Dott. Valter Tandoi 1

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1 27,28/1/216 PALERMO Sommario Università degli Studi di Università degli Università degli Napoli Federico II Studi di Palermo Studi di Salerno Introduzione Problemi operativi ovunque La descrizione del fango attivo mediante microscopia ottica Composizione microbica e caratteristiche della biomassa dei sistemi : confronti e conseguenze di processo Dall approccio tradizionale a quello biomolecolare: Isolamento e coltivazione Identificazione mediante FISH PCR e Sequenziatori di Nuova Generazione (NGS) Confronti Sistemi e : Tramite metodi Fingerprint Tramite NGS Dr. V. Tandoi, C. Levantesi, L. Luprano CNR-IRSA Roma Palermo, ottobre 216 Considerazioni conclusive Identificazione Quantificazione Funzione Collocazione Dott. Valter Tandoi 1

2 27,28/1/216 PALERMO Type 21 N (Dick Eikelboom, 1975) Thiothrix eikelboomii (1999) a gamma-proteobacterium Schiuma biologica da: Microthrix parvicella Eikelboom nel 1975 definisce 2 morphotypes: possono essere identificati mediante microscopia ottica (in base alla morfologia) Schiuma biologica da: Nocardioformi Isolamento diretto mediante micromanipolazione, RCEES- visiting PhD student at IRSA-CNR: Niansi Fan Isolamento di Microthrix parvicella da WWPTs Cinesi Monterotondo, Novembre 215 Dott. Valter Tandoi 2

3 27,28/1/216 PALERMO The UE Project DYNAFILM Team (Groningen, NL, oct 22) DYNAFILM Dynamic of filamentous bacteria in Industrial Systems (22-25) Avvento della Tassonomia molecolare delle sonde biomolecolari Consente di ricostruire i rapporti evolutivi fra tutti gli organismi viventi che nel corso del tempo hanno generato, a partire dal comune organismo primigenio, l enorme varietà del mondo vivente Il gene scelto nell ambito del DNA è quello che codifica l acido ribonucleico (RNA) contenuto nei ribosomi (RNA ribosomiale) RNA ribosomiale 16 S Albero filogenetico costruito mediante l analisi comparativa di circa 18 sequenze di rrna 16S che riporta le principali suddivisioni dei dominii Bacteria ed Archaea Dott. Valter Tandoi 3

4 27,28/1/216 PALERMO COSTRUZIONE DI SONDE SPECIFICHE FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Fasi principali SONDA SPECIFICA PER I BATTERI BACTERIA COMUNITA MICROBICA FISSAGGIO IBRIDAZIONE sonda oligonucleotidica marcata MICROSCOPIA AD EPIFLUORESCENZA RNA ribosomiale ARCHAEA Vantaggi EUCARYA Specificità Analisi in situ Tempi rapidi di applicazione Non necessita della coltivazione Filamentous Alphaproteobacteria a b c d Tabella 1: Principali sonde molecolari attuaimente disponibili per alcuni microrganismi importanti nell ambito dei sistemi di trattamento delle acque di scarico. Sono riportate le sequenze, i1 sito specifico di attacco delle sonde sull rrna e la percentuale di formammide utilizzata nella reazione di ibridazione III I Microrganismo Sonda Sequenza della sonda Bersaglio e posizione * % formammide Riferimento Universale UNI1392 ACGGGCGGTGTGTRG 16S, Olsen et al., 1986 e II f g III h Eubatteri EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT 16S, Amann et al., 199 Archea ARC915 GTGCTCCCCCGCCAATTCCT 16S, Stahl & Amann, 1991 Proteobatteri Sottoclasse α ALF1b CGTTCGYTCTGAGCCAG 16S, Manz et al., 1992 Sottoclasse β BET42a GCCTTCCCACTTCGTTT 23S, Manz et al., 1992 Sottoclasse γ GAM42a GCCTTCCCACATCGTTT 23S, Manz et al., 1992 M. parvicella MP222 GCCGCGAGACCCTCCTAG 16S, Erhart et al., 1997 Thiothrix nivea TN1 CTCCTCTCCCACATTCTA 16S, Wagner et al-, 1994a i J k II l H. hydrossis HHY GCGTACCTCAACCTGATT 16S, Wagner et al., 1994a Type 21N 21N TCCCTCTCCCAAATTCTA 16S, Wagner et al., 1994a S. natans SNA CATCCCCCTCTACCGTAC 16S, Wagner et al., 1994a Acinetobacter sp. ACA ATCCTCTCCCATACTCTA 16S, Wagner et al., 1994b Batteri nitricanti: Nitrosomonas, Nitrococcus NEU23a CCCCTCTGCTGCACTCTA 16S, Wagner et al m n o p a-b) probe PPx3-1428; c-d) probe MC2-649; e-f ) probe Noli-644; g-h) probe Sita-649; i-j) probe Combo-131; k-l) probe Cate-113; m-n) probe EU12-645; o-p) probe EU The scale bar indicates 1 mm. Nitrosomonas, Nitrococcus Nso1225 CGCGATTGTATTACGTGTGA 16S, Mobarry et al., 1996 Nitosolobus, Nitrosovibrio, Nitrosospira e Gallionella Nitrobacter spp. NIT2 CGGGTTAGCGCACCGCCT 16S, Wagner et at Nitrobacter spp. NIT3 CCTGTGCTCCATGCTCCG 16S, Wagner et at Batteri denitrificanti: Pseudomonas spp Ps GCTGGCCTAGCCTTC 23S, Schleifer et al., 1992 Paracoccus spp. PAR651 ACCTCTCTCGAACTCCAG 16S, Neef et al., 1996 Paracoccus spp PAR1244 GGATTAACCCACTGTCACC 16S, Neef et al., 1996 Paracoccus spp PAR1457 CTACCGTGGTCCGCTGCC 16S, Neef et al., 1996 Paracoccus denitrificans Pdv198 CTAATCCTTTGGCGATAAATC 16S, Neef et al., 1996 Paracoccus denitrificans Pdv131 CCTGTCTCCAGGTCACCG 16S, Neef et al., 1996 * secondo la numerazione di E. coli in Brosius et al., 1978 Dott. Valter Tandoi 4

5 27,28/1/216 PALERMO Elucidazione della composizione della biomassa con Full cycle r-rna approach Biomass Nuove sonde FISH Estrazione DNA Genbank sequence The phenomenal growth of sequence data in GenBank is challenging to manage, and continues unabated. Definizione sonde Specifiche PCR CCAGGTTTCCGAAGC Sequenziamento Analisi clonale Clonaggio 28, Nature Education qpcr Stima quantitativa del gene di interesse, e quindi del microrganismo target Metodiche fingerprinting Stima semi-quantitativa dell abbondanza di ogni variante genica PCR-DGGE PCR-TGGE T-RFLP Dott. Valter Tandoi 5

6 27,28/1/216 PALERMO Applicazione della FISH nel WWT 1. Identificazione dei gruppi microbici funzionali: Nitrifiers Polyphosphate accumulating bacteria (PAO) Glycogen accumulating bacteria (GAO) Anammox microorganisms Denitrifiers PHA accumulating bacteria BIOFOULERS?????????? 2. Identificazione dei «fastidious bacteria»: Filamentous bacteria: bulking and foaming Analisi comunità microbiche impianti ed Obiettivo: Analisi comunità microbiche in impianti in confronto a quelle di impianti tradizionali a fanghi attivi ( ) attività della biomassa (Metodica FISH, rapporto EUB/DAPI) presenza di batteri filamentosi (Analisi morfologica) struttura e dimensione fiocchi (Analisi morfologica) popolazione di batteri nitrificanti (quantificazione mediante FISH ) IMPIANTI DI TRATTAMENTO IN SCALA REALE SITUATI IN ZONA TURISTICA E SOGGETTI A VARIAZIONI STAGIONALI DEL CARICO impianto con membrane a fibre piane Kubota,4 µm (microfiltrazione) CAPRI/ ANACAPRI impianto con membrane a fibre cave Siemens,4 µm (ultrafiltrazione) le caratteristiche della biomassa di questi sistemi sono state confrontate con quelle di impianti convenzionale situati in zone limitrofe ( Sorrento e Capri/ Anacapri ) Struttura e dimensione dei fiocchi Attività della biomassa: % Eub/Dapi / /CAPRI-ANACAPRI Attivita' biomassa EUB/DAPI Sorrento gennaio marzo aprile ( % EUB/DAPI) ( % EUB/DAPI) Gennaio 7,2 ±,8 51,7 ± 1,7 Marzo 7, ± 2, 62,2 ± 3,1 Aprile 76,8 ± 1,5 69,4 ± 2,9 BIOMASSA POCO AGGREGATA i batteri sono organizzati prevalentemente in fiocchi piccoli ( <5/1µm) irregolari e deboli MORFOLOGIA E STRUTTURA VARIA i batteri sono organizzati sia in fiocchi piccoli ( <5-1µm) che in aggregati di grandi dimensioni ( >5/1µm) o compatti e fermi o irregolari e deboli Attivita' biomassa EUB/DAPI Capri-Anacapri gennaio marzo aprile CAPRI -ANACAPRI ( % EUB/DAPI) ( % EUB/DAPI) Gennaio 64,1 ±,9 41,3 ±,2 Marzo 63,8 ±,9 48,8 ±,8 Aprile 7,2 ± 1,8 54,2 ± 1,2 BioMAc 213 Caratteristici fiocchi di fango attico di medie dimensioni fermi arrotondati e compatti La caratteristiche dei fiocchi dei due impianti a membrana sono differenti da quelle di un fango, con buona capacità di sedimentazione, di un impianto a fanghi attivi convenzionale Non si osserva uniformità tra i due impianti per la struttura e dimensione dei fiocchi Differentemente da quanto solitamente noto si osservano aggregati di grandi dimensioni nell impianto di capri anacapri BioMAc 213 In accordo con i dati di letteratura si osserva in media una attività di della biomassa più ridotta negli (54,6%) rispetto ai (69,2 % ) Analogamente si osserva per ogni campionamento un attività della biomassa dell inferiore rispetto a quella del corrispondente Tuttavia nel campionamento di aprile si osservano nell di Sorrento livelli di attività maggiori di quelli riscontrati in uno degli impianti convenzionali ( di Capri Anacapri) Dott. Valter Tandoi 6

7 27,28/1/216 PALERMO Abbondanza filamentosi Batteri nitrificanti CAPRI-ANACAPRI abbondanzafilamentosi abbondanzafilamentosi gennaiofebbraio marzo aprile giugno Fanghi Nocardia gennaiofebbraio marzo aprile giugno Schiume abbondante presenza di nocardioformi (max abb.6) nocardioformi (max abb. 4) Tipo 92 Tipo 581 Tipo 41 nocardia abbondanzafilamentosi abbondanzafilamentosi Fanghi Tipo 92 Tipo 581 gennaio febbraio marzo aprile giugno tipo41 gennaiofebbraio marzo aprile giugno Schiume nocardioformi tipo 41 (max abb. 5-6) Si osserva una notevole presenza di filamentosi negli impianti Non si riscontra uniformità tra gli impianti per il tipo di filamentoso presente In accordo con la recente letteratura viene confermata la presenza di schiume ( nocardia) nei sistemi CAPRI ANACAPRI Batteri ammonioossidanti (AOB) Batteri nitrito-ossidanti (NOB) Nitrobact er Gennaio 2,3 ±,5 9, ± 1,5 <,1 Marzo 2,6 ±,1 1,1 ± 1, <,1 Aprile 1,2 ±,4 9,1 ± 1,2 <,1 Batteri ammonioossidanti (AOB) Batteri nitrito-ossidanti (NOB) Nitrobact er Gennaio 3,3 ± 1,1 7,8 ±,3 <,1 Marzo 1,8 ±,9 1,5 ± 1,6 <,1 Aprile,2 ±,1 11,4 ± 1,8 <,1 CAPRI ANACAPRI Batteri ammonioossidanti (AOB) Batteri nitrito-ossidanti (NOB) Nitrobacter Gennaio 3,7 ±,9 <,1 <,1 Marzo 7,5 ±,4,3 ±, <,1 Aprile,9 ±,1 <,1 <,1 Batteri ammonioossidanti (AOB) Batteri nitrito-ossidanti (NOB) Nitrobacter Gennaio 11,3 ±,2 3,2 ±,5 <,1 Marzo 9,1 ±,7 6,3 ±,1 <,1 Aprile 1, ±,8 7,3 ±,8 <,1 Batteri totali Batteri totali AOB La tecnica FISH ha permessso la quantificanzione dei nitrificanti negli impianti ed caratteristica degli impianti è una più elevata concentrazione di nitrito ossidanti ( nitrospira) nitrobacter non è stato riscontrato in nessun impianto 2µm 2µm Anni 21 New Generation Sequencer Illumina Schema di funzionamento di un Sequenziatore di Nuova Generazione che produce una «sequencing library»: a) supporto;b) adaptors; c) frammenti di DNA Mappa con i 1 più abbondanti Generi batterici riscontrati in un impianto pilota ed uno convenzionale ( e ), Ziegler et al. 216 Dott. Valter Tandoi 7

8 27,28/1/216 PALERMO Four hollow-fiberultrafiltration membranes (pore sizes ~.1 mm) at 1, 1, 2 and 3 days of operation, (EPS) accumulated extracted and characterized by: - TCH, LC-OCD), - fluorescence excitation - emission matrices (FEEM), - Fourier transform infrared (FTIR) and -CLSM). - TMP quickly stabilized with higher values for the hydrophobic membranes than hydrophilic - The same type of organic foulants; shifted from protein towards polysaccharides dominance Nonmetric multidimensional scaling of LC-OCD data showed that biofilm samples clustered according to the sampling event (time) regardless of the membrane surface chemistry (hydrophobic or hydrophilic) or operating mode (with or without permeate flux). - These results suggest that: - EPS composition may not be the dominant parameter for evaluating membrane performance - possibly other parameters such as biofilm thickness, porosity, compactness and structure should be considered in future studies for evaluating the development and impact of biofouling on membrane performance. Conclusioni La microscopia tradizionale fornisce in via speditiva informazioni sulla presenza di batteri legati alla formazione di schiume biologiche. La tecnica FISH permette di visualizzare e quantificare importanti cluster di batteri rilevanti (Poly-P, Nitrifiers, etc.) Complete caratterizzazioni microbiche passano attravreso l impiego dei moderni Sequenziatori di Nuova Generazione (NGS Illumina). I risultati pero devono essere confermati tramite FISH. Caratterizzazioni microbiologiche tramite NGS (Ziegler et al 216) mostrano similarita tra biomassa dei e del nonché del biofilm che si forma. Poco è tuttora noto sui meccanismi di produzione dei biofoulants e sulla loro correlazione con le specie microbiche che li producono Dott. Valter Tandoi 8

9 27,28/1/216 PALERMO Grazie per la vostra Attenzione!!!!!!! Dott. Valter Tandoi 9