Preparazione terreni nutritizi agarizzati per la coltura di isolati fungini.

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1 Laboratorio della Micoteca Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi Università degli Studi di Torino Sede: Viale Mattioli, Torino Preparazione terreni nutritizi agarizzati per la coltura di isolati fungini. Amido di Patate (AM) MnSO4 5H2O 0.05g Amido di patate Ammonio tartrato Aggiungere quindi 10 ml di una soluzione di micro Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Estratto di Malto (MEA) Estratto di Malto (MEA Ab) addizionato di antibiotici

2 Cloramfenicolo Streptomicina 0.05 g 0.0 Unire tutti i reagenti, tranne gli antibiotici, in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1 L di acqua distillata. Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al raggiungimento di una soluzione omogenea. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Lasciare raffreddare e aggiungere in ambiente sterile la soluzione di antibiotici precedentemente sterilizzata tramite filtrazione (20 µm). Estratto di Malto per alofili (MEA NaCl 15%) NaCl 150 g Estratto di Malto cicloesimmide (MEACX) monoidrato Sciogliere in 3 ml di acetone il contenuto di un flacone di Dermasel Selective Supplement (OXOID cat. n. SR075E). Unire tutti i reagenti, contenuto del falcone di Dermasel compreso, in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1 L di acqua distillata. segatura 1 Segatura finemente macinata (di latifoglia o di conifera opp. mista, in relazione alle caratteristiche del fungo da coltivare) 10 g Unire tutti i reagenti in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1L di acqua distillata. Blakeslee Malt Extract Autolysate agar (BMEA)

3 CuSO4 5H2O ZnSO4 7H2O g Bold s Basal Medium (BBM) Pesare le seguenti soluzioni stock in acqua demineralizzata, pesando i singoli reagenti utilizzando una bilancia analitica: a) NaNO3 0. in 80 ml b) CaCl2 in 40 ml c) 0.3 g in 40 ml d) K2HPO4 0.3 g in 40 ml e) 0.7 g in 40 ml f) NaCl in 40 ml g) H3BO 1.14 in 100 ml h) FeSO4 7H2O g + ZnSO4 7H2O MnCl2 4H2O g in 100 ml i) MoO CuSO4 5 H2O g + Co(NO3)2 6 H2O g in 100 ml l) EDTA 5 g + KOH g in 100 ml Prelevare le seguenti aliquote di ciascuna soluzione stock: a 20 ml, b, c, d, e, f 10 ml g, h, i, l 1 ml Aggiungere di e portare a volume di 1 L con acqua demineralizzata. Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al Creatine Sucrose (CREA) Creatina 3 H2O MgSO4 7 H2O KCl FeSO4 7H2O CuSO4 5H2O ZnSO4 7H2O Rosso di Bromocresolo 3 g 1.6 g g 0.05 g

4 Avvenuta la sterilizzazione controllare con l ausilio di cartine tornasole il ph del terreno nutritizio. Aggiustare il ph a Czapek s (CZ) NaNO3 MgSO4 KCl FeSO4 7H2O 3 g Aggiungere un ancoretta. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Czapek s 70 % per alofoli (CZ 70%) NaNO3 MgSO4 KCl FeSO4 7H2O 3 g 700 g Aggiungere un ancoretta. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Czapek s 40 % per alofoli (CZ 40%) NaNO3 MgSO4 KCl FeSO4 7H2O 3 g 400 g Aggiungere un ancoretta. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Czapek s 20 % per alofoli (CZ 20%) NaNO3 MgSO4 KCl 3 g

5 FeSO4 7H2O 200 g Aggiungere un ancoretta. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Czapek Yeast Autolisate (CYA) NaNO3 3 H2O MgSO4 7 H2O KCl FeSO4 7H2O CuSO4 5H2O ZnSO4 7H2O Estrattodi lievito 3 g 1.3 g g 5 g Dichloran 18% Glycerol (DG18) Dichloran-Glycerol (DG18) Base (Oxoid cat n. CM 729) g Porre i 15,75 g in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 500 ml di acqua distillata. raggiungimento di una soluzione omogenea. Aggiungere quindi 110 g di Glicerolo (puro per analisi). Ricostituire asetticamente il contenuto di un flacone di Chloramphenicol Selective Supplement (Oxoid cat n. SR0078E) con 3 ml di etanolo e agitare fino a completa dissoluzione. Asetticamente aggiungere quindi il contenuto del falcone alla bottiglia contenente il DG 18 e il glicerolo. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Dichloran Rose Bengala Chloramphenicol (DRBC) Dichloran Rose Bengala g (Fluka cat. n ) Porre i 15,75 g in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 500 ml di acqua distillata. raggiungimento di una soluzione omogenea. Ricostituire asetticamente il contenuto di un flacone di Chloramphenicol Selective Supplement (Oxoid cat n. SR0078E) con 3 ml di etanolo e agitare fino a completa dissoluzione. Asetticamente aggiungere quindi il contenuto del falcone alla bottiglia contenente il DRBC. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 EQ

6 MnSO4 5H2O 0.05g Ammonio tartrato Aggiungere quindi 10 ml di una soluzione di micro Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 GN1 MnSO4 5H2O 0.05g Ammonio Tartrato 10 g Unire tutti i reagenti in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1L di acqua distillata. Aggiungere quindi 10 ml di una soluzione di micro Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20

7 GN 0.1 MnSO4 5H2O 0.05g Ammonio Tartrato 10 g Aggiungere quindi 10 ml di una soluzione di micro Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 GN4 MnSO4 5H2O 0.05g Ammonio Tartrato 10 g 4 g

8 Aggiungere quindi 10 ml di una soluzione di micro Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 GN 0.44 MnSO4 5H2O 0.05g Ammonio Tartrato 10 g 0.44 g Unire tutti i reagenti in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1L di acqua distillata. Aggiungere quindi 10 ml di una soluzione di micro Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 HAGEM MgSO4 * 7H2O NH4Cl FeCl3 * 6H2O 0.5 ml di una soluzione 1% 5 g 5 g Tiamina 0.05 g Biotina 0.00 Unire tutti i reagenti, tranne gli antibiotici, in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1 L di acqua distillata. Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al Lasciare raffreddare e aggiungere in ambiente sterile la soluzione di antibiotici precedentemente sterilizzata tramite filtrazione (20 µm). HAGEM addizionato di antibiotici

9 NH4Cl FeCl3 6H2O 0.5ml di una soluzione all 1% 5 g 5 g Tiamina 0.05 g Biotina 0.00 Cloramfenicolo 0.05 g Streptomicina 0.0 Unire tutti i reagenti, tranne gli antibiotici, in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1L di acqua distillata. Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al raggiungimento di una soluzione omogenea. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Lasciare raffreddare e aggiungere la soluzione di antibiotici precedentemente sterilizzata tramite filtrazione (20 µm). M102 per endofiti delle Poaceae MgSO4 raggiungimento di una soluzione omogenea e quindi portare il ph a 6.00 utilizzando NaOH 10 N. Aggiungere di miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al Referenze bibliografiche: C.W. Bacon Appl.Envir.Microb. 54: M102 per endofiti delle Poaceae addizionato di antibiotici MgSO4 Cloramfenicolo 0.05 g Unire tutti i reagenti, tranne gli antibiotici e l, in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1 L di acqua distillata. Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al raggiungimento di una soluzione omogenea e quindi portare il ph a 6.00 utilizzando NaOH 10 N. Aggiungere l e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al raggiungimento di

10 una soluzione omogenea. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Lasciare raffreddare e aggiungere in ambiente sterile la soluzione di antibiotici precedentemente sterilizzata tramite filtrazione (20 µm). M g Unire tutti i reagenti in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1L di acqua distillata. raggiungimento di una soluzione omogenea. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 M g Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al raggiungimento di una soluzione omogenea. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 M40Y Estratto di lievito 5 g 400 g Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al MPGT Trealosio 5 g 2.5 g

11 Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al Oats (OA) Fiocchi di avena Fare bollire, a fuoco lento, utilizzando una pentola e un becco bunsen, i fiocchi di avena in 1 L di H2O distillata per 2 ore. Trascorse le 2 ore filtrare il tutto utilizzando un colino da cucina. Riportare al volume di 1 litro e quindi aggiungere di. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 PIAM vitaminizzato P.I.A.M. Petone FeCl3 (Vecchi e PIAM) 0. tracce 16 g PIAM glicerolo (PIAM Gly) vitaminizzato P.I.A.M. (Vecchi e PIAM) Petone 0. FeCl3 tracce 16 g Glicerolo 50 g Aggiungere un ancoretta magnetica e miscelare bene con l ausilio di un agitatore magnetico, fino al Phytone Yeast Extract (PYE) Phytone Estratto di lievito 40 g 5 g

12 raggiungimento di una soluzione omogenea Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 Potate Glucose (PGA) Potato Glucose (Fluka cat n ) 39 g Porre i 39 g in una bottiglia in vetro pirex da un litro e aggiungere 1 L di acqua distillata. Sabouraud 10 g 40 g raggiungimento di una soluzione omogenea. Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 min SINT MnSO4 5H2O 0.05g Ammonio Tartrato 40 g Aggiungere quindi 10 ml di una soluzione di micro Sterilizzare a 121 C in autoclave per 20 V8

13 Minestrone congelato CaCO3 300 g 2g Fare bollire il minestrone in 1 L di H2O distillata per 20min a fuoco lento, utilizzando una pentola e un becco bunsen. Filtrare il minestrone con un colino da cucina. Riportare al volume di 1 L e quindi aggiungere di CaCO3 e aggiustare il ph a Aggiungere di e sterilizzare a 110 C in autoclave per 30 Yeast Extract Sucrose (YES) MgSO4 7 H2O CuSO4 5H2O g ZnSO4 7H2O