Sandro Spezia Claudio Bettinelli Kosmosnet. La Gestione della strumentazione secondo la UNI EN ISO 10012:2004 Padova - 5 Aprile 2011

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1 Applicazione del concetto di conferma metrologica nel laboratorio chimico alla luce della UNI 10012:2004 e delle richieste dei metodi di prova ufficiali: esempio dell ICP-MS nell analisi di metalli in tracce Sandro Spezia Claudio Bettinelli Kosmosnet La Gestione della strumentazione secondo la UNI EN ISO 10012:2004 Padova - 5 Aprile

2 Presentazione di quattro metodi relativi alla determinazione di metalli in traccia mediante ICP-MS ISO/DIS (2005) EPA 6020A (2007) Standard methods 3125 A (1997) ASTM D I metodi saranno esaminati unicamente dal punto di vista della verifica iniziale della linearità e della verifica intermedia di taratura 2

3 Terminologia : q ICB: Initial Calibration Blank q ICV: initial Calibration Verification q LLICV: Low Level Calibration Verification q CCB: Continuos Calibration Blank q CCV: Continuos Calibration Verification q MDL : Method Detection Limit MDL = t x s t = valore del t di Student s = deviazione standard sulle misure The minimum concentration of an analyte that can be identified, measured, and reported with 99% confidence that the analyte concentration is greater than zero q R 2 : Coefficente di correlazione 3

4 1. Ottimizzazione stumentale Aggiustamento dei parametri strumentali dell ICP-MS secondo I parametri forniti nel manuale costruttori. Prima di ogni serie di analisi la sensibilità e la stabilità strumentale del sistema deve essere controllata utilizzando una soluzione di ottimizzazione. Controllare la risoluzione e la calibrazione delle masse con la frequenza richiesta nel manuale costruttori. 4

5 2. Verifica della risposta lineare Alla prima valutazione del sistema analitico e a intervalli successivi, determinare la risposta lineare per ogni elemento usando almeno cinque punti. (per esempio un bianco e quattro soluzioni di taratura) Per ogni punto della taratura devono essere effettuate almeno due repliche Criterio di accettabilità della regressione R 2 > FIT q Lineare semplice VS q Lineare pesata Disomogeneità nelle varianze delle misure degli standard di taratura Difficile da effettuare correttamente Produce errori alle piu basse concentrazioni della curva di taratura (multipli dell MDL) La deviazione standard deve essere conosciuta ad ogni livello di concentrazione 5

6 3. Taratura giornaliera Buoni risultati sono ottenibili con una taratura a due punti Un pre-requisito per l efficacia della taratura a due punti é l accurata preparazione delle soluzioni Bianco VS acqua (non acidificata) grado 1 in accordo con la ISO 3696 Standard alto VS Soluzione di controllo della taratura 4. Controllo di accettabilità Medie independenti SRM ICV e ICB non definiti CCV e CCB non definiti 5. Controllo di qualità (per batch analitico) Campione di controllo interno nel range della linearità 6

7 EPA 1. Ottimizzazione stumentale Aggiustamento dei parametri strumentali dell ICP-MS secondo I parametri forniti nel manuale costruttori. 2. Verifica della risposta lineare Da un minimo di tre a preferibilmente cinque differenti standard all interno del range scelto. Per essere considerata accettabile la curva per la verifica della risposta lineare deve presentare un coefficente di correlazione R 2 >

8 3. Taratura giornaliera Buoni risulti sono ottenuti con una taratura a due punti Bianco Uno standard medio nell intervallo delle concentrazioni 4. Controllo di accettabilità ICV: medio livello nella curva di taratura In aggiunta, LLICV : standard a basso livello ICB bianco di calibrazione iniziale criterio di accettabilità : ± 10% del valore vero criterio di accettabilità ± 30% del valore vero criterio di accettabilità MDL

9 Sia la taratura a due punti che per la multi punto devono essere verificate alla fine della sequenza di analisi e ogni 10 campioni attraverso i due parametri: CCV CCB criterio di accettabilità ±10% del valore vero criterio di accettabilità < MDL per ogni analita scelto LLCCV criterio di accettabilità ± 30% del valore vero (per analisi di campioni a basse concentrazioni) 5. Controllo di qualità (per batch analitico) Standard interno Materiale Standard di Riferimento (SRM) Laboratory Control Sample (LCS) Spiked matrix MS / spiked matrix duplicate MSD criterio di accettabilità 70% ± 20% ± 20% precisione e accuratezza ± 20%

10 Standard methods (1997) 1. Ottimizzazione stumentale Aggiustamento dei parametri strumentali dell ICP-MS secondo I parametri forniti nel manuale costruttori. 2. Verifica della risposta lineare Concentrazioni consigliate per gli Standard: 0, 5, 10, 20, 50, 100 ppb Per l accettabilità della linearità: coefficiente di correlazione idealmente > Taratura giornaliera L impiego di un numero inferiore di standard e consigliato, in particolare con una taratura a due punti composta da: Bianco Standard a medio-livello 10

11 4. Controllo di accettabilità Immediatamente dopo la curva di taratura analizzare criterio di accettabilità ICV Standard a medio-livello 10% acceptance LLICV ICB Standard a basso-livello (solo se le concentrazioni analizzate sono inferiori a 5 ppb) Initial Calibration blank < MDL 5. Controllo continuo di accettabilità CCV CCB ±10% del valore vero < MDL (per ogni analita) 11

12 1. Ottimizzazione stumentale Aggiustamento dei parametri strumentali dell ICP-MS secondo I parametri forniti nel manuale costruttori. 2. Verifica della risposta lineare Sono raccomandati almeno tre standard e un bianco. Uno degli standard deve essere da tre a cinque volte l MDL Per l accettabilità deve risultare un coefficente di correlazione R 2 > Taratura giornaliera Non prevede una taratura giornaliera a meno di tre punti e il bianco 12

13 4. Controllo di accettabilità ICV e ICB non definiti 5. Controllo continuo di accettabilità CCV, con frequenza del 10 % e alla fine della sessione criterio di accettabilità 90 % -110 % del valore vero CCB, con frequenza del 10 % e alla fine della sessione < 2.2 MDL 6. Controllo di qualità (per batch analitico) un QCS alla fine della sessione di analisi per verificare la taratura strumentale. ± 10 % Standard interno 60% - 120% 13

14 Tabella di comparazione ISO/DIS EPA 6020A SM 3125 A ASTM D Ottimizzazione strum. Si, secondo le specifiche fornite dal costruttore Verifica linearità Numero livelli Criterio di accettabilità R 2 > R 2 > R 2 > R 2 > frequenza Strumento nuovo, dopo manutenzione importante, perdita linearità Taratura giornaliera Blk Std Blk + 1 Std Blk + 1 Std non previsto Criterio di accettabilità non previsto ICB < MDL ICV ± 10% ICB < MDL ICV ± 10% non previsto LLICV ±30% non previsto CCVB < MDL CCV ± 10% CCVB < MDL CCV ± 10% CCVB < 2.2 MDL CCVB < MDL Quality control (per sessione di analisi) Istrd Internal control sample LLCCV ±30% Isdt 70% LCS ± 20% SRM % QCS ± 10% 143

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16 RIASSUMENDO q Ottimizzazione strumentale q Verifica della linearità della risposta strumentale Primo utilizzo Manutenzione significativa Perdita della linearità Criterio di accettabilità R 2 > q Taratura giornaliera Bianco standard q Controllo Taratura iniziale, subito dopo la taratura continuo, con una frequenza del 10% ICV (± 10%) LLICV (± 30%) ICB (<MDL) CCV (± 10%) LLCCV (± 30%) LLCCV (± 30%) 16

17 Taratura Esempio della taratura del Tm in una matrice ultra pura (carote di ghiaccio dell Himalayia) Dati d ingresso Conc /ppt Signal / Cps regressione Y = bx + a b = retta perfetta y = 2499,7x - 197,87 R² = 0,99997 a = -197,87 R 2 = Signal / Cps Conc /ppt 17

18 Taratura R 2 ha sempre significato? regressione Modificando il dato di ingresso manteniamo invariate le y, ma cambiamo il dato x del primo punto da 0,4 a 0,1 (400% di errore!) mantenendo inalterati gli altri: Si ottiene pur sempre un ottimo r 2 Conc /ppt Signal / Cps Y = bx + a b = a = 156,8 R 2 =

19 Peggiorando la curva ma mantenendo valido secondo I metodi il coefficiente di correlazione R 2 > Dati d ingresso Conc /ppt Signal / Cps regressione Y = bx + a b = punti modificati y = 2369,3x + 438,24 R² = 0,9984 a = R 2 = Signal / Cps Conc / ppt 19

20 Confronto risultati: incertezza della linearità ed errore assoluto sul livello più basso R 2 = Conc /pg/g Signal / Cps Y calc X calc ulin rel R 2 = Conc /pg/g Signal / Cps Y calc X calc ulin rel

21 Aumentando il range delle concentrazioni Dati d ingresso Conc /ppt Signal / Cps regressione Y = bx + a b = Signal / Cps range più ampio y = 2381,1x + 428,61 R² = 0, ,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 ppt a = R 2 = Y calc X calc ulin rel

22 Confronto risultati: incertezza sulla linearità ed errore assoluto sul livello più basso R 2 = u S b ( y y ) 1 i reg + + m n b SSx y / x 1 lin = 2 2 Conc /pg/g Signal / Cps Y calc X calc ulin rel R 2 = Conc /pg/g Signal / Cps Y calc X calc ulin rel

23 Esempio 2 incertezze di taratura Concentrazione Inc taratura % 6,66 2,74 1,81 1,41 1,26 r = 0,99963 r = 0,9979 Concentrazione Inc taratura % 5 15, , , , ,99

24 Esempio 2 bis incertezze di taratura con range allargato Concentrazione Inc taratura % 5 45, , , , ,53 r = 0,99963 r = 0, Concentrazione Inc taratura % 5 93, , , , ,2

25 Come diminuire l incertezza di taratura? Restringere il range di taratura Aumentare il numero di punti Migliorare la correlazione tra i punti Oppure Ridurre i punti di taratura ed aumentare i controlli

26 Come diminuire l incertezza di taratura? Stabilità Estratto dal manuale di pre- installazione di un produttore di ICP- MS Queste sono le condizioni ambientali per poter assicurare le prestazioni indicate nelle brochure ufficiali della ditta

27 Taratura ad un punto presuppos teorici

28 Taratura ad un punto The main conclusion drawn from this study is that the number of standards used for calibration in ICP-MS is not a critical parameter in relation to the quality of the results, and multiple-point calibration should not be considered better than doublepoint calibration, at least from an statistical point of view. There is, however, no reason to reject multi-point calibration, since calibration with more than one standard allows to detect gross operational errors.

29 Evitare e controllare. gross opera onal errors Controllo con second source (Initial Calibration Verification - ICV) Controllo con CRM o LCS laboratory Control Sample Verifica delle prestazioni strumentali (GLP) Questi controlli sono indispensabili e indipendenti dal numero di punti utilizzato per la taratura

30 Verifica delle prestazioni strumentali vs criteri di accettabilità della taratura: il solo parametro r 2 non è sufficiente

31 Esempio di specifiche di un costru ore

32 Linee Guida UNICHIM Le verifiche periodiche (in particolare sensibilità o rapporto segnale/background) possono essere utili indicatori di trend e valutate mediante carte di controllo

33 Conclusioni Nella pratica comune di taratura si tende ad esagerare il numero di punti nella convinzione che questo ci dia maggiore affidabilità I criteri per verificare la bontà delle tarature possono non sempre essere affidabili. (r 2 da indicazioni parziali) Dobbiamo spostare la nostra attenzione dalla taratura in sé ai criteri di accettabilità, al controllo e alla verifica della taratura stessa Una procedura completa della taratura intesa in questo modo non potrà quindi prescindere dalla verifica delle prestazioni strumentali, che dovranno essere monitorate costantemente Nel caso specifico dell ICPMS i metodi indicano come possibile la taratura ad un punto, in ogni caso è conveniente operare con il minimo dei punti possibili