Commissione Studi Biologici

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Aureliana Speranza
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Commissione Studi Biologici FIL-MRD Network Pier Paolo Piccaluga Ilaria Del Giudice, Sara Galimberti, Simone Ferrero, Marco Ladetto Marzia Cavalli, Elena

1 Commissione Studi Biologici FIL-MRD Network Pier Paolo Piccaluga Ilaria Del Giudice, Sara Galimberti, Simone Ferrero, Marco Ladetto Marzia Cavalli, Elena Ciabatti, Irene Della Starza, Luciana De Novi, Anna Gazzola, Elisa Genuardi, Susanna Grassi, Claudia Mannu, Barbara Mantoan, Riunione Nazionale FIL 2-4 Ottobre 2014, Rimini

2 Scopi di FIL MRD NETWORK Armonizzazione delle tecniche per la malattia minima residua (MRD) nei linfomi Necessità di Quality Control (QC) standardizzato interlaboratorio Possibilità di analisi comparativa di MRD in studi differenti condotti da FIL

3 FIL-MRD NETWORK MRD del linfoma follicolare - PCR qualitativa (nested PCR) - PCR quantitativa (RQ-PCR) MRD del linfoma mantellare IGH@ - PCR qualitativa (nested PCR) - PCR quantitativa (RQ-PCR) Studi FIL con previsione di arruolamento > 100 pazienti (studi fase III) Facility a disposizione, se richiesto, anche per studi con <100 pazienti (fasi I/II)

4 Laboratori di FIL MRD NETWORK BLUE LAB Ematologia 1 - Torino PINK LAB Ematologia - Pisa Referente scientifico: S. Ferrero Referente tecnico: B.Mantoan YELLOW LAB Ematologia - Bologna Referente scientifico: S. Galimberti Referente tecnico: E. Ciabatti GREEN LAB Ematologia RM Sapienza Referente scientifico: P.P.Piccaluga Referente tecnico: A. Gazzola Referente scientifico: I. Del Giudice Referente tecnico: I. Della Starza

5 FIL MRD NETWORK Torino Pisa Bologna Roma

6 Quality Control (QC) di FIL MRD NETWORK QC Inverno/Primavera QC Autunno Febbraio 2010 QC1- Novembre 2014: QC10

7 Le nostre Tasks Task 1 FL, MCL Task 2 FL Task 3 FL Task 4 MCL

8 Task 1 Interpretazione risultati qpcr secondo le linee guida europee - ESG-MRD-ALL Sensibilità e Range quantitativo Curva standard: - slope - Coefficiente di Correlazione Esito

9 QC TREND - TASK QC1 QC2 QC3 QC4 QC5 QC6 QC7 QC8 QC9

11 QC TREND - TASK 2/ QC1 QC2 QC3 QC4 QC5 QC6 QC7 QC8 QC9 0 QC1 QC2 QC3 QC4 QC5 QC6 QC7 QC8 QC9 TASK 2 NESTED PCR TASK 3 RQ-PCR

Task 4 VALUTAZIONE DELLA MRD NEL LINFOMA MANTELLARE PCR QUALITATIVA PCR QUANTITATIVA L FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 Consensus primer 5 Consensus primer 3 primer 5 specific patient consensus probe

12 Task 4 VALUTAZIONE DELLA MRD NEL LINFOMA MANTELLARE PCR QUALITATIVA PCR QUANTITATIVA L FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 Consensus primer 5 Consensus primer 3 primer 5 specific patient consensus probe derived from FR3 R Q primer 3 specific patient FIRST PCR NOT SPECIFIC-TUMOR L FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 L FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 primer 5 specific patient primer 3 specific patient SECOND PCR SPECIFIC-TUMOR

13 QC TREND - TASK QC1 QC2 QC3 QC4 QC5 QC6 QC7 QC 8 QC9 0 QC1 QC2 QC3 QC4 QC5 QC6 QC7 QC8 QC9 Q-PCR NESTED PCR

14 SVILUPPI TECNOLOGICI.

15 TASK 5 Studio dei RIARRANGIAMENTI MINORI associati alla traslocazione (14;18) nei LF

16 RIARRANGIAMENTI MINORI FLAZ12 Marker identified by minor rearrangements : 3/12 (25%) Patients BCL2/IGH negative Ongoing MBR dist 3 MBR 5 mcr/a 5 mcr/b Blue Lab Green Lab Yellow Lab Pink Lab Tot = 19

17 RIARRANGIAMENTI MINORI FOLL12 Marker iden*fied by minor rearrangements : 6/25 (24%) Patients Bcl2/IgH negative Ongoing MBR dist 3 MBR 5 mcr/a 5 mcr/b Blue Lab Green Lab Yellow Lab Pink Lab Tot = 43

18 Droplet Digital PCR

19 Droplet Digital PCR USAGE: DNA/RNA ABSOLUTE QUANTIFICATION COPY NUMBER VARIATION RARE SEQUENCE DETECTION MUTATION DETECTION GENE EXPRESSION UPSTREAM AND DOWNSTREAM OF NGS (NGS library quantitation and sequence, validation SNPs & SNV) ADVANTAGE: NO NEED TO RELY ON REFERENCE OR STANDARDS HIGH PRECISION ACCESS TARGETS AT LOW TEMPLATE CONCENTRATIONS HIGHLY TOLERANT TO INHIBITOR HIGH PRECISION MEASURE OF EXTREMELY LOW CONCENTRATION OF TARGET IN A COMPLEX BACKGROUND SMALL FOLD CHANGE DISCRIMINATION (+/-- 10%)

Droplet Digital PCR Possibili applicazioni: Quantificazione ASSOLUTA DNA/RNA Identificazione di: CNVs Mutazioni Target rari GEP Validazione study NGS Upstream (library) Downstream (SNVs) Vantaggi No

20 Droplet Digital PCR Possibili applicazioni: Quantificazione ASSOLUTA DNA/RNA Identificazione di: CNVs Mutazioni Target rari GEP Validazione study NGS Upstream (library) Downstream (SNVs) Vantaggi No Reference o standards Altissima precisione Accesso a targets estremamente diluiti Misurazione accurata di target diluiti in un background complesso: discriminazione con basso fold change (+/- 10%) Alta tolleranza ad inibitori

22 Droplet Digital PCR Proposta: integrazione della DD-PCR nella valutazione della MRD in studi clinici FIL-NETWORK di fase II: R2B!!

23 NEXT GENERATION SEQUENCING FIL- NETWORK Gazzola A et al, Ther Adv Hematol Apr;5(2):35-47

24 in EUROPA

25 in ITALIA FIL MRD Network lab: BLUE LAB YELLOW LAB GREEN LAB PINK LAB MiSeq Illumina MiSeq Illumina 454 Junior Roche MiSeq Illumina Introdurre NGS nel FIL MRD Network a partire dal QC11 Testare KIT Invivoscribe kit LymphoTrack TM IGH Assay vs. in house protocols

26 Grazie!!!!

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