La ricerca scientifica alza la guardia contro le frodi nel settore ittico

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1 La ricerca scientifica alza la guardia contro le frodi nel settore ittico Elena Bozzetta SC Istopatologia e Test rapidi FRODI ALIMENTARI: la sanità pubblica in campo per la tutela dei cittadini Torino, 8 Maggio 2014

2 Indagini di Eurofishmarket Un po di numeri Il 74% dei filetti dichiarati di platessa è risultato appartenente ad altre specie ittiche, principalmente alla specie Limanda limanda. Il 15% dei filetti di cernia venduti è risultato in realtà essere di altre specie. Attività della Capitaneria di porto % di illeciti su controlli effettuati tra grossisti, mercati ittici, grande distribuzione, ristorazione, pescherie e ambulanti. Tra le irregolarità: prodotti con date di scadenza false o in cattivo stato di conservazione

3 PERCHÉ? Approvvigionamento insufficiente... Consumo di pesce al massimo storico: 18.8 kg a persona nel 2011 FAO 2012 Movimentazione derrate alimentari Richiesta di varietà

4 SOSTITUZIONE DI SPECIE (aliud pro alio) Frode commerciale (sogliola/passera/platessa) Implicazioni sulla conservazione della specie Implicazioni di tipo sanitario Specie tossiche (coda di rospo/pesce palla) Specie provenienti da aree o Paesi da cui è vietata l importazione per motivi igienico-sanitari Specie che possono provocare allergie Specie a basso valore nutritivo

5 Perché l IDENTIFICAZIONE GENETICA di specie? Notevole esperienza per il riconoscimento morfologico Riconoscimento morfologico di porzioni o lavorati Presenza sul mercato di nuove specie Alimenti trattati termicamente Sinergia tra metodi classici e identificazione genetica

6 Metodi 1/5 FINS Forensically Informative Nucleotide Sequencing: tecnica che combina il sequenziamento del DNA e l analisi filogenetica basata su sequenze nucleotidiche informative But how?

7 Campione ignoto Estrazione mdna Sequenziamento Confronto sequenza consenso con quelle depositate nel database (GenBank) Sequenza di interesse Marcatore candidato: cytochrome b gene (cytb)

8 BarcodeofLife Il consorzio del Barcoding of Life si pone l obiettivo, ambizioso, di raccogliere le sequenze del gene COI di tutte le forme di vita animale Si stanno raccogliendo in un database i barcode di almeno 5 soggetti/specie, che rappresentino le specie ittiche più importanti. Ricerca Finalizzata 2008: Valutazione di marker genetici per identificazione di specie, per la loro applicabilità nel controllo delle frodi alimentari. cytb COI x5 55 specie

9 Validazione 1/2 cytb COI 56 pesci di mare 13 cefalopodi 7 crostacei 7 pesci di acqua dolce 6 Molluschi Eduli Lamellibranchi 89 specie 206 campioni 112 freschi 62 congelati/decongelati 3 sott olio 6 affumicati 3 sotto sale 21 lavorati

10 Validazione 2/2 Predisposizione di un registro, per mettere in relazione la specie con la capacità discriminatoria del marcatore (cytb o il COI) specificità: 100% per almeno uno dei due marcatori variabilità intraspecifica: < 3% sensibilità analitica: prove di diluizioni ripetibilità stretta ed intermedia: K = 1 (i.c. 95% 0.61) applicabilità su tutte le matrici prova accreditata: marchio ACCREDIA

11 Attività di analisi su campo 6 anni di attività 252 campioni ittici analizzati campioni conformi campioni non conformi apr-14 ANNO campioni NON CONFORMI campioni CONFORMI totale specie ittiche analizzate

12 Alcuni esempi 1/3 Discriminazione di specie tra Aphia minuta (rossetto) e Sardina pilchardus (bianchetto) per Capitaneria di Porto di La Spezia Analisi microscopica della morfologia delle vertebre congiuntamente all analisi del DNA Si prevede evoluzione di questo tipo di indagine per discriminazione del Pesce ghiaccio (Neosalanx tangkahkeii)

13 Alcuni esempi 2/3 Regolamento (UE) N. 500/2012 concernente un piano pluriennale di ricostituzione del tonno rosso (Thunnus thynnus) nell Atlantico orientale e nel Mediterraneo T.obesus venduto come tonno rosso o salmone o pinne gialle Tonno rosso senza documentazione Tonno pinne gialle invece di pesce spada Tonnetto invece di tonno

14 Alcuni esempi 3/3 Moscardini (Eledone cirrhosa) e polpo messicano (Octopus maya) per polpo comune (Octopus vulgaris) Pollack d Alaska (Theragra spp.) e eglefino (Melanogrammus eglefino) per merluzzo bianco (Gadus morhua) Pangasio (Pangasius spp.) per gallinella (Chelidonichthys lucernus) e cernia (Acanthistius brasilianus) Persico del Nilo (Lates niloticus) per pesce persico (Perca fluviatilis) Prodotti ittici esotici provenienti dall Estremo Oriente, talvolta venduti come nostrani specie poco conosciute dal punto di vista genetico

15 Conclusioni Attività di routine in crescita: nel corso degli anni trend sempre positivo di campioni sospetti inviati al laboratorio. Media del 22% di non conformità: importanza dei controlli. Necessità di confrontarsi con chi opera sul campo per sviluppare metodiche finalizzate ad affrontare specifiche necessità od emergenze.

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17 CAFODOS molto usato perché economico finalità: sbiancante, conservante, battericida è una miscela di acido citrico, citrato di sodio e perossido d idrogeno è possibile rintracciare l acido citrico ed i suoi sali ma non il perossido d idrogeno!

18 vs congelato PERCHÉ? La dichiarazione del metodo di conservazione nel prodotto ittico assume un'enorme importanza nella percezione della qualità da parte del consumatore finale. Codice Penale Frodi commerciali: Art 515 e segg. Frodi Sanitarie: Art 439 e segg. D.lgs 109/2002 Legge 4 /2011

19 La dichiarazione mendace dello stato di conservazione fresco/congelato configura oltre che una FRODE COMMERCIALE una FRODE SANITARIA Prodotti congelati dichiarati freschi Superamento TMC Aumento carica microbica Prodotto da consumarsi crudo non sottoposto a bonifica RISCHIO PARASSITOSI

20 L ACQUARIO NEL PIATTO, TORINO, 2 DICEMBRE 2013

21 Situazione Anisakis nel mediterraneo

22 RC Ministeriale: Trasmissione zoonotica di nematodi anisakidi dai prodotti della pesca all'uomo: utilizzo di GIS ed epidemiologia molecolare nella valutazione del rischio Specie MAR LIGURE soggetti Positivi anisakidae anisakis hysterot. coinfezion e larve anisakidae anisakis hysterot. misto acciughe sardine cefalopodi TOTALE MAR LIGURE Specie prevalenza abbondanza intensità media tot anisakis hysterot. coinfezioni anisakis hysterot. misto 56,53 31,52 39,13 14,12 3,94 0,89 1,33 acciughe 16,11 4,85 12,11 0,85 1,32 0,05 0,16 sardine 5,52 0,57 5,33 0,29 1,26 0,01 0,06 cefalopodi 2,56 0,49 2,20 0,12 1,24 0,0049 0,03

23 Attività di ricerca Metodi rapidi basati sulla spettroscopia (fluorescenza ed infrarosso) per differenziare pesce fresco e pesce decongelato e loro utilizzo ai fini del controllo ufficiale (Progetto di ricerca ministeriale 2008) SCOPO Valutazione delle prestazioni delle metodiche NIRS, FFFS e istologico per l identificazione dello stato di freschezza/congelamento del pesce

24 RISULTATI METODO ISTOLOGICO

25 S.C. Istopatologia e Test Rapidi PROCEDURA OPERATIVA STANDARD 10DG136 ESAME ISTOLOGICO DIMUSCOLO DIPESCE PER IL RILIEVO DIALTERAZIONI MICROSCOPICHE RIFERITE A CONGELAMENTO TUTTE LE SPECIE DIPESCE Sensibilità: 90,70% (IC95%: 82,49% 95,90%) Specificità: 92,59% (IC95%: 75,71% 99,09%) Riproducibilità intralaboratorio: K-combined = 0.66 (IC95%: ) PESCE SPADA Sensibilità: % (IC95%: 94,94% - 100,00%) Specificità: 100% (IC95%: 94,94% - 100,00%) Riproducibilità interlaboratorio: SPADA_K-combined = 0.95 (IC95%: )

26 IZSTO S.C. Istopatologia e Test Rapidi A Sezione di tessuto muscolare di Sparus aurata-orata. A: prodotto fresco; B: prodotto congelato B

27 Proposta operativa PIANO EPIDEMIOLOGICAMENTE STRUTTURATO PER STIMARE LA PRESENZA DEI PROBLEMI SUL TERRITORIO NAZIONALE Corretta dicitura per lo stato di conservazione del pesce (GDO-Dettaglio) Verificare l effettuazione dell abbattimento termico (Ristorazione)

28 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del del Piemonte, PIANO di MONITORAGGIO (1/2) 1.CAMPIONAMENTO PESCI DA CONSUMARSI PREVIA COTTURA Mescolamento pesce fresco e congelato (prevalenza attesa 80%) CAMPIONAMENTO DI PESCE DI GRANDI DIMENSIONI (SPADA/TONNO)

29 PIANO di MONITORAGGIO (2/2) 2. CAMPIONAMENTO PER VERIFICARE L'AVVENUTO CONGELAMENTO SANITARIO prevalenza attesa del trattamento del 99% *A causa dei valori di sensibilità e specificità anche campionando tutti i soggetti della partita e trovandoli tutti sospetti non si raggiungerebbero i valori di accuratezza richiesti

30 INDAGINI NEL TORINESE Numero progressivo Denominazione esposta in fase di vendita Smeriglio Salmone Persico Pangasio Tonno Pangasio Persico Salmone Salmone Merluzzo Persico Tonnetto Tonno Salmone Pangasio Persico Branzino Sarago Tonnetto Salmone Pangasio Persico Stato di conservazione dichiarato Congelato Tipologia di esercizio commerciale Area mercatale 1 (mercato ittico coperto) Area mercatale 2 Area mercatale 3 GDO 1 GDO 2 GDO 3 23 Tonno Congelato Ristorante Salmone Tonno Tonnetto Congelato Congelato Ristorante 2 Ristorante 3

31 RISULTATI Numero progressivo Specie dichiarata Specie identificata Stato di conservazione dichiarato Stato di conservazione effettivo Smeriglio Salmone Persico Pangasio Isurus oxyrinchus Salmo salar Lates niloticus* Pangasius spp Congelato Congelato Congelato* Tonno Pangasio Persico Salmone Thunnus albacares* Pangasius spp Lates niloticus* Salmo salar Salmone Merluzzo Persico Salmo salar Theragra chalcogramma* Lates niloticus* Congelato* Tonnetto Tonno Salmone Pangasio Persico Branzino Euthynnus alletteratus Thunnus thynnus Salmo salar Pangasius spp. Perca fluviatilis Dicentrarchus labrax Congelato* Congelato* Sarago Tonnetto Salmone Pangasio Persico Diplodus vulgaris Euthynnus alletteratus Salmo salar Pangasius spp Perca fluviatilis Congelato* 23* Tonno Thunnus obesus* Congelato * Salmone Tonno Salmo salar Thunnus thynnus Congelato Congelato Congelato Congelato 26 Tonnetto Euthynnus alletteratus Congelato* Per il 27%dei campioni èstata riscontrata una non conformitàdello stato di conservazione

32 INDAGINI NELLA REGIONE LIGURIA PESCE DA CONSUMARSI CRUDO ID Dichiarato congelato c nc c nc nc 2 congelato c c c c c 3 congelato nc nc f nc nc 4 congelato f nc f nc nc 5 congelato nc c c c c 6 congelato c c c c c 7 congelato c c c c c 8 congelato nc nc f nc nc 9 congelato c c c c c 10 congelato c c c c c 11 congelato f f f f f 12 congelato nc nc nc f nc 13 congelato f f nc nc f 14 congelato f nc nc f f 15 congelato c c c c c 16 congelato c c c c c 17 congelato f f f f f 18 congelato f nc f f f 19 congelato nc nc nc nc nc 5 CAMPIONI/ PARTITA L ESAME ISTOLOGICO HA RILEVATO IL 26 % DI PARTITE NON CONFORMI

33 Prevalenza positività di Diphyllobotrium latum nei maggiori laghi italiani Totale N Campioni N Positivi Prevalenza (%) Lago Maggiore ,26 Lago di Como ,69 Lago d'iseo ,73 Lago di Garda 212 0

34 S.C. Istopatologia e Test Rapidi IL METODO ISTOLOGICO NELLA VALUTAZIONE FRESCO/CONGELATO DEL PESCE D ACQUA DOLCE ) 20 trote fresche allevate in condizioni controllate prelievo del tessuto muscolare per l esame istologico protocollo applicato non ha comportato modifiche a quello in uso 20 trote allevate in condizioni controllate congelamento delle trote intere a -20 C per almeno 24 h (non più di 48 h) scongelamento a +4 C per circa 24 h prelievo del tessuto muscolare per l esame istologico (lettura in cieco) TROTA IRIDEA (Oncorhyncus mykiss

35 TESSUTO MUSCOLARE DITROTA FRESCA (EE) TESSUTO MUSCOLARE DITROTA SCONGELATA (EE) Sensibilità:100%, IC 95%(78-100%); Specificità 100%, IC 95% (83-100%)

36 Ricerca corrente 11C3 Sorveglianza sulle frodi sanitarie ittiche relative alla dichiarazione dello stato di conservazione Previa valutazione dell idoneità del metodo, indagini nel salmone affumicato Il 69% dei campioni di salmone affumicato sono risultati provenire da pesce fresco. Id campione 1 * Esito istologico 2 Non conclusivo 3 * 4 Congelato 5 * 6 * 7 Non conclusivo 8 * 9 Congelato 10 * 11 * 12 Congelato 13 * 14 * 15 *

37 Cambiando i tempi di processazione...(4 specie diverse) Modificando i tempi di processazione la validità del test non cambia: I valori di Se e Sp rimangono gli stessi TEMPI DI PROCESSAZIONE Se I.C. 95% SP I.C. 95% 24 ORE 100% 92.5% - 100% 100% 91.8% - 100% 12 ORE 100% 92.5% - 100% 100% 91% - 100% 6 ORE 100% 92.5% - 100% 100% 90% - 100% Aumenta l'ampiezza degli intervalli di confidenza perche aumenta la probabilità (non statisticamente significativa) di ottenere risultati non conclusivi. TEMPO DI PROCESSAZIONE ODDS RATIO I.C. 95% 12 ore 1, ore 2, Ricerca corrente 11C3 Sorveglianza sulle frodi sanitarie ittiche relative alla dichiarazione dello stato di conservazione I risultati non sono influenzati dalla specie ittica esaminata

38 Numero di soggetti campionati INDAGINE ISTOLOGICA PRELIMINARE IN MOLLUSCHI CEFALOPODI Ricerca corrente 11C3 Sorveglianza sulle frodi sanitarie ittiche relative alla dichiarazione dello stato di conservazione Denominazione esposta in fase di vendita Stato di conservazione Luogo 3 sezioni longitudinali 3 trasversali in ciascun soggetto in corrispondenza di 5 Totano di Porto S. Stefano Illex coindetii Area mercatale A (mercato ittico coperto) 3 Totano atlantico Illex argentinus Congelato Area mercatale A (mercato ittico coperto) Polpo Octopus vulgaris Polpo Octopus vulgaris Polpo Octopus vulgaris Polpo Octopus vulgaris Congelato Congelato Area mercatale A (mercato ittico coperto) Area mercatale B (mercato ittico coperto) GDO C GDO C A: Mercato ittico di Milano; B: Mercato ittico di Savona; C: Ipermercato di Torino.

39 RISULTATI PRELIMINARI TESSUTO MUSCOLARE, SEZIONE TRASVERSALE TENTACOLO DI POLPO (EE) CAMPIONE FRESCO CAMPIONE CONGELATO

40 La proteomica a supporto della sicurezza alimentare La proteomica è la scienza che si occupa di studiare il proteoma l intero complesso di proteine espresse da un genoma Il proteoma èdinamico e muta nel tempo in base a differenti processi fisiologici, patologici o in risposta a sostanze o stimoli ambientali. Lo studio del proteoma si realizza mediante tecniche molto sofisticate che consentono di separare le proteine presenti in miscele complesse e di caratterizzarle (elettroforesi bidimensionale, spettrometria di massa, microarray)

41 La proteomicaa supporto della sicurezza alimentare Monitoraggio dei processi proteolitici legati alle modalità di conservazione degli alimenti di origine animale, quali il pesce fresco Valutazione espressione proteica tra campioni di polpo fresco e congelato Materiali: analisi di campioni di polpo fresco e dopo 72 ore di congelamento a -20 C Metodologia 1.Estrazione e separazione proteine mediante analisi di elettroforesi bidimensionale (2D); 2.Colorazione della mappe proteiche; 3.Analisi di confronto con apposito software delle mappe proteiche ottenute dai due gruppi di campioni Risultati Evidenziata una diversa espressione proteica tra i campioni di polpo fresco e quello decongelato Applicazioni future: Sviluppo metodo per altre specie ittiche (moscardini e gamberi) e altre matrici (carni avicole)

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43 Ringraziamenti Dr. Stefano Gili, ASL TO1; Dr. Renato Malandra, Responsabile Mercato Ittico Milano; Dr.ssa Elena Teneggi, Sezione di Genova; Dott. Marino Prearo, S.S. Laboratorio specialistico di Ittiopatologia; Dr Pierluigi Acutis e Maria Vittoria Riina, S.S. di Genetica; Dr.ssa Maria Mazza, S.S. Immunobiochimica; Dr.ssa Elisa Baioni e Cristiana Maurella, S.S. BEAR e tutto il team dell Istopatologia!

44 CONTATTI: Elena BOZZETTA SC Istopatologia e Test Rapidi Tel

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46 STACCO DOPO GIACENZE

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48 RISULTATI FRESCO Xiphias gladius CONGELATO

49 La dichiarazione mendace dello stato di conservazione fresco/congelato configura oltre che una FRODE COMMERCIALE una FRODE SANITARIA Prodotti congelati dichiarati freschi Superamento TMC Aumento carica microbica Prodotto da consumarsi crudo non sottoposto a bonifica RISCHIO ANISAKIS

50 POS 10DG136 ESAME ISTOLOGICO DIMUSCOLO DIPESCE PER IL RILIEVO DIALTERAZIONI MICROSCOPICHE RIFERITE A CONGELAMENTO PARAMETRI DI VALIDAZIONE VALIDAZIONE METODO TUTTE LE SPECIE Sensibilità: 90,70% (IC95%: 82,49% 95,90%) Specificità: 92,59% (IC95%: 75,71% 99,09%) Riproducibilità intralaboratorio: K-combined = 0.66 (IC95%: ) PESCE SPADA Sensibilità: % (IC95%: 94,94% - 100,00%) Specificità: 100% (IC95%: 94,94% - 100,00%) Riproducibilità interlaboratorio: SPADA_K-combined = 0.95 (IC95%: )

51 INDAGINE ISTOLOGICA PRELIMINARE IN MOLLUSCHI Numero di soggetti campionati 5 Denominazione esposta in fase di vendita Totano di Porto S. Stefano Illex coindetii Stato di conservazione dichiarato CEFALOPODI Luogo Area mercatale A (mercato ittico coperto) 3 sezioni longitudinali 3 trasversali in ciascun soggetto in corrispondenza di 3 Totano atlantico Illex argentinus Congelato Area mercatale A (mercato ittico coperto) Polpo Octopus vulgaris Polpo Octopus vulgaris Polpo Octopus vulgaris Polpo Octopus vulgaris Congelato Congelato Area mercatale A (mercato ittico coperto) Area mercatale B (mercato ittico coperto) GDO C GDO C A: Mercato ittico di Milano; B: Mercato ittico di Savona; C: Ipermercato di Torino.

52 Regolamento CE 853/2004 allegato III, sezione VIII, capitolo III, paragrafo D i prodotti ittici di seguito elencati devono essere congelati ad una temperatura non superiore a -20 C in ogni parte della massa per almeno 24 ore: a) I prodotti ittici da consumarsi crudi b) I prodotti della pesca sottoposti ad affumicatura a freddo con procedimento < 60 C (aringhe, sgombri, spratti, salmone) c) Prodotti della pesca marinati o salati Regolamento UE 1276/2011 [ ] a) i prodotti della pesca che vanno consumati crudi o praticamente crudi; oppure b) i prodotti della pesca marinati, salati [ ] siano sottoposti ad un trattamento di congelamento che uccide i parassiti [ ] 2. Per i parassiti diversi dai trematodi il congelamento deve consistere in un abbassamento della temperatura in ogni parte della massa del prodotto fino ad almeno: a) 20 C, per almeno 24 ore; oppure b) 35 C, per almeno 15 ore.

53 Visti i risultati incoraggianti ottenuti con l istologia abbiamo validato il metodo istologico in 35 specie differenti

54 TANTO SUSHI E Non si può definire più come una moda tanto è diffuso il consumo di pesce crudo ed il sorgere spontaneo in ogni parte d Italia di sushi bar o simili. In effetti l abitudine di tanti italiani di mangiare pesce e molluschi non cotti non è un marchio tipico d importazione giapponese, anche perché nel Nostro Paese è consuetudine consumarne da sempre, così come da sempre si dimenticano i rischi connessi dovuti spesso alla carenza d informazione.

55 Reg. 1379/2013 del Parlamento Europeo e del Consiglio Articolo 35 Informazioni obbligatorie [...] d) se il prodotto è stato scongelato; Il requisito di cui alla lettera d) non si applica: a) agli ingredienti presenti nel prodotto finito; b) agli alimenti per i quali il congelamento costituisce una fase tecnologicamente necessaria del processo di produzione; c) ai prodotti della pesca e dell'acquacoltura precedentemente congelati per ragioni di sicurezza sanitaria, conformemente all'allegato III, sezione VIII, del regolamento (CE) n. 853/2004; d) ai prodotti della pesca e dell'acquacoltura che sono stati scongelati prima di essere sottoposti ad affumicatura, salatura, cottura, marinatura, essiccatura o ad una combinazione di uno di questi processi.

56 Valutazione metodo istologico in preparazioni di pesce Guia Valutare l applicabilità dei parametri istologici adottati per identificare lo stato di conservazione del pesce ai prodotti sottoposti a trattamento di marinatura/affumicatura

57 RISULTATI PRELIMINARI TESSUTO MUSCOLARE, SEZIONE TRASVERSALE TENTACOLO DI POLPO (EE) Qual è il fresco?... Tutti e due questo è congelato.

58 PARASSITI PRESENTI NEI PESCI D ACQUA DOLCE Il numero di persone affette da parassitosi da trematodi associate al consumo di prodotti della pesca supera (WHO, 1995), ma le persone a rischio, incluse quelle dei paesi in via di sviluppo non è quantificabile (WHO, 2004) Nel 2010 il numero di persone affette da parassitosi da trematodi associate al consumo di prodotti della pesca supera Consumo di pesci d acqua dolce crudi o poco cotti La maggior prevalenza nell Asia sud-orientale Aumenta il numero di infezioni in paesi considerati non endemici (globalizzazione del commercio) L ACQUARIO NEL PIATTO, TORINO, 2 DICEMBRE 2013

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