Unità tecnica UTAGRI Laboratori INN e GEN

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1 Unità tecnica UTAGRI Laboratori INN e GEN FOODFLAVOUR PL 77.2 Metodologie diagnostiche innovative per la caratterizzazione delle comunità microbiche Responsabile: Annamaria Bevivino Partecipanti: Patrizia Paganin, Claudia Dalmastri, Patrizia De Rossi, Antonella Del Fiore, Francesca Lecce, Alessia Fiore, Elio Fantini, Giulio Gianese, Giovanni Giuliano Collaboratori esterni: Alessio Mengoni (Università di Firenze)

2 DISEGNO SPERIMENTALE METODI COLTURA DIPENDENTI Semina su terreno agarizzato PCA Incubazione a 27 C per 48-78h Conta colonie batteriche Analisi della struttura delle comunità batteriche METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE (metodi molecolari) Real time PCR: quantificazione del DNA batterico T-RFLP: analisi della struttura delle comunità batteriche Metagenomica: determinazione della contaminazione batterica totale mediante sequenziamento (MiSeq) P. De Rossi, A. Del Fiore F. Lecce A. Bevivino, C. Dalmastri P. Paganin A. Fiore, E. Fantini G. Gianese G. Giuliano

3 PACKAGING DISEGNO SPERIMENTALE INNOVATIVI PACKAGING C PPAFMO40 PACKAGING A PPAFMO30 Lattughino (Lactuca sativa L.) prodotto dalla company Linea Verde SpA Tre packaging, con differenti permeabilità ai gas e proprietà anti-fog (prevenzione condensazione) Campionamento a 1, 3, 6, 8 e 10 giorni dal confezionamento 3 buste (repliche) per ciascun campione (packaging/giorno) STANDARD PACKAGING F PPCX30 AFM I (1 ) II (3 ) III (6 ) IV (8 ) V (10 ) A 1,2,3 4,5,6 7,8,9 10,11,12 13,14,15 C 1,2,3 4,5,6 7,8,9 10,11,12 13,14,15 F 1,2,3 4,5,6 7,8,9 10,11,12 13,14,15

4 PACKAGING COMPOSIZIONE BASIC PHYSICAL PROPERTIES Layer Thickness (µm) Substance (g/m 2 ) Density (Kg/dm 3 ) A C F A C F A C F PP ANTIFOG Total (without ink) Tolerances in the diagram +/- 8% CHEMICAL PROPERTIES Gas Permeability Method Unit A C F O 2 ASTM D3985 cm 3/ m 2 24h atm H 2 O ASTMF 1249 g/m 2 24h atm

5 PACKAGING Metodi dipendenti dalla coltivazione RISULTATI BATTERI TOTALI COLTIVABILI Analisi statistica (ANOVA) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (>F) Days e e * Log CFU/g Package e e Day:Package e e Residuals e e+14 Tempo (giorni) Assenza di differenze statisticamente significative nella carica batterica totale tra i due packaging innovativi (A e C) e il controllo F (P=0.1578). In tutti i campioni aumento significativo della carica batterica totale nel tempo (P=0.0289) C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

6 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE Real time PCR log- phase analysis end- point analysis Gene target Primers amplificato N n n Alta concentrazione Bassa concentrazione n Batteri totali 16S rrna 27F e 519R 492 bp Pseudomonas oprf * Pse_OPRF-F e Pse_OPRF-R * Proteina di membrana Efficienza della reazione =100% R 2 > 99% CBT Pseudomonas spp. 400 bp N: numero delle molecole amplificate n: numero dei cicli di amplificazione CBT Pseudomonas spp Curve standard per la quantificazione assoluta della carica batterica totale (CBT) e del genere Pseudomonas spp. Amplifica* specifici Le condizioni messe a punto per la quantificazione della carica batterica totale (CBT) e del genere Pseudomonas hanno permesso di ottenere una buona efficienza di amplificazione ed assenza di prodotti aspecifici P. De Rossi, A. Del Fiore, F. Lecce

7 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE RISULTATI Real time PCR Carica Batterica Totale C > A > F * *P < 0,05 (one way ANOVA) Minore velocità di crescita batterica nel packaging tradizionale (F): alla data di scadenza (6 giorno), in F il valore più basso di carica batterica (P<0.05) 6 giorno (riquadro blu): differenze statisticamente significative (P<0.05) tra ciascuno dei packaging innovativi e il controllo (A vs F e C vs F), ma non tra i due innovativi (A vs C) 10 giorno (riquadro verde): differenze statisticamente significative (P<0.05) tra il controllo e l innovativo C (F vs C) e tra i due innovativi (A vs C) P. De Rossi, A. Del Fiore, F. Lecce, A. Mengoni

8 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE RISULTATI Real time PCR Pseudomonas spp Presenza di Pseudomonas spp. in tutti i campioni esaminati, con un incremento della crescita tra il 3 ed il 6 giorno A partire dal 6 giorno (blu) fino al 10 (verde), il packaging tradizionale (F) presenta una quantità di Pseudomonas spp. significativamente minore (P<0,05) rispetto al packaging innovativo C (C>A>F) P. De Rossi, A. Del Fiore, F. Lecce, A. Mengoni

9 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE T-RFLP Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Capillary electrophoresis of restriction fragmentis Questo metodo molecolare permette di permette la comprensione della struttura e dell evoluzione della comunità microbica delle matrici in esame Analisi effe;uata su DNA estra;o da: pool di tre repliche (buste) per ciascun campione (packaging A, C, F; giorni 1, 3, 6, 8) ogni singola replica (busta)

10 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE RISULTATI T-RFLP (pool) Struttura delle comunità batteriche Il packaging F forma un cluster distinto dal cluster formato dai packaging A e C Riferimento F P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

11 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE RISULTATI T-RFLP (pool) Struttura delle comunità batteriche: PRINCIPAL COMPONENT ANALYSIS (PCA) dei profili T-RFLP Il packaging innovativo A si distingue come un componente separato P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

12 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE RISULTATI T-RFLP (pool) INDICI DI DIVERSITA Shannon -Weaver H: numero relativo di individui per specie, corrisponde alla probabilità che un picco sia presente Eveness (H ): distribuzione delle specie (abbondanza relativa di individui in ciascuna operational taxonomic units (OTU), Richness (S): indice di ricchezza di specie = n di OTU corrispondente al n. di picchi Gli indici Richness e Shannon indicano un abbondanza in specie maggiore nel packaging F rispetto ai packaging A e C, nei primi giorni dal confezionamento P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

13 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE RISULTATI T-RFLP (singole buste) Struttura delle comunità batteriche Stru4ura delle comunità ba4eriche (T- RFLP) Non si evidenziano cluster distinti per i tre packaging presi in esame (Dall analisi del pool, invece, il packaging F forma un cluster distinto) P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

14 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE RISULTATI T-RFLP (singole buste) Struttura delle comunità batteriche PCA dei profili T-RFLP Stru4ura delle comunità ba4eriche (T- RFLP) T-RFLP (singole buste) Non si rilevano differenze tra i packaging (Dall analisi del pool, invece, il packaging innovativo A si distingue come un componente separato) P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

15 PACKAGING METODI INDIPENDENTI DALLA COLTIVAZIONE RISULTATI T-RFLP (singole buste) INDICI DI DIVERSITA Evenness Shannon H Non vi sono differenze significative tra i packaging (anche per i dati non mostrati, quali gli indici di Richness e Simpson) P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

16 PACKAGING CONCLUSIONI L elaborazione dei dati di conta batterica non ha rivelato differenze significative nella quantità di cellule batteriche vitali tra i packaging innovativi (C e A), ed il packaging tradizionale (F), ma soltanto un aumento nel tempo della carica batterica coltivabile I risultati di dinamica di crescita batterica ottenuti con la Real time PCR hanno evidenziato che, rispetto ai packaging innovativi, il packaging tradizionale Ø sembra controllare meglio la crescita microbica totale fino alla data di scadenza del prodotto Ø sembra determinare una crescita più lenta del genere Pseudomonas spp. (coinvolto nella degradazione sensoriale dei prodotti alimentari) L analisi T-RFLP ha evidenziato differenze nella struttura della comunità microbica tra i packaging innovativi A e C rispetto al riferimento F. Questo risultato si è ottenuto solo analizzando il pool delle tre repliche di lattughino, non le singole buste

17 INNOVAZIONE DI PROCESSO DISEGNO SPERIMENTALE Day 1 Day 3 Day 6 Day 8 Lattughino prodotto dalla company La Linea Verde SpA Innovazione di processo (IP) e standard (ST) Campionamento a 1, 3, 6, e 8 giorni dal confezionamento 3 buste (repliche) per ciascun campione (IP-ST/giorno) Lactuca sativa? IP? ST? Analisi delle comunità batteriche mediante metodi indipendenti dalla coltivazione Real-time PCR: carica batterica totale T-RFLP: struttura e dinamica della comunità microbica; indici di diversità Metagenomica ST

18 INNOVAZIONE DI PROCESSO RISULTATI Real time PCR Media delle 3 repliche in ciascun campione Carica Batterica Totale Carica Batterica Totale Il prodotto sottoposto all innovazione di processo (IP) ha carica batterica iniziale inferiore (P<0.05) al prodotto processato tradizionalmente (STD), e tale differenza sembra mantenersi costante fino alla data di scadenza a b * P<0,05 (one way ANOVA) Differenza statisticamente significativa tra IP e STD al 1 giorno P. De Rossi, A. Del Fiore, F. Lecce, A. Mengoni

19 INNOVAZIONE DI PROCESSO RISULTATI Real time PCR Pseudomonas spp In tutti i campioni Pseudomonas spp. ha mostrato un incremento della crescita tra il 3 ed il 6 giorno Assenza di differenze significative tra il prodotto sottoposto all innovazione di processo (IP) ed il prodotto processato tradizionalmente (STD) P. De Rossi, A. Del Fiore, F. Lecce, A. Mengoni

20 INNOVAZIONE DI PROCESSO RISULTATI T-RFLP Diversità INDICI DI ba;erica DIVERSITA (T- RFLP) Richness Assenza di differenze statisticamente significative tra i campioni IP (rosso) e ST (verde) nel tempo (anche per dati non mostrati, quali evenness) Shannon H Simpson P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

21 INNOVAZIONE DI PROCESSO RISULTATI T-RFLP PCA dei profili T- RFLP. La stru;ura della comunità IP risulta diversa da quella St Struttura delle comunità batteriche PCA dei profili T-RFLP La struttura della comunità IP risulta diversa da quella STD P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino

22 INNOVAZIONE DI PROCESSO CONCLUSIONI I risultati della Real time PCR hanno evidenziato che l innovazione introdotta nel processo è migliorativa rispetto al processo tradizionale determinando una minore carica batterica iniziale Non vi sono differenze significative tra i processi STD e IP per quanto riguarda la diversità microbica Si notano differenze a livello della struttura della comunità batterica, che suggeriscono un effetto del processo sulla composizione della comunità in termini di taxa

23 Metodologie diagnostiche innovative per la caratterizzazione delle comunità microbiche Next generation sequencing: MiSeq La tecnologia avanzata Illumina permette di: 1. ottenere più di 16 Gigabasi per corsa e quindi un coverage maggiore rispetto alle altre piattaforme (1G per IonTorrent) 2. determinare la presenza e identificare microorganismi non coltivabili ma che possono avere un ruolo significativo nei processi produttivi e nel determinare i tempi di shelf life di prodotti alimentari 3. poter anche identificare geni rilevanti per migliorare sia il processo produttivo sia il prodotto alimentare

24 Attività sperimentale Messa a punto di protocolli di metagenomica per la determinazione dell'entità della contaminazione batterica totale Studio del gene 16S rdna per l identificazione della regione amplificabile maggiormente rappresentativa * Amplificazione della regione scelta del gene 16S rdna da DNA di lattughino Sequenziamento next generation (MiSeq) degli ampliconi risultati e analisi dei * Con il contributo di P. Paganin, C. Dalmastri, A. Mengoni, A. Bevivino A. Fiore, E. Fantini, G. Gianese, G. Giuliano

25 Metodo Creazione librerie Miseq- regione V3-V4 del gene 16S (amplicone 400 bp) Campioni ST dal 1 all 8 giorno di confezionamento Lattughino I (Campionamento 2013, Kit di estrazione) Lattughino III (Campionamento 2013, Kit di estrazione) Lattughino VI (Campionamento 2013, Kit di estrazione) Lattughino VIII (Campionamento 2013, Kit di estrazione) 3 repliche biologiche (buste) A. Fiore, E. Fantini, G. Gianese, G. Giuliano

26 Metodo Creazione librerie MiSeq Profilo librerie di ampliconi MiSeq Profilo libreria MiSeq A. Fiore, E. Fantini, G. Gianese, G. Giuliano

27 Risultati Sequenziamento Clusters (reads) ottenuti Cluster PF Reads (M) Yeald (G) % reads > Q30 Lattughino 12 librerie (4 giorni x 3 repliche) 92,60% 18,9 8,8 71,1 Sequenze ottenute: circa 1,5 milioni di sequenze (700 Mega) a campione A. Fiore, E. Fantini, G. Giuliano

28 Analisi delle sequenze ottenute: Phylum I III 1 3 VI 6 8 VIII L analisi informatica delle sequenze ha messo in evidenza che tra il primo e l ottavo giorno c è un aumento dei Proteobatteri e degli unknown, mentre diminuiscono i Firmicutes e Cianobatteri

29 Analisi delle sequenze ottenute: Classe 1 I 3 III 6 VI VIII 8 Tra il primo e l ottavo giorno, in particolare dal sesto in poi si nota un aumento dei β- e γ -proteobatteri, mentre diminuiscono gli α-proteobatteri, Clostridi e Oscillatoriophycideae

30 Analisi delle sequenze ottenute: Genere 1 I 3 III 6 VI 8 VIII Il genere Pseudomonas aumenta fino ad arrivare al 15% all ottavo giorno mentre diminuiscono i generi Devosia, Ammonifex, Chroococcus ed Oscillatoria

31 Analisi delle sequenze ottenute: Specie Percentuale I III VI VIII 10 0 Unclassified Devosia hwasunensis Ammonifex degensii Specie maggiormente rappresentate

32 Analisi delle sequenze ottenute: Specie Percentuale I III VI VIII Candidatus Blochmannia rufipes Chroococcus minutus Oscillatoria corallinae Azoospirillum palatum Pseudomonas azotoformans Pseudomonas fuscovaginae Pseudomonas species Other species

33 CONCLUSIONI INNOVAZIONE PACKAGING Assenza di differenze significative tra i packaging innovativi ed il packaging tradizionale a livello di carica batterica coltivabile Crescita microbica totale e del genere Pseudomonas più lente nel packaging tradizionale che in quello innovativo Differenze nella struttura della comunità microbica dei packaging innovativi rispetto al riferimento INNOVAZIONE PROCESSO Minore carica batterica iniziale con l innovazione di processo Assenza di differenze significative nella diversità microbica e rilevamento di alcune differenze a livello della struttura della comunità batterica NON SI RILEVANO MIGLIORAMENTI SOSTANZIALI NELLA CARICA BATTERICA IN FUNZIONE DEL PACKAGING, MENTRE UN LIEVE MIGLIORAMENTO E INTRODOTTO DALL INNOVAZIONE DI PROCESSO ENTRAMBI GLI APPROCCI MOLECOLARI REAL TIME PCR E T-RFLP) SI DIMOSTRANO VALIDI PER EVIDENZIARE VARIAZIONI ANCHE PICCOLE NELLA COMUNITA MICROBICA ED IL LORO UTILIZZO SEMBRA QUINDI PROMETTENTE NELL INDUSTRIA ALIMENTARE E STATO MESSO A PUNTO IL SEQUENZIAMENTO MEDIANTE MISEQ CHE HA EVIDENZIATO VARIAZIONI NELLA COMPOSIZIONE DELLA MICROFLORA DEL LATTUGHINO NEL TEMPO

34 PRESENTAZIONI A CONGRESSI