28/11/16. Le proteine sono biologicamente a1ve solo se ripiegate nella conformazione corre5a (Folding) UBIQUITINA

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1 Livelli di organizzazione delle proteine Le proteine sono biologicamente a1ve solo se ripiegate nella conformazione corre5a (Folding) es. Folding ossida;vo Il corretto ripiegamento è aiutato da specifiche proteine (hsp e chaperonine) Alcune proteine (chaperone) guidano l avvolgimento (ad esempio, heat shock proteins). Molte chaperonine sono dotate di attività ATPasica necessaria per esplicare la loro attività biologica. Degradazione delle proteine Ogni proteina ha una sua specifica durata. Le proteine vengono degradate da proteasi attraverso due pathway principali: Attraverso il lisosoma (non specifico, principalmente per proteine extracellulari) Attraverso il pathway del proteasoma/ubiquitina (molto regolato e specifico) Le hsp (heat shock proteins) ostacolano la denaturazione; sono proteine molto conservate evolutivamente Eliminare proteine con folding non corre5o è essenziale: mala1e neurodegenera;ve come il morbo di Hun;ngton, di Alzheimer sono causate dall accumulo di proteine mal conformate che si aggregano e danneggiano le cellule. Isolata da Goldstein nel 1975, come proteina con funzione ignota, è stata poi iden;ficata in tu1 gli organismi eucario; ed in tu1 i tessu;. E una proteina piccola, di 76 aminoacidi, altamente conservata. L ubiqui;nazione di una proteina target comporta una serie di a1vità enzima;che a cascata, che portano alla formazione di un legame pep;dico tra l ubiqui;na ed il gruppo NH 2 di un residuo di Lisina nella proteina target. UBIQUITINA Figure 7.26b The Biology of Cancer ( Garland Science 2007) E3 è una ubiquitina ligasi: lega l ubiquitina alla proteina da degradare. Esistono centinaia di enzimi E3: la loro variabilità garantisce estrema specificità di substrato all'intero processo. Il Pathway Ubiquitina/Proteasoma The three biochemical steps that conjugate Ub to the protein substrate. Lecker S H et al. JASN 2006;17: Le proteine che sono state legate covalentemente ad almeno 4 molecole di ubiquitina vengono riconosciute dal proteasoma e degradate by American Society of Nephrology 1

2 28/11/16 Il Proteasoma (26S) Il Proteasoma 19S ATPasi 20S pep+dasi 19S ATPasi Substrate entry is a complex process that is catalyzed by the 19S par+cle. This complex architecture evolved to isolate proteolysis within a nanosized compartment and prevents the nonspecific destruc+on of cell proteins. Il Proteasoma Il Proteasoma The 26S proteasome structure includes the 20S core that contains the unique proteolytic sites that break peptide bonds. The ATPases also act as a key in a lock to cause opening of the gated, substrate entry channel of the 20S outer ring and into its central degrada+ve chamber. Linearizing and delivering the substrate u+lizes significant energy, perhaps one third as much ATP as the ribosome would use in synthesizing the protein, but it ensures the efficient and regulated elimina+on of the protein. Lecker S H et al. JASN 2006;17: by American Society of Nephrology ESPRESSIONE GENICA: FLUSSO DI INFORMAZIONI DAL DNA ALLE PROTEINE CELLULA EUCARIOTICA Ogni step cos;tuisce un possibile punto per controllare l abbondanza di una certa proteina. La maggior parte del controllo avviene a livello della trascrizione. 2

3 ESPRESSIONE GENICA: FLUSSO DI INFORMAZIONI DAL DNA ALLE PROTEINE CELLULA EUCARIOTICA -PROCARIOTICA Regolazione Genica nei procarioti E. coli ha 4288 geni codificanti. Geni costitutivi: costantemente trascritti (es. quelli della glicolisi). Geni inducibili: espressi solo in determinate condizioni (es. quelli del metabolismo del lattosio vengono espressi solo in presenza di questo zucchero nell ambiente). Regolazione dell attività di un enzima e/o regolazione del numero di molecole di enzima per cellula. Regolazione Genica nei procarioti Jacob e Monod (1961): identificano l Operon Lac, complesso genico comprendente Ø geni strutturali con funzioni correlate (lacz, lacy, laca codificanti per galattosidasi, galattosio permeasi, galattoside transacetilasi) sotto il controllo di un unico promotore Ø geni di controllo (operatore e repressore) Regolazione Genica nei procarioti L operatore è una sequenza di basi, in parte sovrapposta al promotore, che si trova a monte del primo gene strutturale In assenza di Lac, una proteina repressore lattosio (codificata da un gene regolatore costitutivamente espresso) si lega all operatore lattosio, l RNA polimerasi non può legarsi al promotore e la trascrizione dell operon Lac è inibita Regolazione Genica nei procarioti Il repressore lattosio ha anche un sito di legame allosterico per l allolattosio (prodotto in piccole quantità in presenza di lattosio). Quando l allolattosio lega il repressore, questo si modifica e si stacca dall operatore, il promotore si libera e l RNA pol trascrive l operone In assenza di allolattosio, il repressore si lega nuovamente all operatore, bloccando la trascrizione dell operone 3

4 Regolazione dell espressione genica nei procario; Principalmente regolazione trascrizionale Un esempio è l OPERONE LAC: geni, trascri1 insieme, che codificano per 3 proteine necessarie per l u;lizzo del la5osio (gala5osio-glucosio). Questo operone viene trascri5o se c è il la5osio e non c è il glucosio. IL REGULONE Regulone: gruppo di operoni controlla; da un solo gene regolatore La proteina CAP controlla la trascrizione di una serie di operoni coinvol; in diverse vie cataboliche Una mutazione di CAP può impedire alla cellula di metabolizzare una serie di zuccheri da essa regola; OPERONE LAC Questa ESPRESSIONE può avvenire con una efficienza diversa. 28/11/16 Trascrizione 24 4

5 Regolazione dell espressione genica negli eucario; Eucarioti pluricellulari: -un singolo organismo, utilizzando un unico genoma, deve produrre centinaia di tipi cellulari differenti e specializzati; -le cellule differenziate sono prodotte da popolazioni di cellule immature, non specializzate, dette cellule staminali, attraverso un processo noto come differenziamento cellulare Cellula umana contiene circa geni Geni per proteine RNA genes Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale ( 5000 geni) Geni housekeeping metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali Geni tessuto - specifici DIFFERENZIAMENTO CELLULARE A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA I meccanismi di controllo usati per regolare l espressione dei geni umani devono essere molto più complessi di quelli utilizzati dagli altri organismi. Regolazione dell espressione genica negli eucario; Controllo dell espressione genica: 1. Controllo trascrizionale: a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina b) FATTORI TRASCRIZIONALI: legame di fa5ori proteici a sequenze nucleo;diche di regolazione (A1vatori e repressori) a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina 28/11/16 Trascrizione 29 28/11/

6 EPIGENETICA: Acetilazione e altre modifiche istoniche e metilazione del DNA. Si tratta di modifiche della cromatina che non comportano cambiamenti nella sequenza di basi del DNA. Acetilazione degli istoni e altre modifiche istoniche e metilazione del DNA modificano la struttura della cromatina e possono REGOLARE L ESPRESSIONE DEI GENI MEDIANTE: MECCANISMI EPIGENETICI GENE: Ogni regione del DNA capace di sintetizzare una molecola funzionale di RNA. Regolazione dell espressione genica negli eucario; Controllo dell espressione genica: 1. Controllo trascrizionale: a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina b) FATTORI TRASCRIZIONALI: legame di fa5ori proteici a sequenze nucleo;diche di regolazione (A1vatori e repressori) b. FATTORI TRASCRIZIONALI PROTEINE CHE RICONOSCONO E LEGANO SPECIFICHE SEQUENZE ALL INTERNO DI UN PROMOTORE: Una serie di fattori di trascrizione deve legarsi al promotore prima che la RNA polimerasi vi si possa legare e trascrivere quindi, a livello basale, il gene. L efficienza della trascrizione dipende anche dal legame di proteine di regolazione, attivatrici e, in alcuni casi di repressione, al promotore. Altre sequenze di DNA, spesso molto distanti dal promotore, sono ulteriormente implicate nella regolazione, aumentandola (enhancer) o reprimendola (silencer). - FATTORI TRASCRIZIONALI BASALI sono indispensabili per l inizio della trascrizione, aiutano la RNA polimerasi a riconoscere il promotore - ATTIVATORI TRASCRIZIONALI aumentano l efficienza di trascrizione - REPRESSONI TRASCRIZIONALI diminuiscono l efficienza di trascrizione Elementi distali -100 GC box -80 CAAT box -25 TATA box Elementi prossimali Promotore basale 28/11/16 FaRori trascrizionali 33 28/11/16 FaRori trascrizionali 34 ENHANCER - SILENCER Una sequenza enhancer classica contiene al suo interno parecchi elementi di controllo differenti, ognuno dei quali è costituito da una corta sequenza di DNA che funziona da sito di legame per uno specifico fattore di trascrizione regolativo (attivatore). Spesso i siti di legame possono essere gli stessi presenti nelle sequenze prossimali. I silencer sono meno abbondanti, legano fattori in grado di ridurre l efficienza di trascrizione (repressori). REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE: FATTORI TRSCRIZIONALI LA REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE AVVIENE ATTRAVERSO IL LEGAME DI FATTORI PROTEICI (FATTORI DI TRASCRIZIONE) A SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI REGOLAZIONE. I FATTORI PROTEICI IMPEGNATI A REGOLARE L ESPRESSIONE GENICA AGISCONO IN TRANS LEGANDOSI ALLE SEQUENZE DI DNA CHE SONO IN PROSSIMITA DEL GENE (IN CIS) 28/11/16 FaRori trascrizionali 35 28/11/16 FaRori trascrizionali 36 6

7 FATTORI TRASCRIZIONALI Regolazione trascrizionale in risposta ad ormoni lipofili# In assenza di stimolo il recettore è inattivato mediante il legame con una proteina di inibizione (HSP90) 28/11/16 FaRori trascrizionali 39 I DUE PRINCIPALI MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE (MECCANISMI EPIGENETICI E FATTORI TRASCRIZIONALI) SPESSO AGISCONO INSIEME. Repressori e attivatori, grazie a co-attivatori/corepressori, dirigono quindi la deacetilazione/ acetilazione degli istoni a livello di specifici geni 28/11/16 FaRori trascrizionali 41 28/11/16 FaRori trascrizionali 42 7

8 Regolazione dell espressione genica negli eucario; Regolazione dell espressione genica negli eucario; Splicing alternativo Controllo dell espressione genica: 2. Controllo post-trascrizionale: SPLICING ALTERNATIVO STABILITÀ DELL mrna (mirna, sirna) La stabilità dell mrna citoplasmatico è variabile! 8

9 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 was awarded jointly to Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by doublestranded RNA" The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 was awarded jointly to Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by doublestranded RNA" hrp:// hrp:// pri-mirna pre-mirna mirna 1.Complementarità imperfetta I mirna bloccano l espressione dei loro geni target a livello traduzionale Per inibire la traduzione legano solitamente le regioni non tradotte al 3 (3 UTR),per le quali presentano omologia 2.Complementarità perfetta I mirna che legano i loro RNA bersaglio con complementarietà perfetta inducono il taglio del bersaglio che,quindi,non può più essere tradotto: STABILITA DELL mrna Target, attivano la degradazione dell mrna In questo caso i mirna trovano la loro regione di omologia o nell ORF(open reading frame) o nella sequenza codificante 9

10 sirna I sirna agiscono principalmente determinando la degradazione dello specifico mrna bersaglio attraverso un meccanismo definito RNA interference(rnai) Molecole di sirna si producono a partire da RNA normalmente estranei alla cellula, quali trasposoni,virus o transgeni. RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma Modello per la biogenesi e l attività di mirna e sirna sirna agiscono solo per complementarietà perfetta per cui ogni sirna può avere un unico mrna bersaglio e modulare la stabilità dell mrna Diversamente, i mirna costituiscono una numerosa classe di geni endogeni filogeneticamente conservati,la cui funzione è di inibire l espressione genica principalmente attraverso l inibizione della traduzione Ogni mirna,per il suo caratteristico meccanismo d azione può avere più di un mrna bersaglio Es: Controllo del livello di ferro nella cellula Il ferro e un nutriente essenziale La cellula lo usa per: citocromi, emoglobina e molti enzimi. Il ferro in eccesso e causa di formazione di radicali liberi. Quindi il livello di ferro deve essere controllato accuratamente. Ferri;na: Lega il Ferro e lo conserva Rece5ore della Transferrina (TFR): trasporta il ferro nella cellula 10

11 Regolazione di proteine trasportatrici/ immagazzinamento del ferro Sangue! Fe 2+! Transferrin (trasporto)! Transferrin receptor (ingresso) Ferritin (Stoccaggio)! Fe 3+! Sono state evidenziate numerose sequenze di regolazione all interno delle sequenze non tradotte (5 e 3 UTR). Esistono proteine che legandosi a specifiche sequenze di RNA controllano l espressione genica a livello traduzionale 5 UTR Elemento IRE Quando il ferro e in eccesso la cellula deve diminuire il livello del recettore e aumentare quello della ferritina.! 3 UTR La cellula ottiene questo mediante regolazione della traduzione,! Cosi la risposta e piu rapida La velocità di degradazione di alcuni mrna eucariotici è regolata Regolazione Ferro-dipendente della stabilità dell mrna del recettore della transferrina +Fe -Fe Una proteina in grado di legarsi alle sequenze IRE (IRE-BP) regola la produzione del recettore della transferrina. Essa in presenza di basse concentrazioni di ferro si lega agli elementi di risposta al ferro (IRE) che si trovano nella regione non tradotta al 3 (3 UTR), impedendo la degradazione dell mrna. La traduzione di mrnas è regolata da specifiche RNA-binding proteins! Regolazione Fe-dipendente della traduzione dell mrna della ferritina!! Controllo dell espressione genica: 3. Controllo traduzionale +Fe -Fe La proteina che si lega alle sequenze IRE (IRE-BP) inibisce la produzione della catena pesante della ferritina legandosi agli elementi di risposta al ferro (IRE) che si trovano nelle regioni non tradotte al 5 (5 UTR). 11

12 Controllo dell espressione genica: 4. Controllo post-traduzionale: Concentrazione della proteina Proteina a1va o ina1va Modificazioni dei singoli aa Fosforilazione gruppi ossidrilici di Ser, Thr e Tyr Carbossilazione gruppi carbossilici possono essere aggiun; a Asp e Glu (es. protrombina) Me;lazione gruppi me;lici possono essere aggiun; a Lys e Glu (es. istoni) Ace;lazione (es. istoni) Proteina a1va o ina1va NUCLEO controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi responsivi di geni inducibili CITOPLASMA Esistono molteplici livelli di regolazione dell espressione genica negli eucarioti controllo traduzionale traduzione Genoma mrna Meccanismi epigenetici: controllo a lungo e corto raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina Trascritto primario (precursore) mrna controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polya alternativo, controllo del trasporto controllo della stabilità degradazione PROTEINA controllo post-traduzionale PROTEINA attiva o inattiva 12