CRD nell allergia al veleno di imenotteri: marcatori primari di sensibilizzazione ape/vespa (Rassegna)

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1 CRD nell allergia al veleno di imenotteri: marcatori primari di sensibilizzazione ape/vespa (Rassegna) Valerio Pravettoni, Laura Primavesi Unità Operativa Complessa di Allergologia e Immunologia Clinica, Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milano PRINCIPALI INSETTI PUNGITORI Gli insetti aculeati principalmente coinvolti in reazioni allergiche appartengono al numerosissimo ordine degli Imenotteri (dal greco ymèn, membrana, e pteròn, ala) al cui interno sono presenti diverse superfamiglie e famiglie. Tra esse le famiglie degli Apidi e dei Vespidi sono le più importanti in Europa 1,2 (Fig. 1). Tra gli Apidi la specie più studiata è sicuramente quella delle api (Apis mellifera), che vivono in colonie socialmente organizzate e rappresentano insieme ai bombi i principali insetti impollinatori. Morfologicamente l ape e il bombo sono simili: entrambi pelosi con striature tendenti al marrone. I bombi però sono generalmente più grossi e pelosi, con bande di colore più larghe di cui una distintiva di colore più chiaro sull addome. Caratteristica peculiare dell ape è quella di avere un pungiglione seghettato che si infigge nella carne della vittima portando alla morte per eviscerazione l ape che, allontanandosi, lascia pungiglione e vescicola velenifera. Tale sacrificio porta però anche alla liberazione di un ferormone di allarme che richiama altre api. Il bombo, al contrario, presenta un pungiglione liscio come quello dei Vespidi, pertanto la puntura non porta l insetto a morte. All interno della superfamiglia dei Vespidi si distinguono principalmente la famiglia dei Vespini e quella dei Polistini, che morfologicamente si differenziano per l aspetto del torace e dell addome e per la diversa giunzione tra le due parti. Tali distinzioni sono utili per l identificazione dell insetto pungitore, anche se la pratica ambulatoriale insegna che molto spesso la vittima di un attacco, specie se con conseguenze serie, difficilmente ricorda l aspetto dell insetto. La diagnosi più spesso si avvale di altre informazioni, che distinguono i diversi insetti, e che il paziente può ricordare più facilmente (distacco del pungiglione, luogo e ora dell attacco, numero delle punture, posizione del nido, etc.). ALLERGENI PRESENTI NEL VELENO DI IMENOTTERI I componenti del veleno degli Imenotteri in grado di indurre una reazione allergica sono generalmente glicoproteine aventi peso molecolare compreso tra 10 e 50 kda 3. Molti di questi allergeni sono noti e sequenziati da tempo, alcuni sono già presenti in forma ricombinante. La Tabella 1 mostra i principali allergeni per alcuni dei più comuni Imenotteri. È possibile notare come proteine omologhe siano presenti in veleni di specie diverse. Gli allergeni principali del veleno di ape sono la fosfolipasi A 2 (Api m 1), isolata ed identificata anche nel bombo (Bom p 1, Bom t 1), la ialuronidasi e la fosfatasi acida. La fosfolipasi A 2 possiede una struttura pressoché identica tra api di diverse specie, mentre tra i bombi esiste una variabilità maggiore. Gli omologhi dei due insetti presentano un identità di sequenza del 53%, sono pertanto possibili e frequenti casi di sensibilizzazione ad entrambe 4,5. Gli allergeni maggiori dei Vespidi sono: la fosfolipasi A 1 ; la ialuronidasi, che presenta circa il 50% d identità di sequenza con il suo omologo degli Apidi 1 ; l antigene 5, che è presente nel veleno di tutti i Vespidi. Generalmente i fenomeni di cross-reattività tra Vespa, Vespula e Dolichovespula sono molto frequenti, mentre è minore la cross-reattività tra Polistini e Vespini. Tra i Polistini la Figura 1 Schema tassonomico semplificato degli Imenotteri di maggiore rilevanza allergologica. 34 LigandAssay 15 (1) 2010

2 Tabella 1 Allergeni presenti nel veleno di alcuni Imenotteri, secondo la classificazione IUIS (International Union of Immunological Societies - Allergen Nomenclature Sub-Committee, Insetto pungitore Allergene Nome Biochimico Peso molecolare (kda) in SDS-PAGE Apis mellifera Polistes spp. Vespula spp. Vespa crabro Api m 1 Fosfolipasi A 2 16 Api m 2 Ialuronidasi 39 Api m 3 Fosfatasi acida 43 Api m 4 Mellitina 3 Api m 5 Dipeptil-peptidasi IV 100 Api m 6 "-" 8 Api m 7 CUB serin proteasi 39 Api m 8 Carbossilesterasi 70 Api m 9 Serin-carbossipeptidasi 60 Api m 10 Icarapina variante Pol a 1 Pol d 1 Fosfolipasi A 1 34 Pol a 1 Ialuronidasi 38 Pol d 4 Serin proteasi 33 Pol a 5 Pol d 5 Antigene 5 23 Ves v 1 Fosfolipasi A 1 34 Ves v 2 Ialuronidasi 38 Ves v 3 Dipeptil-peptidasi IV 100 Ves v 5 Ves g 5 Antigene 5 23 Vesp c 1 Fosfolipasi A1 34 Vesp c5 Antigene 5 23 cross-reattività è frequente per le diverse specie europee, mentre è minore tra queste ultime e le specie americane 2. DIAGNOSI La prima parte della diagnosi prevede la raccolta dell anamnesi, al duplice scopo di cercare di identificare l insetto responsabile e di valutare la gravità dei sintomi. Il medico dovrà cercare di inquadrare il più possibile la reazione allergica, ad esempio indagando l orario, le condizioni climatiche, il numero di punture, il tempo d insorgenza dei sintomi, l eventuale trattamento farmacologico adottato, la presenza di altre allergopatie, l anamnesi di precedenti punture, ecc. La sintomatologia più frequentemente riportata è la reazione locale estesa, mentre le reazioni sistemiche coinvolgono fino al 5% della popolazione europea e del nord America 6. Le prime sono definite come gonfiore loco regionale maggiore di 10 cm di diametro che insorge poco dopo la puntura. Le reazioni sistemiche prevedono il coinvolgimento dei diversi organi bersaglio dell anafilassi, quali la cute e le mucose, il sistema gastrointestinale, respiratorio, cardiovascolare. Nel corso degli anni sono state proposte diverse classificazioni, in funzione della gravità dei sintomi; la più utilizzata resta comunque quella di Mueller 7 (Tab. 2). Parallelamente all indagine anamnestica sono di notevole utilità anche alcuni test diagnostici, in particolare test cutanei e test in vitro, che devono essere eseguiti ad almeno due - tre settimane di distanza dalla puntura, per evitare esiti falsamente negativi (periodo refrattario). Tali test generalmente possono essere dirimenti quando l insetto pungitore non è ben identificato dal paziente ed essere dunque decisivi nella scelta del veleno con cui condurre un eventuale immunoterapia specifica. I test cutanei d elezione sono quelli intradermici, molto più sensibili dei prick test anche a basse concentrazioni. Tabella 2 Classificazione delle reazioni sistemiche a veleno di Imenotteri secondo Mueller. (Da Rif. 4) Grado I II III IV Sintomi orticaria generalizzata, malessere, ansia i sintomi precedenti più angioedema, nausea, vomito, diarrea, addominalgia, vertigine, costrizione toracica i sintomi precedenti più dispnea, stridore raucedine e sibilo da edema laringeo, disartria, astenia, confusione mentale, sensazione di morte imminente i sintomi precedenti più ipotensione o shock con perdita di coscienza, incontinenza sfinterica, cianosi LigandAssay 15 (1)

3 FENOMENI DI CROSS-REATTIVITA E SENSIBILIZZAZIONE MULTIPLA Una percentuale molto elevata, fino al 50%, di pazienti con allergia ad Imenotteri presenta test positivi sia per ape sia per vespa 6,8. Tale fenomeno può essere indicativo di una doppia sensibilizzazione, che tuttavia appare realistica solo in pochi casi. Altre possibili spiegazioni possono essere una cross-reattività dovuta ad omologie di sequenza tra allergeni di veleni diversi, ma, soprattutto, la presenza di catene laterali oligosaccaridiche legate a residui di asparagina definite Cross-reactive Carbohydrate Determinants (CCD). I CCD sono ubiquitari, si ritrovano nei pollini, negli alimenti ed anche nel veleno di imenotteri e sono in grado di legare le IgE mediante almeno due siti di legame. Circa il 5% di soggetti non allergici possiede IgE anti-ccd, mentre tale percentuale sale al 10-15% in soggetti allergici al polline di graminacee e fino al 60% in pazienti con multiple pollinosi. Circa un paziente su quattro con allergia al veleno di ape e circa uno su dieci con allergia al veleno di vespula presenta valori positivi di IgE anti-ccd 6. Inoltre alcuni allergeni contenuti nel veleno degli Imenotteri, quali la ialuronidasi e la fosfolipasi A 2, sono glicosilati. In particolare gli N-glicani della ialuronidasi sono stati caratterizzati mediante cromatografia HPLC/spettrometria di massa, evidenziando al loro interno un core α-1,3 fucosio, che rappresenta la struttura chiave responsabile dell allergenicità 9. Può dunque essere utile dosare le IgE specifiche verso allergeni contenti CCD, come ad esempio l estratto intero di polline di codolina (Phleum pratense), di lattice, oppure l epitopo glicosilato MUXF3 della bromelina. Tuttavia una positività ai CCD non può di per sé escludere una doppia sensibilizzazione, in quanto alcuni pazienti possono possedere sia IgE contro tali molecole sia verso gli epitopi proteici allergenici specifici di un dato veleno 6. Allo stesso modo test negativi per i CCD non confermano la doppia sensibilizzazione, in quanto pazienti con bassi valori di IgE anti-ccd presentano un dosaggio delle IgE negativo per la bromelina 9. Per individuare quale veleno abbia rilevanza clinica e pertanto sia quello da utilizzare per l immunoterapia specifica, la metodica di maggiore utilizzo è la RAST inibizione, cioè il dosaggio delle IgE specifiche per un dato veleno dopo preincubazione del siero con concentrazioni scalari dei diversi veleni che hanno dato una positività in vitro, con conseguente inibizione del legame antigene-anticorpo 10. Si ottengono così delle curve di inibizione che sono funzione della concentrazione del veleno inibente. Generalmente, valori di inibizione superiori al 70% vengono considerati indicativi di una cross-reattività marcata, mentre valori inferiori al 25% escludono fenomeni di cross-reattività 6. Questo test comunque non può risolvere tutti i dubbi ed inoltre scarsamente si adatta alla routine ambulatoriale in quanto è costoso, laborioso e necessita di personale qualificato per la metodica e la refertazione. COMPONENT RESOLVED DIAGNOSIS Attualmente, i metodi classici di diagnosi allergologica utilizzano estratti naturali interi di veleno purificato, contenenti una miscela standardizzata a 100 μg/ml di componenti allergeniche. L impiego di singoli allergeni ricombinanti, seppure con una sensibilità a volte inferiore, consente una specificità più elevata. Molti studi hanno infatti rilevato come tali molecole abbiano una maggiore capacità di evidenziare sensibilità specifiche rispetto agli allergeni naturali purificati, che in ogni caso contengono impurità più o meno consistenti di altri allergeni 11. La Component-Resolved Diagnosis (CRD) valuta la positività anticorpale a singoli marcatori molecolari, consentendo una diagnosi altamente specifica e la definizione per ciascun paziente di un profilo di reattività individuale, distinguendo le molecole del singolo veleno realmente coinvolte nella reazione allergica da quelle cross-reattive. Al momento vari sono gli allergeni ottenuti in forma ricombinante (Tab. 3), espressi in differenti organismi (E. Tabella 3 Allergeni ricombinanti di Imenotteri. (Da Rif. 11 e 12) Specie Allergene Vettore di espressione Apis mellifera Vespula vulgaris D. maculata Api m 1 ** Api m 2 Api m 3 Ves v 1 * Ves v 2 Ves v 5 * Dol m 1 Dol m 2 Dol m 5 / cellule infettate da Baculovirus cellule infettate da Baculovirus /lievito Polistes annularis Pol a 5 / cellule infettate da Baculovirus P. dominulus Pol d 5 * procariota Solenopsis invicta Sol i 2 eucariota **disponibile in commercio anche la molecola naturale glicosilata * disponibile in commercio per diagnostica Sol i 3 eucariota 36 LigandAssay 15 (1) 2010

4 coli, cellule infettate da Baculovirus, etc.) 11,12. Studi comparativi sull attività allergenica delle singole molecole naturali e ricombinanti hanno evidenziato come in alcuni casi il vettore di espressione abbia un ruolo decisivo. Ad esempio la fosfolipasi di ape (PLA 2 ) espressa in è deglicosilata; un recente studio ha dimostrato come le cutireazioni eseguite con npla 2, rpla 2 e npla 2 deglicosilata diano risultati assolutamente comparabili. In questo caso la glicosilazione, modifica post-trasduzionale della proteina non supportata da, ha poca importanza nel legame con le IgE. Al contrario, per la ialuronidasi di ape (HYA) è stata necessaria l espressione in un altro vettore (cellule infettate da Baculovirus), affinchè avvenissero le corrette modifiche post-trasduzionali in quanto la molecola rhya espressa in, non glicosilata, possedeva un attività allergenica molto inferiore (30%) rispetto al corrispettivo naturale purificato 13. La possibilità di avere singole componenti allergeniche pertanto comporta notevoli vantaggi, tra cui quello di attuare un accurata scelta del veleno da utilizzare per l immunoterapia specifica nei casi dubbi con doppia sensibilizzazione ape/vespa. Più che indagare molteplici allergeni è utile testare molecole che rappresentino dei marcatori di sensibilizzazione per uno specifico veleno. Tali molecole dovranno dunque rispondere ad alcuni requisiti, soprattutto essere allergeni maggiori e specie-specifici, dunque strutturalmente poco simili ad altri allergeni di veleni diversi. Per quanto riguarda i marcatori primari di sensibilizzazione ape/vespa, la HYA è stata a lungo considerata un allergene maggiore dell ape e della vespa, responsabile di molte doppie positività, in quanto tra i due allergeni omologhi esiste il 50% di identità di sequenza. Uno studio recentissimo 9 ha tuttavia evidenziato come il legame tra HYA e IgE specifiche sia in realtà dovuto ai CCD, indagando la reale positività a tale allergene in soggetti allergici unicamente al veleno di Vespula (Yellow yacket, YJ) oppure aventi una doppia positività in vitro per ape e Vespula. Tra i soggetti monosensibilizzati alla Vespula (n = 31) solo un paziente ha legato YJ-HYA, a differenza dei pazienti con doppia positività (n = 105), nei quali il legame con YJ-HYA si è verificato nell 87% dei casi. Le inibizioni condotte nello studio (n = 83) hanno inoltre evidenziato che il 65% dei pazienti reagiva a YJ-HYA a seguito di legami con i CCD, il 27% marcava sia i CCD sia gli epitopi peptici di YJ-HYA e solamente l 8% reagiva unicamente al peptide YJ-HYA. Tale studio, fortemente innovativo, ha dunque rimodellato la funzione di YJ-HYA nell allergia alla Vespula, stabilendo come tale allergene possa essere considerato un allergene minore, in quanto riconosciuto solo dal 10-15% dei soggetti allergici. Al contrario l antigene 5 (Ves v 5) e la fosfolipasi A1 (Ves v 1) sono stati riconosciuti da circa il 90% dei pazienti di entrambi i gruppi, ed insieme hanno identificato il 97% dei pazienti realmente sensibili a YJ. Jin e coll. concludono affermando che la CRD svolta con l antigene 5 (Ves v 5) e la fosfolipasi A1 (Ves v 1) è virtualmente in grado di identificare i pazienti allergici al veleno di Vespula. Un altro recente studio 14 ha ribadito l importanza dell allergene Ves v 5, come marcatore specie-specifico nell allergia al veleno di vespula. Tale allergene è stato infatti riconosciuto dall 87% dei pazienti allergici al veleno di vespula e solo dal 17% dei soggetti allergici all ape. Gli Autori hanno anche indagato la positività a rapi m 1 non glicosilata, evidenziando come tale allergene sia riconosciuto dal 97% dei soggetti allergici all ape e solo dal 17% dei soggetti allergici alla vespula. Pertanto, rapi m 1 può essere considerato marcatore primario di allergia al veleno di ape. La possibilità di poter indagare la positività alla fosfolipasi A 2 non glicosilata ha consentito di ovviare al problema della positività in vitro dovuta ai CCD. Attualmente in commercio è disponibile anche la fosfolipasi A 2 naturale glicosilata (napi m 1); la determinazione del titolo di IgE specifiche verso entrambe le forme di tale allergene è di sicuro aiuto nella valutazione di un legame anticorpale verso la componente peptidica rispetto alla componente glicosilata (CCD). Il gruppo di Müller ha inoltre evidenziato che una doppia positività ape/vespula in vitro accade più frequentemente nei soggetti allergici all ape rispetto ai soggetti sensibilizzati alla vespula; probabilmente a causa della maggior glicosilazione degli Figura 2 Component-Resolved Diagnosis: approccio diagnostico per l identificazione dell insetto responsabile. LigandAssay 15 (1)

5 allergeni maggiori dell ape (fosfolipasi A 2, ialuronidasi, fosfatasi acida). Nonostante lo studio partisse da due popolazioni (n = 100) selezionate di soggetti allergici all ape o alla vespula, numerose doppie positività sono state comunque riscontrate, di cui il 56% dovute ai CCD. Gli Autori concludono che una doppia positività in vitro per Api m1 e Ves v5 indica una reale doppia sensibilizzazione clinica e, pertanto, la necessità di una immunoterapia specifica con entrambi i veleni. Per distinguere una sensibilizzazione a polistini piuttosto che a vespule, è necessario ricordare come gli allergeni maggiori di questi due veleni sono, seppur omologhi, notevolmente distanti a livello filogenetico 15. Sembra possibile dunque stabilire la reale sensibilizzazione dosando le IgE specifiche verso l antigene 5 dei due veleni: Ves v 5 e Pol d 5. In conclusione, la CRD applicata alla diagnostica allergologica per veleno di Imenotteri sembra virtualmente in grado di risolvere in modo rapido ed efficace tutti quei casi di multipla sensibilizzazione (Fig. 2): l allergene non glicosilato rapi m 1, riconosciuto dal 97% dei soggetti allergici all ape e dal 17% degli allergici alla Vespula, è il marcatore specie-specifico ideale per l allergia al veleno di ape; gli allergeni Ves v 1 e Ves v 5, identificati dal 97% dei soggetti allergici alla Vespula, sono i marcatori primari dell allergia alla vespula; la determinazione delle IgE specifiche per allergeni contenti N-glicani, quali la bromelina, MUXF3 (epitopo glicosilato della bromelina) oppure napi m 1, identifica la presenza di anticorpi per i CCD, responsabili di circa il 50% delle doppie positività in vitro per ape e Vespula. BIBLIOGRAFIA 1. Biló BM, Rueff F, Mosbech H, et al. Diagnosis of Hymenoptera venom allergy. Allergy 2005; 60: Fernández J. Distribution of vespid in Europe. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2004; 4: King TP, Spangfort MD. Structure and biology of stinging insect venom allergens. Int Arch Allergy Immunol 2000; 123: Stapel SO, Waanders-Lijster de Raadt J, van Toorenenbergen AW, et al. Allergy to bumblebee venom. II. IgE cross-reactivity between bumblebee and honeybee venom. Allergy. 1998; 53: de Groot H. Allergy to bumblebees. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2006; 6: Jappe U, Raulf-Heimsoth M, Hoffmann M, et al. In vitro hymenoptera venom allergy diagnosis: improved by screening for cross-reactive carbohydrate determinants and reciprocal inhibition. Allergy 2006; 61: Mueller HL. Diagnosis and treatment of insect sensitivity. J Asthma Res 1966; 3: Hemmer W, Focke M, Kolarich D, et al. Antibody binding to venom carbohydrates is a frequent cause for double positivity to honeybee and yellow jacket venom in patients with stinging-insect allergy. J Allergy Clin Immunol 2001; 108: Jin C, Focke M, Léonard R, et al. Reassessing the role of hyaluronidase in yellow jacket venom allergy. J Allergy Clin Immunol 2010; 125: Hamilton RG, Adkinson NF. 23. Clinical laboratory assessment of IgE-dependent hypersensitivity. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: S Müller UR. New developments in the diagnosis and treatment of hymenoptera venom allergy. Int Arch Allergy Immunol 2001; 124: Müller UR. Recent developments and future strategies for immunotherapy of insect allergy. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003; 3: Müller UR. Recombinant Hymenoptera venom allergens. Allergy 2002; 57: Müller UR, Johansen N, Petersen AB, et al. Hymenoptera venom allergy: analysis of double positivity to honey bee and Vespula venom by estimation of IgE antibodies to species-specific major allergens APi m 1 and Ves v 5. Allergy 2009; 64: Hoffmann DR. Hymenoptera venom allergens. Clin Rev Allergy Immunol 2006; 30: Per corrispondenza: Dott. Valerio Pravettoni UOC di Allergologia e Immunologia Clinica Fondazione IRCCS Ca Granda Ospedale Maggiore Policlinico Via Pace Milano Tel.: Fax: v.pravettoni@policlinico.mi.it 38 LigandAssay 15 (1) 2010