dell'eterozigote è intermedio tra quelli dei due omozigoti, è detto dominanza incompleta.. Però in altri casi gli alleli possono agire da codominanti,, con eterozigoti che esprimono contemporaneamente entrambi i fenotipi omozigoti. Un esempio familiare è il sangue umano di tipo AB, in cui i globuli rossi mostrano le caratteristiche relative sia al tipo A sia al tipo B.

10 1902: Walter Sutton formula la Teoria cromosomica dell ereditariet ereditarietà. Mendel presuppone che fra le cellule figlie si dividano dei "fattori", degli oggetti che "portano" il carattere, ma non può sapere quali sono. L'inglese Sutton, un neo-laureato, osservando le cellule al microscopio, si accorse che quando la cellula si divide, i cromosomi vengono suddivisi con molta precisione e regolarità,, spostandosi per metà in una cellula figlia e per metà nell altra. Sutton notò che i cromosomi avevano il comportamento che ci si aspettava dai "fattori" mendeliani. Infatti, mentre il citoplasma può essere suddiviso fra le cellule e in modo anche molto irregolare, i cromosomi costantemente vengono dimezzati fra le due cellule figlie. Sutton perciò concluse che il comportamento mostrato dai cromosomi corrisponde quello previsto per i fattori che determinano le caratteristiche della cellula. Nasce così la "teoria cromosomica" dell ereditariet ereditarietà: : i fattori ereditari devono trovarsi all interno di questi "bastoncini" Archibald Garrod Il medico inglese studia e illustra errori metabolici congeniti, quali l alcaptonuria, una malattia dell uomo caratterizzata dal fatto che le urine diventano scure dopo l esposizione all aria e dalla tendenza a sviluppare artrite in tarda età. Dall incidenza della malattia in famiglie di individui, il ricercatore assieme al suo collega W. Bateson scoprirono che: Spesso più membri della famiglia avevano l alcaptonuria La malattia era molto più frequente nei figli di genitori primi cugini. L alcaptonuria è una malattia erediataria Dall analisi delle urine scoprì che gli individui affetti da questa malattia secernono nelle urine l acido omogentisico che è il responsabile della colorazione scura delle loro urine per esposizione all aria.

11 Garrod concluse i suoi studi affermando che l alcaptonuria è un esempio di errore congenito del metabolismo, che dipende dall assenza di un enzima in uno dei passaggi metabolici dell acido omogentisico. 1909: compare la parola gene. Wilhelm Johannsen, un botanico danese, per primo usa questo termine per indicare l unitl unità di base della eredità. Il gene, così come il metro è l unità di misura della lunghezza, viene proposto come la unità per calcolare la quantità di eredità.. Poiché all epoca erano stati studiati determinati caratteri attribuibili a un singolo "fattore", il gene si poteva definire come quella porzione del materiale ereditario che determina un carattere. Il termine Gene viene dal greco, dalla radice "gen" che vuol dire generare; in questo senso, il gene ha l informazione l per "generare" il carattere.

12 1911: Thomas Hunt Morgan studia l ereditarietl ereditarietà nel moscerino della frutta. Agli inizi del XX secolo T.H. Morgan conferma le leggi di Mendel, ma le arricchisce di una serie di importanti eccezioni, arrivando al concetto che più geni devono essere concatenati in un ordine determinato lungo i cromosomi. Egli dimostrò con gli esperimenti di incrocio sul moscerino della frutta, la Drosophila melanogaster, che certi caratteri sono legati al sesso, cioè che i loro geni sono portati sui cromosomi sessuali. Poiché il cromosoma X porta dei geni che non sono presenti sul cromosoma Y, un singolo allele recessivo sul cromosoma X del maschio dàd luogo ad un fenomeno recessivo dal momento che non è presente alcun altro allele. Al contrario, una femmina eterozigote per un carattere legato al sesso mostrerà caratteristiche dominanti. Nell'uomo, tra i caratteri legati al sesso ci sono il daltonismo e l'emofilia Phoebus Aaron Levene, ipotizzo che i quattro mattoncini del DNA, le basi nucleodiche, erano posti uno accanto all'altro a formare molecole di quattro unità.

13 INDIVIDUAZIONE DEL PRINCIPIO TRASFORMANTE 1928 F. Griffith Griffith fece degli esperimenti con i batteri Streptococcus pneumoniae, il batterio che causa la polmonite. Topi a cui erano stati iniettati pneumococchi del tipo III S (virulenti) morivano, mentre topi iniettati o con batteri del tipo II R (avirulenti) o con batteri III S uccisi al calore sopravvivevano. I batteri per poter essere infettivi dovevano essere vivi e possedere l involucro polisaccaridico. Tuttavia, se iniettati con una miscela di batteri vivi II R (avirulenti) e III S uccisi singolarmente incapaci di uccidere, i topi morivano ed erano presenti nel sangue batteri vivi di tipo III S. Griffith concluse gli esperimenti affermando che alcuni batteri R erano stati trasformati in cellule infettive di tipo III S per interazione con le cellule morte di tipo III S. Egli riteneva che l agente sconosciuto responsabile per il cambiamento del materiale genetico fosse una proteina e si riferì a questo agente come il principio trasformante.

14 1938 Rudolf Signor, Torbjorn Caspersson e Einer Hammarsten Scoprirono che il DNA poteva avere una dimensione compresa tra a di Dalton, e che quindi il DNA era formato da lunghe sequenze di basi nucleotidiche, e non da tetranucleotidi come aveva immaginato Levene. 1941: George Beadle ed Edward Tatum formulano la teoria "un gene - un enzima". Tutto sembra fermarsi nuovamente per una trentina d anni, d finché nel 1941 i due biochimici George Beadle ed Edward Tatum studiavano i difetti enzimatici nella fungo Neurospora crassa, la l comune "muffa del pane". La loro teoria era che la funzione del gene non fosse la determinazione di un generico "carattere", bensì quella di una precisa proteina enzimatica, dalla cui funzione, a sua volta, potrà emergere un carattere. Questi ricercatori identificarono alcuni mutanti della muffa, per cui una variazione nell azione dell enzima enzima modificava il carattere, e si resero conto che quello che cambiava era appunto il gene. Da un punto di vista biochimico, quindi, il gene doveva in qualche modo determinare la costituzione dell enzima. enzima. Si noti che all'epoca tutti pensavano che i geni dovessero trovarsi rsi nel nucleo, ed alcuni pensavano che fossero localizzati nel DNA, ma ancora, a più di 70 anni dalla scoperta del DNA, non vi erano prove definitive che fosse il substrato della informazione ereditaria.

15 1943: William Astbury realizza la prima fotografia a raggi X del DNA. Astbury realizzando la prima fotografia a raggi x del DNA, spinge a pensare che il DNA sia troppo semplice per essere portatore di una qualche informazione complessa. Infatti, dalla regolarità delle tracce radiografiche, si intuisce che il DNA ha una struttura ura regolare. Questa regolarità si contrapponeva al pensiero che la molecola portatrice dell informazione dovesse essere complessa per poter dare origine ad una struttura altamente complessa quale un essere vivente. In quest ottica le proteine, molto più complesse e variabili, strutturalmente e biochimicamente, del DNA, sembravano candidati più probabili quali portatrici dell informazione genetica. Ciascuna catena polipeptidica ha infatti complessità maggiore, rispetto al DNA, nella propria sequenza di amminoacidi, nel ripiegamento nello spazio tridimensionale, nella associazione con altre catene polipeptidiche, nella reattività chimica. VERSO UNA NUOVA DEFINIZIONE DELLA NATURA DEL PRINCIPIO TRASFORMANTE 1944, O. T. Avery e colleghi dimostrarono che il principio trasformante non era di natura proteica, ma piuttosto DNA. Lisarono cellule batteriche di tipo III S e separarono il lisato nei suoi componenti macromolecolari (lipidi, polisaccaridi, proteine, DNA ed RNA) Saggiarono ognun componente per verificare se contenesse il principio trasformante controllando se fosse in grado di trasformare batteri R in cellule III S Gli acidi nucleici risultarono gli unici componenti in grado di effettuare la trasformazione. Usarono nucleasi specifiche per degradare rispettivamente l RNA (RNAasi) o il DNA (DNAasi) Degradando il DNA non si otteneva alcuna trasformazione

16 Questi risultati indicavano fortemente che il DNA fosse il materiale genetico. Nonostante l importanza del lavoro di Avery, esso fu criticato perché gli acidi nucleici isolati dai batteri non erano compleatmente puri, e, in realtà possedevano dei contaminanti di natura proteica 1949 Roger e Colette Vendrely, insieme ad Andre Boivin Scoprirono che le cellule deputate alla riproduzione contenevano un quantitativo di DNA pari alla meta di quello contenuto nelle altre cellule del corpo. Questa scoperta avvalorava ulteriormente la teoria che il DNA fosse la sede dell'informazione genetica: due cellule con metà DNA unendosi ricostituivano un patrimonio genetico intero, di derivazione in parte materna e in parte paterna.

17 A.D. Hershey e M. Chase 1953: E IL DNA IL MATERIALE GENETICO Studiando la replicazione del batterofago T2 che infettava Echerichia coli prima attaccandosi con le fibrie della coda e poi iniettano il materiale genetico all interno che controllava la produzione di particelle della progenie. Marcarono il DNA dei batteri con un isotopo radioattivo del fosforo o le proteine con un isotopo radioattivo dello zolfo. Infettarono i batteri con i batteriofagi e raccolsero la progenie fagica prodotta in entrambi i casi: una con le proteine marcate e una con il DNA marcato. Nel primo caso la radioattività si riscontrava nelle ombre fagiche rilasciate e non all interno delle cellule batteriche, nel secondo caso invece gran parte della radioattività era riscontrata all interno di batteri A questo punto l attenzione dei ricercatori si concentra sul DNA come materiale genetico. Si cercava di capire le caratteristiche chimiche e fisiche di questa molecola, la sua composizione nei diversi tessuti che costituiscono gli organismi, e secondo un argomento di attualità per l epoca, l effetto sul materiale genetico degli agenti mutageni e in particolare delle radiazioni ionizzanti e del radioattivo.

18 E. CHARGAFF 1952 iil biochimico austriaco idrolizza il DNA di numerosi organismi mediante trattamento chimico e rivela che la quantità di purine (Adenina e guanina) era uguale alla quantità di pirimidine (Citosina e Timina). Il dato che all inizio sembrava una coincidenza si sarebbe rivelato un tassello fondamentale.e ancora più nel dettaglio, in ogni molecola di DNA la quantità di adenina era uguale alla quantità di timina, mentre la quantità di citosina era uguale alla quantitò di guanina. Queste equivalenze sono divenute note come regole di Gargaff: A/T = G/C Sorgente di DNA ADENINA TIMINA GUANINA CITOSINA timo di vitello milza di bue lievito C.Chargaff non fu in grado di dare un senso a questa impressionante regolarità bacillo tubercolino DIFFRAZIONE AI RAGGI X I fisici cominciarono a sviluppare un metodo geniale per osservare ciò che fino a pochi anni prima era considerato inosservabile: la disposizione degli atomi nelle molecole. Il trucco era lasciar passare raggi X fra gli interstizi delle molecole di struttura cristallina. Dal complesso gioco di ombre e interferenze emerso sulla lastra (diffrazione) si poteva dedurre, grazie alla matematica, la posizione degli atomi.

19 A rincorrere la struttura del Dna ci sono figure di formidabile caratura: Nel 1952 Linus Pauling chimico californiano, è autorità mondiale nel campo della struttura delle molecole biologiche è il primo che ha scoperto la forma elicoidale come uno delle impalcature di base delle proteine. Propose per il DNA una struttura a tripla elica. Nel modello di Pauling i gruppi fosfato del DNA erano all interno dell elica mentre all esterno c erano le basi azotate. Si intrecciavano tre filamenti a formare una tripla elica. Pauling aveva dimenticato le cariche negative degli atomi di ossigeno di ciascun gruppo fosfato e la loro posizione non poteva essere interna all elica, perché avrebbero destabilizzato la struttura. Quasi incredibilmente l uomo che aveva scritto un libro sui legami chimici aveva sbagliato. Nel 1954 vince il Nobel per la chimica (e nel 1964 un altro, per la pace). Maurice Wilkins In Inghilterra contribuisce a compie studi di tal genere, usando la chimica e i raggi X per risolvere la struttura del DNA. Le migliori immagini di Dna del mondo sono prodotte nel suo laboratorio. Ma non è lui a scattarle. Lo fa una ricercatrice dal talento straordinario, una donna capace di produrre «fotografie a raggi X tra le più belle mai scattate in qualsiasi campo della ricerca». R.Franklin:: l eroina mancata della scoperta del DNA Un anno prima che Crick e Watson si innamorassero del Dna, Franklin entrava al King's College di Londra, sotto la supervisione di Wilkins. Cominciò a lavorare alla diffrazione a raggi X e rivelò subito abilità e ingegno da fuoriclasse. Fu fra i primi scienziati a usare i raggi X non per studiare cristalli, ma materiali complessi come le molecole biologiche. Franklin modificò i propri macchinari e riuscì a ottenere un fascio estremamente sottile di raggi X. Mostrò che la molecola di fosfato che fa da impalcatura alla struttura doveva essere sul lato esterno del Dna. E che, almeno nella forma «umida», il Dna doveva avere forma elicoidale: una specie di scala a chiocciola. Tuttavia, rigorosa e prudente all'eccesso, decide di non pubblicare nulla prima di avere prove conclusive

20 «photograph 51»: La più recente, perfetta delle immagini di Rosalind Franklin, da un campione purissimo di Dna., l'immagine ancora non pubblicata. Era splendida. Mostrava la forma di un'elica e forniva la dimensione esatta del diametro della molecola Grazie a queste immagini Rosalind Franklin già nel febbraio del 1953, sul suo taccuino di appunti scriveva che...il Dna è composto da due catene distinte..., Degli studi della Franklin per costruire il modello del DNA arrivarono per vie traverse a due scienziati Watson e Crick che negli stessi anni si stavano occupando degli stessi argomenti. Wilkins, un superiore della Franklin, aveva, infatti, mostrato a Crick e Watson nel gennaio 1953 la fotograa 51 del DNA fatta dalla Franklin, senza poter immaginare che da questa informazione i due scienziati sarebbero stati in grado di inferire la struttura del DNA, la X che si otteneva nell immagine era l immagine rivelatrice dell elica. F. Crick e J.D. Watson Nel 1962 per aver descritto e definito la molecola di DNA sono stati insigniti, assieme a Wilkins, del premio Nobel per la medicina

21 SCOPERTA DELLA STRUTTURA A DOPPIA ELICA DEL DNA No April 25, 1953 NATURE MOLECULAR STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid IL 1953 è considerata una tappa fondamentale della biologia in quanto è l anno in cui il fisico e biologo inglese F. Crick (n. 1916) e il biochimico statunitense J.D. Watson (n. 1928) pubblicano l articolo in cui rivelano la sensazionale scoperta della struttura del DNA con caratteristiche biologicamente interessanti. Essa è costituita da due catene polinucleotiche avvolte una attorno all altra attorno all altra in a formare una doppia elica destrorsa. Gli zuccheri e i gruppi fosfato sono rivolti all esterno della doppia elica aformare i montanti, mentre le basi sono impilate una sull altra come i pioli di una scala a chiocciola Le basi dei filamenti opposti sono unite da legami ad idrogeno relativamente deboli. Da un confronto di possibili appaiamenti si resero conto che solo alcuni di questi davano lo stesso valore di larghezza e cioè quello della Adenina con la Timina e della Citosina con la GuaninaIn questo modo la larghezza della coppia A/T era la stessa di quella della coppia G/C. Questo accoppiamento concordava con i dati di Chargaff e permetteva alle basi ci compattarsi molto le une sulle altre. Da quel momento, l'acido desossiribonucleico diveniva per sempre il Dna. Stava per entrare da protagonista nella cultura mondiale, e aprire l'era genomica. Nove anni dopo, nel 1962, il premio Nobel per la fisiologia fu assegnato a Watson, Crick e Wilkins. Rosalind Franklin non c'era. Era morta di tumore alle ovaie: l esposizione ai raggi X, che le permisero di individuare la struttura del DNA, fu causa del cancro che la uccise a soli 37 anni. Nonostante i suoi notevoli apporti alla scoperta delle struttura dell acido nucleico, non le venne riconosciuto nessun merito, nemmeno nel libro di Watson La doppia elica.

22 1955- Francis Crick: dal DNA alle proteine, il dogma centrale La storia del DNA non finisce con la scoperta della sua struttura tridimensionale. Dal momento che il DNA è la molecola ereditaria della cellula, Watson e Crick pensarono che la sequenza dei nucleotidi nella molecola dovesse funzionare come un codice, capace di dirigere la sintesi delle proteine. Tuttavia non si riusciva a capire come il DNA, che si trova nel nucleo delle cellule, possa dirigere la sintesi delle proteine che sono esclusivamente nel citoplasma cellulare. Francis Crick propose il Dogma Centrale in cui si prevedeva che l informazione fluisse dal DNA alla proteina attraverso una molecola trasportatrice. Un candidato a questo ruolo era l acido ribonucleico-l RNA- una molecola che si trova soprattutto nel citoplasma cellulare. Come il DNA, l RNA ha una struttura zucchero-fosfato ma come zucchero usa il ribosio al posto del desossiribosio. DNA e RNA hanno le stesse basi azotate ad eccezione della timina che nell RNA è sostituita dall uracile. L uracile è complementare all adenina. Mentre il DNA ha una struttura normalmente a doppia elica, l RNA ha invece normalmente una struttura a singola elica. Dopo aver proposto il dogma centrale- dove le informazioni fluiscono dal DNA alle proteine- Crick capì che c era un altro problema: come potevano gli amminoacidi interagire con la molecola di RNA trasportatrice? Ci doveva essere una molecola che fungessero da adattatore, almeno venti adattatori, uno per ciascun aminoacido Paul Zamecnik e Mahlon Hoagland:individuazione di una molecola chiave nella traduzione del DNA, l RNA transfer In questi anni sembra che l RNA facente parte del ribosoma sia coinvolto nella sintesi, il suo ruolo non è ancora chiaro.tuttavia, Mahlon Hoagland e Paul Zamecnick identificarono un altra molecola di RNA associata con aminoacidi nel supernatante non incorporati. In particolare Hoagland scoprì che gli aminoacidi, prima di essere incorporati nelle proteine, vengono attivati dall aminoaciltrnasintetasi. Nel 1955 inieme a Paul Zamecnick e Mary Stephensen scoprì che gli aminoacidi, prima di essere trasferiti nella proteina in formazione nei ribosomi, si attaccavano ad un RNA a basso peso molecolare presente nella frazione solubile, chiamarono questo trasportatore intermediario RNA solubile. Visitando il nostro laboratorio, Jim Watson constatò che le caratteristiche del nostro DNA solubile corrispondevano a quelle della molecola adattatore di Crick. Ciascun RNA solubile poteva al suo aminoacido partner e trasportarlo fino al ribosoma per la sintesi delle proteine. L RNA solubile venne poi ribattezzato RNA transfer (trna), nome che riflette meglio la sua funzione. Ma ancora non si capiva come il codice genetico istruisse il trna citoplasmatico a gli aminoacidi a fare proteine

23 1961- Sydney Brenner: l RNA messaggero Sydney Brenner, insieme a Francois Jacob e Matthew Meselson, dimostrò che l rrna non è lo stampo per sintetizzare proteine. Ci doveva essere un terzo tipo di RNA-un intermediario instabile- il trasportatore del messaggio ai ribosomi. Usarono batteri infettati da fagi. infettarono questa coltura batterica con il fago e immediatamente trasferirono i batteri infettati in un terreno contenente 32 P radioattivo. Interruppero la crescita del fago e quindi lisarono i batteri, in seguito estrassero RNA e ribosomi dai batteri. Centrifugarono su gradiente di densità l estratto batterico, si separarono i vari componenti e Brenner potè analizzare la distribuzione degli isotopi pesanti e leggeri nei ribosomi batterici, e l incorporazione di 32 P nell RNA fagico neoformato. Brenner pensò che se l rrna nei ribosomi fosse lo stampo per costruire nuove proteine fagiche, allora dovrebbero comparire nuovi ribosomi con rrna fagico dopo l infezione. Come sospettò, questo non accadde. Tutti i ribosomi avevano isotopi pesanti. Cercò dopo dove fosse stato incorporato 32 P durante la produzione di nuovo RNA fagico. Brenner trovò che 32 P era associato con la banda corrispondente ai ribosomi interi e c era anche 32 P sul fondo del tubo. Saltò fuori che questo fosse un nuovo tipo di RNA. Era associato ai ribosomi e quindi doveva avere un ruolo nella sintesi delle proteine. Doveva essere tuttavia una grande molecola dal momento che parte di esso si trova nel sedimento sul fondo del tubo. Era questo il trasportatore dell informazione previsto da Crick nel suo Dogma Centrale, Brenner chiamò questa molecola RNA messaggero (mrna) VERSO UN MODELLO DELLA REPLICAZIONE DEL DNA Nel lavoro Watson e Crick conclusero dicendo : non ci è sfuggito che l appaiamento specifico delle basi suggerisce immediatamente un possibile meccanismo di replicazione del materiale genetico. Cioè srotolando le due eliche di DNA ognuna di esse potesse fungere da stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare di DNA: modello di replicazione venne detto semiconservativo. A quei tempi però venivano proposti altri due modelli: il modello conservativo secondo cui le eliche parentali si riassociano, originandosi una molecola interamente parentale e una interamente di nuova sintesi. il modello dispersivo in cui le molecole di DNA venivano tagliati in segmenti a doppia elica che fungevano da stampo per la sintesi di nuovi segmenti che si riassociano.

24 Meselson e Stahl: Cinque anni dopo la pubblicazione del lavoro di Watson e Crick ottennero la evidenza sperimentale che il modello semiconsrvativo era il modello di replicazione del DNA corretto. Usarono il batterio Escherichia coli che venne fatto crescere su un terreno contenente 15 N pesante, come isultato tutti i composti delle cellule contenenti N, incluse le basi azotate, contenevano 15 N anzicchè 14 N leggero.successivamente i batteri venivano fatti replicare in un terreno contenente azoto della normale forma. La densità veniva rilevata attraverso centrifugazione in gradiente di densità Dopo una generazione di crescita in terreno 14 N, tutto il Dna aveva una densità esattamente intermedia fra quella di DNA completamente 15 N e quello completamente 14 N. Dopo due generazioni, metà del Dna era ancora di densità media, e metà era di densità del DNA contenente solo 14 N. La decifrazione del codice genetico Il problema successivo divenne quello della traduzione Come si passa da una sequenza di nucleotidi alla sequenza di aminoacidi di una proteina, come faceva la successione delle basi azotate a determinare la sequenza degli amminoacidi di una proteina? La formula di un aminoacido è H2N-CHR-COOH, esistono 20 aa ciascuno con un diverso gruppo R. Numero di nucleotidi che specificano un aminoacido sono 4 basi azotate (A,T,C,G) e 20 aminoacidi. Un codice di due nucleotidi genererebbe solo 16 (42) parole diverse. Un codice a triplette porta alla formazione di 64 (43) parole, più di una tripletta deve specificare per una dato aminoacido (il codice è degenerato) dato che gli aminoacidi sono 20

25 1959 Arthur Kornberg e collaboratori isolano la molecola che copia il DNA, si tratta di un enzima che viene denominato DNA polimerasi. EVIDENZE SPERIMENTALI PER IL MODELLO DI CODICE GENETICO A TRIPLETTE Francis Crick, L.Barnett, S. Brenner e R.W. Tobin primi anni 60 Esperimenti di genetica effettuati sul batteriofago T4 con l utilizzo di mutanti rii che davano placche di lisi chiare su E. coli B e non erano in grado di riprodursi in E. coli K12, al contrario dei ceppi selvatici r +. FAGO rii mutante per trattamento con proflavina che induce mutazioni causando l aggiunta o la delezione di una coppia di basi nel DNA. Selvatico r +. Mutazione per delezione Reversione della mutazione per inserzione ACGACGACGACGACGA TGCTGCTGCTGCTGCT ACGACGACGACGACGA TGCTGCTGCTGCTGCT ACGACGACGGACGACGA TGCTGCTGCCTGCTGCT Isolarono, piastrando su E. coli K12, dei ceppi r+ revertenti da una mutazione attraverso una mutazione di segno opposto Inoltre la combinazione di tre mutazioni per delzione o tre mutazioni per inserzione vicine dava revertenti r+: la conclusione fu pertanto che il codice genetico è a triplette.

26 1961 Marshall Niremberg e Johann Heinric MatthaeiIl hanno decifrato il codice genetico attraverso sistemi di sintesi proteica in vitro Si sintetizavano mrna contenenti uno, due, o tre diverse basi e nell aggiunta a sistemi di sintesi proteica cell-free, si analizzavano i polipeptidi prodotti. Ad esempio si sintetizzava un mrna di poly U per cercare la corrispondenza con uno tra i venti amminoacidi. una sequenza di tre uracili UUU deve codificare per la fenilalanina. Avevano determinato uno delle 64 triplette codone! Insieme a Matthaei, Niremberg provò altre catene polinucleotidiche. Il Poli-C faceva una catena di prolina (PRO); il Poli-A faceva una catena di lisina (LYS). Il codice genetico è degenerato. Decifrazione del codice genetico 1975-Roger Kornberg:la struttura della cromatina Isolarono da cellule di fegato di topo l enzima DNA nucleasi micrococcica che digerisce preferenzialmente il DNA non associato a proteine e lo usarono per digerire la cromatina. Poi sottoposero ad elettroforesi il materiale cromatinico digerito e videro sul gel una serie di bande regolari Scoprirono che le bande erano multipli della grandezza del frammento più piccolo, che risultò essere di 200 bp. Così queste bande ripetute corrispondevano a 200 bp, 400 bp, 600 bp e così via. Conclusero che gli istoni sono distribuiti in modo regolare nel DNA e, nel punto dove si legano, proteggono il DNA dalla digestione della nucleasi. Poi individualmente purificarono gli istoni dal DNA. Trovarono che H2A e H2B tendono a stare uniti, come anche H3 e H4. Se mischiavano il complesso H2A/H2B con il complesso H3/H4, e poi aggiungevano DNA nudo, ottenevano lo stasso modello della cromatina ai raggi X. Successive analisi rivelavano che ciascun nucleo istonico aveva otto proteine- due copie di ciascun complesso di istoni H2A/H2B e H3/H4. Questo nucleo istonico con il DNA avvolto viene chiamato nucleosoma. l istone H1 non è parte del nucleo istonico. Invece, si attacca tra i nucleosomi e consente l organizzazione della cromatina in livelli di compattamento superiori, è detto infatti istone linker.

27 1962- Roy Britten: il DNA ripetitivo Studiando le curve di riassociazione del DNA precedentemente scaldato deduce che il DNA contiene molte sequenze ripetitive, queste sequenze sono così simili che si riassociano molto facilmente,. Il DNA altamente ripetitivo contiene soprattutto cortissime ripetizioni in tandem. I due gruppi maggiori sono classificati per grandezza: Corti Elementi Interdispersi (SINEs) sono lunghi diversi centinaia di nucleotidi i Lunghi Elementi Interdispersi (LINEs) sono lunghi diverse migliaia di nucleotidi Entrambi i gruppi derivano da trasposoni, i cosiddetti geni-saltellanti che si sono accumulati durante il tempo spostandosi in nuovi cromosomi. 1977F. Ranger, A. Maxam e W. Gilbert Mettono a punto una tecnica che usa specifici reagenti chimici per modificare e tagliare la catena di DNA a livello di nucleotidi specificiconsente di sequenziare il DNA 1978-Frederick Sanger: il sequenziamento del DNA Sanger sviluppò un metodo per determinare l esatta sequenza di nucleotidi in un gene. circa allo stesso tempo Alan Maxxam e Walter Gilbert svilupparono un metodo per il sequenziamento differente. Il metodo di Sanger della terminazione della catena utilizza dei particolari didesossinucleotidi (didntp) A,T,C o G in quattro diverse provette dove viene fatta avvenire la sintesi enzimatica di una nuova catena di DNA da un DNA stampo. L aggiunta di quattro didntp ferma l allungamento della catena in tutte le possibili posizioni. La lettura del gel permette di risalire all intera sequenza nucleotidica 1980-Kary Mullis:la reazione polimerasica a catena (PCR) che ha rivoluzionato il modo in cui i geni possono essere analizzati. E questo un metodo per prodirre in un numero estremamente di copie di una specifica sequenza di DNA, mediante un meccanismo di amplificazione. 2000: Progetto genoma umano L idea di sequenziare l intero genoma umano è di un fisico del Department of Energy americano, Charles DeLisi, e viene proposta alla comunità scientifica internazionale da Reanto Dulbecconel marzo del Ma non tutti erano d accordo Vale la pena spendere miliardi di dollari e tenere impegnati per anni i migliori ricercatori, in quella che è in fondo solo una gigantesca analisi chimica?. Nonostante le discussioni il consenso cresce negli anni e inizia nel 1990 con l stituzione della Human Genome Organization con l obieetivo di terminare nel 2005, ma nel marzo del 1998 la società privata Celera Genomics annuncia che lo terminerà nel Inizia così una vera e propria gara. Il 26 giugno 2000, in una solenne cerimonia alla casa bianca le due squadre rivali annunciano di aver completato il lavoro Il 13 Febbraio 2001 la mappa del genoma è pubblicata, gratis dal consorzio pubblico, a pagamento dalla celera Genomics. Notizie ANSA 12 Febbraio :03 Il Genoma non è più un segreto 13:52 Genoma: è su Internet l'alfabeto della vita Rappresenta un ampio sforzo per mappare tutti i geni umani e per ottenere la sequenza completa dei 3 miliardi di coppie nucleotidiche del genoma umano. E la lettura del lunghissimo libretto delle istruzioni contenuto all interno della molecola del DNA è stata compiuta da due gruppi di ricercatori in gara: il National Institutes of Health americano guidato da Francis Collins e il Celera Genomics di Rockville capeggiato da Craig Venter. Le loro analisi pubblicate riempiono qualcosa come pagine di una rivista. Con grande sorpresa i geni umani invece dei sono poco più di 30000, solo il doppio di quelli del moscerino e non più di 300 di quelli del topo geni bastano per dar vita a una complessità impressionante!!!

28 Il genoma è stato letto...adesso bisogna decifrarlo L interpretazione della lunga sequenza del DNA ha molte applicazioni, fra cui la comprensione di come funziona e di come si ammala il corpo umano e offre la possibilità di fare diagnosi di malattie genetiche e di tumori. L idea che il cancro sia una malattia legata a mutazioni a livello di cellule somatiche è nata prima della scoperta della doppia elica del DNA. Questa teoria ha il suo punto d inizio nei primi anni del XX secolo in seguito a una serie di osservazioni effettuate dall embriologo Teodoro Boveri che mostravano la presenza di un numero abnorme di cromosomi in cellule somatiche cancerose. La scoperta poi della struttura del DNA ha dato un impulso fondamentale allo studio delle basi genetiche del cancro. I ricercatori sono tutt oggi impegnati nella ricerca dei geni che sono implicati nelle origine di malattie, confrontando il DNA di persone malate con quello di persone sane.si affidano ai cosiddetti SNP(snip), diverse combinazioni da individui ad individui per scoprire quali ono comuni alle persone colpite dalla malattia. La prospettiva è quella di permettere, tramite un esame genetico i rischi che corre quella persona