Applicazione dei batteri lattici nella produzione della birra non convenzionale A CURA DI NICOLA COPPE

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1 Sommario Ceppi selezionati per l esperimento... 2 Applicazione dei batteri lattici nella produzione della birra non convenzionale A CURA DI NICOLA COPPE Windows8 [Titolo del corso] [Data]

2 Premessa... 2 CEPPI UTILIZZATI... 2 Sensibilità al luppolo... 2 Il perchè della scelta di ceppi sensibili al luppolo... 2 Lactobacilli e pediococchi... 3 MOSTO NON LUPPOLATO... 3 L.plantarum TH Pediococcus pentosaceus TH967 +TH968 (miscela di due ceppi)... 4 MOSTO LUPPOLATO... 5 Controllo... 5 L. fermentum LB13 +LF CONCLUSIONI... 6 S.cerevisiae (lievito). Attività acidificante in mosto di birra non luppolato... 7 Valutazione dell attività acidificante in mosto di birra... 8 Valutazione dell attività inibente del luppolo... 8 Metodi e strumenti... 9 Risultati... 9 Birrificazione con L.plantarum... 9 Metodo di produzione... 9 Dati principali... 9 Ingredienti Inoculo fermenti Bollitura Fermentazione FLOW SHEET PRODUZIONE dati DI PRODUZIONE Analisi del rischio di contaminazione del birrificio Premessa Analisi del rischio Valutazione morte cellulare dei LAB Vantaggi e svantaggi del metodo sour-wort rispetto ad altri metodi di acidificazione (spontanea, sour mash, con starter in fermentazione) PAGINA 1 DI 14

3 CEPPI SELEZIONATI PER L ESPERIMENTO Premessa I ceppi microbici testati in questo studio sono ceppi di batteri lattici, già disponibili liofilizzati e forniti da Bioagro srl.di Thiene, società partecipata dell Azienda Regionale Veneto Agricoltura. Questi microrganismi sono stati isolati e caratterizzati dal Laboratorio di Biotecnologie di Veneto Agricoltura e trovano attualmente applicazione in diversi settori dell industria alimentare. Lo studio, ha come obiettivo la possibile applicazione di questi microrganismi nella produzione di birra dato il grande interesse per la produzione di birre non convenzionali da parte di molti microbirrifici del territorio nazionale. CEPPI UTILIZZATI Lactobacillus.plantarum TH 508 Lactobacillus sanfranciscensis TH 933 Lactobacillus rossiae TH 926 Leuconostoc citreum TH 931 Pediococcus pentosaceus TH967 Pediococcus pentosaceus TH968 Lactobacillus fermentum LB13 Tutti i ceppi appartengono a specie riconosciute sicure dall Agenzia Europea di Sicurezza Alimentare. (EFSA) SENSIBILITÀ AL LUPPOLO Un paramentro molto importante per la selezione dei ceppi si è dimostrata la sensibilità al luppolo, infatti sono già ben note in letteratura le diverse capacità di resistenza delle diverse specie di batteri lattici. I ceppi selezionati per lo studio risultano sensibili al luppolo, come evidenziato da test di crescita effettuati in presenza di luppolo. Il perchè della scelta di ceppi sensibili al luppolo Sono stati scelti solamente ceppi sensibili al luppolo, questo è un aspetto molto frequente dei batteri lattici, con alcune eccezioni come Lactobacillus brevis e Pediococcus damnosus che risultano le due specie più resistenti. La scelta è stata fatta per dare maggiore sicurezza al processo produttivo ed evitare PAGINA 2 DI 14

4 contaminazioni crociate indesiderate con altre birre prodotte nella stessa struttura. Infatti, anche una piccolo quantità di luppolo è in grado di inibire totalmente l avvio della fermentazione lattica. Lactobacilli e pediococchi Il genere Lactobacillus è quello più grande compreso dai batteri lattici ed include numerose specie. In contrasto con quello che si crede e cioè che tutti I lactobacilli possano crescere nella birra, solamente poche specie sono in grado di farlo. (Sakamoto 2003). Il genere Pediococcus comprende diverse specie di batteri lattici alcune della quali posono svilupparsi e talora dare difetti nelle birre (P.damnosus). Di seguito sono riportate le curve di acidificazione dei ceppi L. plantarum TH508 e P. pentosaceus TH967 e TH968 inoculati in mosto di birra non luppolato e mosto di birra luppolato.. MOSTO NON LUPPOLATO L.plantarum TH 508 PAGINA 3 DI 14

5 Pediococcus pentosaceus TH967 +TH968 (miscela di due ceppi) 12h 24h 36h PAGINA 4 DI 14

6 MOSTO LUPPOLATO Controllo L. fermentum LB13 +LF3 Le curve tra il campione di controllo e quello inoculato non mostrano variazioni, perciò risulta evidente che il piccolo abbassamento di ph è dovuto solamente ad un calo fisiologico del substrato, e non implicabile ad un azione fermentativa. PAGINA 5 DI 14

7 Confronto attività fermentativa in presenza ed in assenza di luppolo. Mosto luppolato L.plantarum in mosto NON LUPPOLATO Mosto luppolato P.pentosaceus in mosto NON LUPPOLATO CONCLUSIONI Tutti i ceppi testati in mosto luppolato si sono dimostrati sensibili al luppolo e nessuno di essi è stato in grado di acidificare significativamente il prodotto rispetto al controllo. PAGINA 6 DI 14

8 S.cerevisiae (lievito). Attività acidificante in mosto di birra non luppolato N.B. In questo grafico si notano due fermentazioni distinte e divise dalla linea rossa. Nella prima fino a ph ~ 4,6 si nota il lavoro del lievito, mentre nella seconda parte della fermentazione curva l abbassamento del ph è dovuto probabilmente ad una contaminazione lattica.. Quindi è da considerare un ph finale per il lievito nel mosto = 4,6, in linea con la diminuzione di ph che si ha nella birra solitamente. PAGINA 7 DI 14

9 Valutazione dell attività acidificante in mosto di birra Per valutare l attività acidificante di differenti ceppi di batteri lattici in mosto di birra sono stati scelti due differenti substrati mosto di birra luppolato con 1g/l di luppolo e mosto di birra non luppolato. L attività acidificante è stata studiata utilizzando un sistema automatizzato di rilevazione del ph (Micros). Alla fine della prova sono stete ottenute delle curve di acidificazione e dei parametri cinetici che descrivono l attività acidificante dei ceppi testati. VALUTAZIONE DELL ATTIVITÀ INIBENTE DEL LUPPOLO Da quanto emerge in letteratura la maggior parte dei batteri gram positivi e quindi anche i batteri lattici sono inibiti dall azione antibatterica che il luppolo esplica a livello di membrana. Il L.brevis è di sicuro il più resistente LAB alle sostanze antibatteriche del luppolo. il grado di resistenza è ceppo specifico (Hough et al.,1957; Harris and Watson, 1960; Simpson and Fernandez, 1992; Fernandez and Simpson, 1993). Un altro batterio sicuramente resistente è il P.damnosus responsabile per il 17% delle contaminazioni in birreria (Back., 2009) Ceppi analizzati La nostra analisi sperimentale si è svolta in ceppi che già erano stati singolarmente selezionati e resi disponibili in preparati liofilizzati, così da poter essere facilmente gestibili in birrificio per l inoculo. Tuttavia di tutti i ceppi analizzati nessuno di essi si è mostrato resistente al luppolo ad una concentrazione di 1g/l nel substrato di coltura non sono riusciti a svilupparsi. Tutti i ceppi invece si sono sviluppati in un analisi condotta in contemporanea in mosto NON LUPPOLATO Substrato: Mosto di birra luppolato con 1g/l di perle Quantità inoculo: 10 6 UFC/ml Tempo osservazione: 48h SVILUPPO IN: Mosto non luppolato Mosto luppolato. L.sanfranciscensis TH-933 L. rossiae TH-926 L.plantarum TH Leuconostoc TH-931 Pediococcus TH-967, PAGINA 8 DI 14

10 Controllo sensoriale Metodi e strumenti Alla fine della fermentazione lattica è stata effettuata un analisi olfattiva dei campioni. Risultati L.sanfranciscensis, L.rossiae, Leuconostoc citreum si sono tutti dimostrati portatori evidenti del difetto DMS (dimetilsolfuro) che è stato riconosciuto all unanimità da tutti i giudici. ll solfuro dimetile, detto anche dimetil solfuro o DMS, è un tioetere con formula molecolare (CH 3) 2S. Hanno invece superato il controllo sensoriale il campione L.plantarum e P.pentosaceus, risultando piacevoli. Ceppi L.sanfranciscensis TH-933 L. rossiae TH-926 L.plantarum TH-508 Leuconostoc TH-931 Pediococcus TH-967,968 Valutazione sensoriale Birrificazione con L.plantarum Ricetta d esempio condotta nell impianto sperimentale BrewhouseRock. METODO DI PRODUZIONE Dati principali Nome: Himalaya Stile: Gose Dimensione cotta: 80 litri Grani totali: 15 kg OG: 1044 Kg/m 3 FG: 1010 Kg/m 3 IBU: 10 PAGINA 9 DI 14

11 Ingredienti Nome malto Quantità [Kg] % Pilsner 8,5 56 Sour 0,5 4 Frumento maltato 6 40 Luppolo & spezie Quantità Aa% bollitura Tettnang ( fiori) 59 5,4 60 HB Sale rosa dell himalaya 62g / 10 Coriandolo (non macinato) 62g / 10 HB Lievito Us-05 Quantità 0,5g/l Batteri lattici L.plantarum Quantità 10 6 UFC/ml Inoculo fermenti Inoculo di L.plantarum TH-508 in concentrazione 10 6 UFC/ml, in mosto con ph =5,7 Tempo fermentazione lattica 16h ph finale: 3,9 Bollitura Durata: 60 minuti Aggiunta luppolo e spezie PAGINA 10 DI 14 NICOLA COPPE - BIOAGRO SRL.

12 Fermentazione Inoculo di S.cerevisiae US-05 nel mosto sterile a temperatura 20 C. ANDAMENTO DELLA FERMENTAZIONE DATA TEMPERATURA DENSITA OPERAZIONE 1 giorno 20 C 1044 Inoculo lievito 7 giorno 18 C 1012 Travaso 20 giorno 4 C 1010 Imbottigliamento FLOW SHEET PRODUZIONE STOCCAGGIO MALTO E MATERIE PRIME BOLLITURA (luppolatura) WHIRPOOL (separazione di fase) Pesatura e macinazione malto INOCULO FERMENTI LATTICI (fermentazione lattica h) RAFFREDDAMENTO (e ossigenazione) AMMOSTAMENTO (miscela acqua e malto) RAFFREDDAMENTO (30-35 C) INOCULO LIEVITO (fermentazione alcolica) SACCARIFICAZIONE ( conversioe amidi --> zuccheri) FILTRAZIONE (estrazione del mosto) MATURAZIONE (stabilizzazione chimico-fisica ) PAGINA 11 DI 14 NICOLA COPPE - BIOAGRO SRL.

13 DATI DI PRODUZIONE FASE ph Temperatura fermentazione [ C] Densità [kg/m 3 ] Mosto filtrato pre inoculo Mosto dopo 16 ore (pre boil) 5,7 36, ,9 27, Mosto post boil 3, Birra 1 settimana 3, Birra pre imbottigliamento 3, Birra finita ph 3, Successivamente all inoculo del L.plantarum TH- 508 e all acidificazione fino a ph=3,9 che si è compiuta nell arco di 16h, si è proceduti ad una bollitura per 60 min. PAGINA 12 DI 14 NICOLA COPPE - BIOAGRO SRL.

14 Analisi del rischio di contaminazione del birrificio Premessa Tradizionalmente all interno di un birrificio moderno, escluse eccezioni, è normale condurre solo fermentazioni controllate mediante l utilizzo di S. cerevisiae e S. pastorianus e si è ben attenti a tutte le possibili contaminazioni microbiologiche. Tuttavia in questi ultimi tempi è in voga recuperare vecchi stili di birra che tradizionalmente potevano vedere la naturale contaminazione parziale o addirittura totale del mosto, quindi con o senza inoculo di lievito per la loro produzione. Questo basta a capire che tale procedura in un birrificio dei giorni nostri potrebbe causare moltissimi problemi in quanto i microrganismi facilmente contaminano l ambiente di produzione. Analisi del rischio Mediante il sistema di produzione precedentemente descritto si limitano al minimo tutte le possibili contaminazione da parte dei batteri inoculati. 1. Unico tino inoculato con batteri 2. Sterilizzazione mediante bollitura dello stesso 3. Dal momento dell inoculo alla completa sterilizzazione è possibile lasciare il tino del tutto sigillato limitando al massimo le contaminazioni. (Limitazioni impiantistiche escluse) 4. Sensibilità al luppolo (prevenzione contaminazioni crociate) La procedura si conclude quindi con una normale fermentazione con l aggiunta di lievito. Valutazione morte cellulare dei LAB È stato condotto un controllo di effettiva morte di tutte le cellule dei LAB, per confermare l avvenuta sterilizzazione del substrato mosto. Prelievi: Il campionamento è stato effettuato su 2 CCP per determinare l avvenuta sterilizzazione : 1. Prelievo mosto luppolato al termine della bollitura 2. Prelievo birra pre-confezionamento Terreno: MRS + pimaricina Metodo: Inoculo diretto del campione da analizzare mediante spatolamento superficiale. Risultati : Nessuna crescita nei 2 campioni eseguiti. Lo scopo principale dell utilizzo di questo metodo produttivo sta nel fatto che assicura una totale abbattimento di tutti i batteri lattici inoculati che essendo mesofili o termofili non resistono a condizioni di tempo e temperatura così estreme, garantendo alla fine della bollitura un prodotto sterile. Inoltre, la loro sensibilità al luppolo non ne consente lo sviluppo in mosti di birra o birra luppolata. PAGINA 13 DI 14 NICOLA COPPE - BIOAGRO SRL.

15 VANTAGGI E SVANTAGGI DEL METODO SOUR-WORT RISPETTO AD ALTRI METODI DI ACIDIFICAZIONE (SPONTANEA, SOUR MASH, CON STARTER IN FERMENTAZIONE) VANTAGGI Totale controllo della fermentazione lattica Riduzione massima delle contaminazioni ambientali e mosto-birra Possibilità di utilizzo di LAB sensibili al luppolo Estrema Sicurezza igienico sanitaria ph ottimale in fase di ammostamento Controllo degli off-flavours scegliendo ceppi che non li producono Scelta di ceppi che non producono EPS Totale riproducibilità ed affidamento Non c è competizione microbica tra i m.o. SVANTAGGI Minor tradizionalità Minore presenza di ceppi nella fermentazione Modificazione dei composti mediante bollitura Possibilie minore bouquet aromatico Svantaggi nell affidarsi ad una fermentazione spontanea Minore controllo della fermentazione Possibile produzione di amine biogene Possibile produzione di EPS Possibile produzione di Off-flavours Possibile attacco del substrato da batteri Patogeni Minore riproducibilità PAGINA 14 DI 14 NICOLA COPPE - BIOAGRO SRL.