Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA

Transcript

1 Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA a.a Pier Franco Pignatti Lezioni N Mutazioni e malattie genetiche (Neri-Genuardi cap. 2,18,23) Mutazioni spontanee e indotte, mutagenesi, tipi di mutazione in malattie genetiche

2 Mutazione: una definizione Mutazione: una alterazione della sequenza del DNA rispetto al normale Polimorfismo : una variante con frequenza > 1% nella popolazione NOTA: in medicina è invalso l uso di chiamare mutazione una variazione del DNA ritenuta causa di patologia, e polimorfismo una variazione del DNA non ritenuta causa di patologia

3 Mutazione: caratteristiche Insorgenza: casuale, preadattativa Sede: somatica, germinale Livello: genica, cromosomica, genomica Meccanismo: sostituzione, inserzione, ripetizione, inversione, espansione, delezione, riarrangiamento Cause: endogene, esogene Effetti evolutivi: neutra, svantaggiosa, vantaggiosa

4 Stima diretta della frequenza di mutazione La stima diretta è probabilmente una sottostima a causa di: penetranza incompleta, fenocopie, eterogeneità genetica, non paternità, polimorfismi, riparazione, letalità Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Saunders 1986

5 Livello e frequenza di mutazione * Se un gamete ha geni, allora il 2-20% dei gameti avrà almeno una nuova mutazione genica * Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Saunders 1986

6 Frequenza di mutazione: stime recenti Il tasso di mutazione per sostituzione di base nella linea germinale è circa 10-8 per coppia di basi per generazione (sequenziamento ad alta densità di 2 trii padre, madre, figlio). Ogni figlio avrebbe perciò circa 60 nuove mutazioni (The 1000 Genomes Project, 2010). Stima di 70 nuove mutazioni per genoma umano diploide per ogni generazione (Roach JC et al 2010) Circa 29 mutazioni codificanti per generazione (Genome Research, 30 aprile 2015). Circa 3 indels (1-20bp) e 0,2 varianti strutturali (>20bp) per generazione (Kloosterman WP et al 2015) Circa 1/30 individui non selezionati hanno una mutazione con probabile perdita di funzione (plof) precedentemente associata con una patologia (Johnston JJ et al 2015)

7 The offspring of older fathers harbor a higher percentage of de novo mutations. (Francioli L C et al. 2015)

8 Tipi di mutazione Strutturali : sostituzione nucleotidica, inserzioni, delezioni, inversioni, duplicazioni, riarrangiamenti Regolative : trascrizionali o post-trascrizionali, nel promotore o in altre sequenze di regolazione, modificazione dello splicing

9 Mutazioni con perdita di funzione Per la maggior parte dei prodotti genici la quantità esatta non è essenziale: la maggior parte delle mutazioni con perdita di funzione produce fenotipi recessivi, il che significa che una persona che abbia una sola copia funzionale del gene sarà fenotipicamente normale. In alcuni casi però il 50% del livello normale non è sufficiente per la funzione normale: persone eterozigoti per una mutazione con perdita di funzione mostrano un fenotipo che è perciò ereditato come un carattere dominante. Questo si chiama aploinsufficenza.

10 Perdita di funzione Read A e D Donnai, New Clinical Genetics 2 ed. Scion 2011

11 Mutazioni con guadagno di funzione Mutazioni con guadagno di funzione sono più rare. Determinano fenotipi dominanti Es: Acondroplasia e Malattia di Huntington Fenotipi dominanti anche nel caso in cui il prodotto dell allele mutato interferisca con la funzione del prodotto normale: effetto dominante negativo Es: Osteogenesi Imperfetta Strachan e Read 4th ed

12 Effetto dominante negativo in OI I difetti del gene COL1A1 sono più gravi perché il collagene tipo I ha 2 catene alfa-1 e 1 catena alfa-2. Quindi le mutazioni di alfa-1 determinano il 75% di eterotrimeri anomali come indicato in Figura. Invece le mutazioni di alfa-2 producono il 50% di eterotrimeri anomali.

13 Mutazioni spontanee Avvengono durante la vita normale della cellula, cioè in individui non esposti a mutageni o radiazioni. Costituiscono il materiale usato dalla selezione naturale per l evoluzione biologica. Cause possibili: tautomeria, deaminazione, depurinazione delle basi, radicali liberi, errori replicativi, riparativi o ricombinativi E. Friedberg, DNA Rapair, Freeman 1985

14 Deaminazione Le transizioni C/T rappresentano il 35-50% di tutte le mutazioni puntiformi nell uomo. Il dinucleotide CpG muta per deaminazione 8,5 volte più dell atteso: 5 Me C è hot spot di mutazione (anche C viene deaminata a U, ma il DNA può essere riparato)

15 Mutazioni indotte Mutageni fisici Radiazioni ionizzanti (raggi X, gamma, cosmici, radioattività artificiale e naturale) Radiazioni UV Mutageni chimici Deaminanti, analoghi delle basi, alchilanti, intercalanti, prodotti di pirolisi, sostanze naturali, prodotti sintetici

16 Mutagenesi da raggi X Hartl. Genetica Umana, Zanichelli 1986 (senza frazionamento di dose)

17 Esposizione prenatale alle esplosioni atomiche 8-15 settimane: divisione e migrazione delle cellule nervose nella corteccia cerebrale Curtoni et al, Manuale di Genetica, UTET 1991

18 Effetti dell incidente nucleare di Chernobyl (Aprile 1986)

19 Alcuni mutageni chimici Deaminanti Analoghi delle basi Alchilanti Intercalanti Hartl, Genetica Umana, Zanichelli 1996

20 Mutageni ambientali Sostanze naturali: es. aflatossina Prodotti di pirolisi: es. cibi cotti, tabacco Prodotti sintetici: es. additivi alimentari, cosmetici, tinture permanenti per capelli, farmaci citostatici e immunodepressivi, insetticidi e fungicidi, erbicidi e fitormoni, prodotti per la casa (ipoclorito sodio), il lavoro (cloruro vinile, diossina), nella atmosfera (formaldeide, fumo di sigaretta)

21 Mutageni e cancerogeni Test di mutagenesi di Ames his - Revertenti his Test di Ames per tre tinture di capelli

22 Il costo umano dell uso del tabacco Più di 5 milioni di morti/anno: la prima causa mondiale di morte prematura prevenibile NEJM 330:907, 1994

23 Mutazioni puntiformi Sinonima o silente Sostituzione conservativa Sostituzione non conservativa Terminazione Scivolamento del modulo di lettura Guttmacher e Collins, NEJM 2002

24 Mutazioni per sostituzione di base transizioni, transversioni

25 Mutazione di sostituzione di AA o Missenso: beta s -globina in falcemia o drepanocitosi Transversione GAG>GTG (p.6 Glu>Val) Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

26 Mutazione di terminazione o Nonsenso: HBB p.gln39x in beta -talassemia Transizione CAG>TAG Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

27 Farmaco anti terminazione prematura 25 MAGGIO L Agenzia europea dei medicinali (EMA) ha dato l approvazione condizionale alla commercializzazione di Translarna TM (Ataluren) per il trattamento della distrofia muscolare di Duchenne e della Fibrosi Cistica con mutazione non senso (nmdmd e nmcf).

28 Mutazione da delezione di 1 nucleotide o Frameshift in gene GJB2 e sordità AR 6G 5G c.35delg gene connessina 26 (GJB2) Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

29 Degradazione dell mrna da mutazione nonsenso o Nonsense Mediated Decay (NMD) Se il codone di Terminazione Prematura (PTC) è nella zona rossa, l Exon Junction Complex (EJC) non si stacca e l mrna è degradato. Es: NMD degrada maggior parte mrna BRCA1 con PTC Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

30 Varianti strutturali Le varianti strutturali a volte sono implicate in patologie, più spesso rappresentano semplici differenze interindividuali Check E, Human genome: patchwork people, Nature 2005

31 Delezioni esoniche in DMD e BMD Regola della cornice di lettura Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

32 CNVs o Copy Number Variants CNVs o Copy Number Variants: tratti di DNA ripetuti più lunghi di 1 kb che mostrano differenze del numero di copie nella popolazione normale Espressione diversa dei geni con diverso numero di copie Mappa ad alta risoluzione di 20 europei e 20 africani per CNVs: frequenza >5% Possibile associazione con malattie come Autismo, Schizofrenia, Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) Conrad DF et al Nature 2009

33 CNVs in Autismo Trovate 277 CNVs, delle quali 13 ricorrenti, in 427 pazienti. ACRD: Autism Chromosome Rearrangement Database (Marshall CR et al. 2008) La ricerca delle CNV fa parte ormai della valutazione diagnostica iniziale di malattie dello spettro autistico ed altre malattie con ritardo mentale e dello sviluppo

34 Crossing-over fra sequenze alleliche Scambio reciproco: sono prodotti geni di fusione senza ins/del Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

35 Crossing-over fra sequenze non alleliche A: crossing over diseguale (UEC) B: scambio diseguale fra cromatidi fratelli (UESCE) Sono prodotte inserzioni e delezioni Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

36 Crossing-over diseguale in emoglobinopatie Cr. 11p15.5 Emoglobine Lepore Harris, Genetica Biochimica Umana, Zanichelli 1972

37 C-o diseguale in geni per la visione dei colori Xq 28: 1 copia gene pigmento rosso e 1-3 copie verde Connor e Ferguson-Smith Essential Medical Genetics Blackwell 1993

38 Dosaggio genico in CMT1A e HNPP Il gene PMP22 (cr.17) codifica per il componente principale della mielina. Ripetizioni a basso numero di copie (REP) fiancheggiano il gene. CMT1A: Polineuropatia demielinizzante di Charcot-Marie-Tooth tipo 1A HNPP: Neuropatia ereditaria con paralisi da pressione Lupski JR, Genomic disorders ten years on 2009

39 FISH per il gene PMP22 in CMT1A e HNPP Fluorescent In Situ Hybridization con sonda (rosso) per la regione 17p11.2 contenente il gene PMP22 e con sonda (verde) di riferimento per il cromosoma 17. a) duplicazione del gene in CMT1A; b) delezione del gene in uno dei due cromosomi 17 in HNPP Neri e Genuardi, Genetica umana e medica, Elsevier Masson 2010

40 Conversione genica Scambio non reciproco Connor e Ferguson-Smith, Essential Medical Genetics, Blackwell 1993

41 Ricombinazione gene CYP21 Geni CYP21 e C4 del complemento duplicati nella regione HLA. 21A: pseudogene. 21B: gene espresso steroido-21-idrossilasi. Mutazioni 21B: iperplasia surrenale congenita con diminuita produzione di cortisolo. Tre forme: con perdita di sali (inattivazione genica), semplice virilizzante (attività enzimatica ridotta a circa il 2%), o non classica attenuata con inizio tardivo solo nelle femmine (attività enzimatica ridotta a circa 10%-75%)

42 Microconversione nel gene CYP21 Strachan e Read, Genetica Umana Molecolare, UTET 2000

43 Inversione Lewin B, Il Gene, Zanichelli 1985

44 Inversione gene F8 ed emofilia Rettangoli rossi: sequenza nell introne 22 e due copie invertite a monte del gene. Nella meiosi maschile non c è partner: si può formare un ansa con due copie appaiate con lo stesso orientamento. La ricombinazione produce una inversione cromosomica di circa 500 kb che interrompe il gene. Il 40% dei casi gravi di emofilia A è provocato da inversione

45 Trasposizione I trasposoni sono stati scoperti da Barbara McClintock nel mais negli anni 40. Premio Nobel nel 1983

46 Trasposizione replicativa Es: il retrotrasposone L1 si può inserire nei geni F-VIII o DMD: inattivazione inserzionale

47 Variazioni in gemelli MZ da retrotrasposizione con inserzione di L1 Gemelli geneticamente identici al concepimento, ma alla nascita i loro cervelli sono diversi a causa di nuove inserzioni L1 che avvengono durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale nel feto. In relazione ai geni bersaglio ed ai neuroni colpiti dalle inserzioni, i gemelli possono essere diversi nella funzione o disfunzione cerebrale Martin SL, Developmental biology: Jumping-gene roulette, Nature 2009