Un allineamento multiplo. Multiplo o a coppie? Regioni con gaps: Loops? Riga = sequenza. 2 sequenze. Troppo divergenti. 1 2 sequenze.

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1 Un allineamento multiplo Riga = sequenza Regioni con gaps: oops? Multiplo o a coppie? 1 2 sequenze Troppo divergenti 2 REEKVTN-K--VDEI K---T--VIDKVNIEEV T RIDED--RIDEDWEDIHDWRTE--DWH TRD EDWEDIIHEWTE--DWIH TIRIEE------DEDEDIHDRT---EDWH TRIDE---D---EDWEDIHDWRTE---DWH T RIDEDWERIDEDWEDIHDWRTEIDWH Blocchi conservati Elementi di struttura secondaria? olonna = posizione PEEKVTW-KVNVDEV PEEKVWDKVNEDEV P--TVKWKEY D-TNVTWKVEY EHEWQVHVW-KVEVHQ 2 sequenze Troppo simili llineamento Multiplo Famiglia proteine omologhe llineamento multiplo Un allineamento multiplo è un insieme di sequenze omologhe allineate. Ogni riga di una allineamento rappresenta una diversa sequenza, ed ogni colonna una posizione dell'allineamento, Ogni posizione dell'allineamento contiene gli aminoacidi delle diverse sequenze fra loro corrispondenti. Regioni che occupano più posizioni consecutive senza gaps, si chiamano blocchi e spesso corrispondono a elementi di struttura secondaria conservati nella famigia di proteine. Regioni dell'allineamento che invece contengono gaps in molte delle sequenze corrispondono spesso a elementi di raccordo (loops) fra le regioni di struttura secondaria. Importanza degli allineamenti multipli li allineamenti multipli sono molto utili per studiare le caratteristiche di una famiglia di proteine e la relazione evolutiva e di struttura tridimensionale fra le proteine che la compongono. In particolare gli allineamenti multipli sono molto utili per evidenziare posizioni aminoacidiche particolarmente conservate e quindi potenzialmente importanti in una famiglia di proteine. e si allineano a coppie due sequenze molto divergenti appartenenti ad un unica famiglia riusciamo ad evidenziare coppie di aminoacidi conservate e quindi importanti, ma dal momento che le sequenze sono molto distanti non possiamo avere garanzie sulla correttezza dell'allineamento e quindi sulla reale importanza delle posizioni. D'altra parte se allineiamo due sequenze sufficientemente vicine per avere la certezza sulla correttezza dell'allineamento avremo un alto numero di posizioni conservate, in cui quelle realmente importanti son confuse in mezzo a quelle meno importanti ma ugualmente conservate data la vicinanza delle sequenze. e a queste due sequenze aggiungiamo altre sequenze allineate della stessa famiglia creando un allineamento multiplo di più sequenze, molti degli aminoacidi che erano conservati nell'allineamento a coppie non lo sono più in tutte le sequenze. d esempio le 2 proline nella prima colonna non sono conservate nella 4' e nella 5' sequenza dove sono sostituite da una e da una E. In questo modo gli aminoacidi conservati in tutte le sequenze sono molti meno e le posizioni realmente importanti possono essere identificate (la V, W K e della figura).

2 olorazione onsensus ysteine Negative Positive lcohol Polar romatic Hydrophobic D, E K, R, T N, Q F, H, W, Y,, I,, M, P, V onsensus 90% 80% 70% olorazione degli allineamenti multipli onsensus delle posizioni Per evidenziare le posizioni conservate e le loro caratteristiche gli aminoacidi maggiormente conservati in ogni colonna sono colorati per tipo a seconda della classe a cui appartengono. Esistono diversi schemi possibili di colorazione. Nella figura è riportato uno dei più diffusi. Per facilitare la lettura di un allineamento multiplo ed evidenziare rapidamente gli aminoacidi conservati, può essere rappresentato nell'ultima riga di un multiallineamento la sequenza "consesus" ( la riga indicata dal 100% in figura). In questa riga sono rappresentati gli aminoacidi più conservati, se esistono, per ogni posziione dell'allineamento. e tutte le sequenze in un allineamento multiplo contengo lo stesso aminoacido in una posizione questo viene riportato nella consensus (minoacido D dell'esempio), allo stesso modo se tutti gli aminoacidi di una colonna appartengono alla stessa classe (ad esempio sono tutti carichi), nella riga di consensus viene riportato il simbolo della classe (ad esempio h in figura per gli aminoacidi idrofobici). Possono essere anche rappresentate delle righe di consensus al di sotto di una certa percentuale (ad esempio 90%, 80% o 70%). In queste righe per metere un simbolo è sufficiente che l'aminoacido sia conservato in un frazione di aminoacidi della colonna superiore alla percentuale del consensus (anziche in tutti). Ecco l'elenco delle categorie più usate insieme al simbolo per rappresentarle: aliphatic => l { I,, V }, aromatic => a { F, H, W, Y },hydrophobic=> h {,, F,, H, I, K,, M, R, T, V, W, Y }, alcohol => o {, T }, polar => p {, D, E, H, K, N, Q, R,, T }, harged => c { D, E, H, K, R }, negative => - { D, E }, positive => + { H, K, R }, small => s {,, D,, N, P,, T, V },tiny => u {,, }, turnlike => t {,, D, E,, H, K, N, Q, R,, T }

3 Qualità multiallineamento VEDKVT DEKV VEEKVT EEKV DKTNVK DKTNVK Punteggio = = (V) + (ED) + (DE) + (KK) + Punteggio = Punteggio = Σi P(c i ) P(V) =??? Punteggio di una colonna V V = Punteggio colonna = Σi<j imilarità( i j ) (V)+(V)+(V)+ ()+()+ () Punteggio di un multiallineamento a qualità di un allineamento multiplo, ovvero la possibilità che effettivamente rappresenti in modo esatto l'appaiamento fra posizioni omologhe in una famiglia di proteine può essere stimato come per gli allineamenti di coppie di sequenze calcolando un punteggio. ome il punteggio di un allineamento a coppie di sequenze è dato dalla somma dei punteggi di ogni singola posizione, così anche il punteggio di un allineamento multiplo è la somma dei punteggi delle singole posizioni dell'allineamento. Mentre per calcolare il punteggio di una posizione di un allineamento a coppie può facilmente essere usato il punteggio della matrice di sostituzione per la coppia di aminoacidi presente nella posizione, è più difficile decidere in che modo calcolare un punteggio per una serie di aminoacidi diversi che occupano tutti la medesima posizione. Punteggio di una colonna Il modo più facile e usato per calcolare il valore di sostituzione di una colonna di un multiallineamento è quello di sommare i punteggi di sostituzioni per ogni possibile coppia di aminoacidi che appartengono alla posizione. d esempio il punteggio della colonna di un multiallineamento di 4 sequenze che contiene gli aminoacidi V,, ed, sarà la somma dei punteggi di sostituzione per le coppie V, V, V,, e. i considera quindi che ogni sequenza dell'allineamento sia contemporanemanete allineata ad ognuna delle altre.

4 Punteggi alternativi V V =? V =()+()+()+(V)+() =(V)+()+() +()+() omma delle coppie s1 s = P(s1,)+ P(s1,s)+ P(s1,)+ + P(,s)+ P(,)+ + P(s,)+ + + P(,) P (um of Pairs)= Σi<NΣj<N-i Punteggio imilarità( i, j ) ltri metodi per calcolre il punteggio a scelta di allineare ogni sequenza con tutte le altre (sommando quindi i punteggi di sostituzione di tutte le coppie in una colonna) vuol dire considerare ogni sequenza derivata filogeneticamente da tutte le altre contemporaneamente. Dal momento che questo non è vero è meglio usare modelli di punetggio in cui di tutte le sostituzioni possibili si sommano fra di loro solo quelle che è probabile siano avvenute realmente nel corso dell'evoluzione. Un modo alternativo è quindi quello di scegliere una sequenza e considerare tutte le altre come derivate da questa, così facendo invece di considerare la somma dei punteggi di sostituzione per tutte le possibili coppie vengono sommati fra di loro solo i punteggi di sostituzione delle coppie di aminoacidi fra la sequenza principale e tutte le altre. Nella parte alta della figura una delle due sequenze con la è stata scelta come progenitrice delle altre e il punteggio della colonna sarà quindi dato solo dalle coppie formate dalla con ognuna delle altre sequenze:,,, V e, ma non ad esempio la coppia V. Un metodo più preciso è quello di considerare l'albero filogenetico delle sequenze in esame andando a vedere efettivamente quali sequenze derivano da quali altre e considerando quindi solo le sostituzioni avvenute fra coppie di sequenze vicine nell'albero. Nella figura in basso si vede che sono state sommate solo le coppie di sostuzioni fra le sequenze che sono vicine nell'albero della figura. omma delle coppie ommare il punteggio di sostituzione di tutte le possibili coppie per ogni colonna e poi sommare il punteggio di tutte le colonne (il primo metodo che è stato descritto) è analogo a quello di calcolare i punteggi di similarità a coppie fra tutte le sequenze che fanno parte dell'allineamento multiplo e poi soomarli tutti fra di loro. Questi due metodi di punteggio (che sono la stessa cosa) sono chiamati P (um of Pairs) o somma delle coppie. Nella figura vediamo che calcolare il punteggio dell'allineamento multiplo fra sei sequenze da s1 a equivale a sommare i punetggi di similarità di tutte le possibili coppie di sequenze diverse: s1 con + s1 con s + s1 con etc.

5 lineamenti sbilanciati T T T s1 s T Peso delle sequenze s1 s = 10 1 s1 s T /5 10/1 5 / 2/1 4/1 1/1 s1 s s1 = 1.00 s = 0.61 = 0.61 = 0.56 = 0.41 = 0.41 llineamenti bilanciati e le sequenze contenute nell'allineamento multiplo non sono distribuite in modo omogeneo nella famiglia a cui appartengono, ma molte di loro sono evolutivamente poco distanti e quindi molto simili, si rischia di dare a queste un peso eccessivo nel calcolo del punteggio, rispetto alle altre. Immaginiamo infatti una famiglia di proteine dove a causa di una mutazione avvenuta nella sequenza ancestrale metà dei membri hanno un T in una posizione e l'altra metà una. e tutte le sequenze scelte per fare il multiallineamento hanno una tranne una che ha una T, risulterà che la è molto più importante di quello che è in realtà in quella posizione. Per evitare che accada questo è necessario dare un peso diverso ai punteggi che provengono dalle sequenze che sono evolutivamente più distanti dalle altre. Peso delle sequenze Uno dei modi per dare pesi diversi alle sequenze è quello di usare (se lo si conosce) il loro albero filogenetico. Ogni ramo dell'albero ha una sua lunghezza, proporzionale al tempo didivergenza del nodo figlio dal nodo progenitore (Es per la sequenza viola in figura). Per tenere conto di quante sequenze quel periodo di tempo evolutivo rappresenta, questo punteggio viene diviso per il numero totale di sequenze che si trovano al di sotto del ramo. d esempio nella figura il ramo di desta che parte dala radice dell'albero con una lunghezza pari a, viene diviso per 5 che sono il numero delle sequenze (da a ) che si trovano al di sotto di lui. In questo modo assumerà un valore finale pari a 0.6. Il punteggio che rappresenta la variabilità evolutiva e quindi il peso che ogni sequenza nell'allineamento deve avere è calcolato sommando fra di loro tutti i punteggi dei rami che dalla radice portano a quella sequenza. Nella figura ad esempio la sequenza è distanziata dalla radice da tre rami che hanno punteggi di /5, / e 4/1, per un totale di 5,6 punti. I valori calcolati per ogni sequenza vengono normalizzati dividendoli tutti per la stessa quantità ( in questo caso 10) in modo che la sequenza con il punteggio maggiore valga 1.

6 omma pesata delle coppie ome NON si costruisce s1 = 1.00 s = 0.61 = 0.61 = 0.56 = 0.41 = 0.41 s1 s WP = Σi<NΣj<N-i W ij Punteggio imilarità( i, j ) = P(s1,)*1.00* P(s1,s)*1.00* P(s1,)*1.0* P(,s)*0.61* P(,)*0.61* P(s,)*0.61* P(,)*0.41* B 2 1) llineare B con 2) llineare con B ) llineare D con 4) llineare E con D 5) llineare F con E D 4 E 5 F IIDWTQVR VIDWTNVR VTE-TNVR VTID-NVR VIDWTNVK VE-TQVK omma pesata delle coppie Una volta che sono stati calcolati dei pesi diversi per ognuna delle sequenze questi devono essere introdotti nel calcolo del punteggio dell'allineamento. Nel punteggio Weighted um of Pairs (omma pesata delle coppie) a differenza del metodo della somma delle coppie il punteggio proveniente dall'allineamento di ogni coppia di sequenze è moltiplicato per il peso che quelle due sequenze avevano all'interno dell'allineamento, calcolato con il metodo appena descritto. e sequenze più imparentate con le altre avranno quindi il loro punteggio diminuito (moltiplicato per un numero inferiore a 1) di una quantità proporzionale ai loro pesi. d esempio il punteggio di similarità della sequenza s con la sequenza, viene moltiplicato per 0.61 e per 0.56 che sono rispettivamente i pesi che hanno le due sequenze nell'allineamento. In questi modo se il punteggio di similarità di s1 ed era 100 diminuirà a 4 ( ). ostruzione di un allineamento multiplo Dopo aver visto cosa sono, a che servono e che punteggio hanno gli allineamenti multipli, analizziamo in che modo possono essere generati. i sono due modi, che potrebbero a prima vista sembrare abbastanza ovvi ma che sono altrettanto sbagliati, con cui si potrebbe pensare di costruire un allineamento multiplo. Il primo è quello di scegliere una sequenza e allineare a questa ( usando un metodo di allineamento a coppie) tutte le altre una alla volta. lterativamente si potrebbe pensare di allineare la seconda sequenza alla prima, quindi la terza alla seconda, la quarta alla terza e così via. Questi metodi sono entrambi scorretti perchè date tre sequenze, B e il modo migliore con cui e possono essere allineate fra di loro non pùo essere trovato allineando prima con B e poi B con.

7 Programmazione dinamica multi-dimensionale ostruzione albero guida Tempo O( n ) N * (N-1) allineamenti a coppia Matrice di distanze sequenze lunghe 100 = 100*100 = quadretti sequenze lunghe 100 = 100*100*100 = 1 milione cubetti 4 sequenze lunghe 100 = 100*100*100*100 = 100 milioni di iper-cubetti lbero guida Programmazione dinamica a più dimensioni llineamenti con alberi guida Il modo corretto e anzi l'unico che garantisce di trovare la soluzione ottimale per un allineamento multiplo è anche in questo caso quello della programmazione dinamica. bbiamo visto che per allineare due sequenze nel modo ottimale è possibile rappresentarle sulle righe e sulle colonne di una matrice a due dimensioni e poi calcolare il percorso del miglior allineamento possibile fra di loro. llo stesso modo se dobbiamo allineare tre sequenze possiamo immaginare di aggiungere un altra dimensione, alla matrice, creando una griglia cubica, dove sull'asse aggiunto scriviamo la terza sequenza da allineare. questo punto come ogni linea che attraversava la matrice rappresentava uno dei possibili allineamenti delle due sequenze, adesso ogni linea che attraversa le celle di questo cubo rappresenterà un multiallineamento possibile fra queste tre sequenze. on un procedimento identico a quello usato per una coppia di sequenze è possibile quindi scrivere all'interno di ognuno di questi cubetti il punteggio di sostituzione fra ognuno dei tre aminoacidi che lo rappresentano (sull'asse, y e z) e trovare poi il migliore allineamento possibile, come il percorso che attraversa i cubetti con i valori migliori. Possono essere allineate con questo criterio un qualsiasi numero di sequenze aggiungendo ogni volta una nuova dimensione alla griglia. d esempio per allineare 4 sequenze si dovrebbe usare un ipercubo a 4 dimensioni. Il numero delle celle da calcolare aumenta purtroppo in modo esponenziale con il numero di sequenze da allineare. Infatti per allineare N sequenze di lunghezza, la dimensione della griglia deve essere pari a N. d esempio per allineare 10 sequenze lunghe 100 aminoacidi servirebbero celle, rendendo impossibile il calcolo. Il metodo della programmazione dinamica è quindi di fatto inutilizazbile per allineamenti di più di dieci sequenze. Per allineare più sequenze bisogna allora per forza utilizzare metodi di tipo euristico, il che vuol dire che gli allineamenti multipli che potremo costruire non ci danno la garanzia di essere i migliori possibili. Esistono diversi modi alternativi a quello della programmazione dinamica e tutti quanti fanno uso di un albero guida. i definisce albero guida per un allineamento multiplo, un albero filogenetico costruito a partire da tutti gli allineamenti a coppie delle sequenze di cui dobbiamo fare il multiallineamento. Una volta che si è chiarita la relazione filogenetica esistente fra le diverse sequenze che si vogliono allineare questa informazione viene usata per scegliere l'ordine in cui allinearle o dare un peso giusto ad ogni sequenza nell'allineamento.

8 llineamento progressivo B 2 D 5 1) llineare E con F 2) llineare B con ) llineare D con EF 4) llineare B con DEF 5) llineare con BDEF 4 E 1 F VIDWTNVK VE-TQVK VIDWTNVR VTID-NVR VTE-TNVR IIDWTQVR llineamento di allineamenti PEEKVWDKVNE PEEKVW--VNVDEV + PEE--VWDKVNEDEV = No PEEKV--W--VNVDEV PEE--V--WDKVNEDEV PEEKVWDKVNE--- PEEKV-W--VNVDEV PEE--VWDKVNEDEV- PEEKVWDKVNE llineamento progressivo I primi metodi creati per generare allineamenti multipli usando un albero guida sono quelli di tipo progressivo. Nei metodi progressivi vengono per prima allineate la coppia di sequenze che sono fra loro più vicine nell'albero filogenetico, e si continuano poi ad allineare nuove sequenze una alla volta, ma scegliento sempre gli oggetti più vicini sull'albero sia che essi siano sequenze singole sia coppie di sequenze già allineate. Il metodo progressivo è illustrato nella figura. e prime sequenze ad essere allineate sono la E con la F ( le meno distanti nell'albero guida) e quindi la B con. Vengono poi allineate la sequenza D con l' allineamento già fatto EF (che sono ora i due oggetti più vicini sull'albero), quindi la sequenza B con la ed infine l'allineamento B con l'allineamento DEF. Il più usato metodo di allineamento progressivo è UTW. llineamento di allineamenti Il metodo di allineamento progressivo deve spesso allineare una sequenza ad un allineamento di sequenze già esistente, o due allineamenti già esistenti fra di loro. Vediamo come è possiblie fare questo. Inanzitutto quando si allinea una sequenza ad un allineamento quest'ultimo non può cambiare, ovvero sarà possibile inserire gaps sulla sequenza singola o sull'allineamento, ma se si inserisce un gap nell'allineamento questo deve essere inserito contemporaneamente in tutte le sequenze che lo compongono di modo che l'appaiamento esistente fra le posizioni non possa cambiare. Nella figura è illustrato l'allineamento di una sequenza (in arancione) con un allineamento già fatto (in giallo). Vengono proposti due tipi possibili di allineamento multiplo, di cui il secondo è realizzato nel modo sbagliato. Nel primo (quello corretto) sono stati inseriti 2 gaps nell'allineamento giallo e gaps sulla sequenza arancione. I gaps sono stati inseriti in modo corretto infatti tutte le coppie gia allineate all'interno dell'allineamento giallo sono mantenute, poiche i gaps sono stati inseriti contemporaneamente nelle stesse posizioni in entrambe le sequenze gialle. Il secondo allineamento della figura è sbagliato perchè ha inserito un gaps in una posizione della sequenza dell'allineamento giallo (tra la V e la ) senza metterne un altro in corrispondenza della seconda sequenza, cambiando di fatto l'allineamento. d esempio le parole VNVDE e VNEDE (entrambe in giallo) che prima erano allineate ora non lo sono più.

9 &W per allineamenti multipli 1 sequenza con 2 sequenze 2 sequenze con 2 sequenze Metodi iterativi - Metodi progressivi Y I +I +I Y+YI K R K+R K+R YK+YR D E +I +I Y+YI Y W I +I+ +I +I+ +I Y+YI+ W+WI K R K+R+ K+R K+R+ K+R YK+YR+ WK+WR D E D+E+ D+E D+E+ D+E YD+YE+ WD+WE Metodi iterativi alcolo punteggio mith & Waterman per allineare allineamenti. Per allineare una sequenza singola ad un allineamento si può usare il metodo di programmazione dinamica in 2 dimensioni (figura a). 'unica differenza con l'algoritmo tradizionale è che ad ogni colonna anzichè corrispondere un singolo aminoacido di una sequenza corrisponderà una posizione dell'allineamento multiplo e quindi una coppia (nel caso di un allineamento di 2 sequenze) di 2 aminoacidi. Per calcolare il punteggio di sostituzione fra gli aminoacidi in ogni cella della griglia, bisogna usare la media fra i punteggi di sostituzione dell'aminoacido sulla riga (quello della sequenza singola) ed entrambi gli aminoacidi sulla colonna. Nell'esempio della figura il punteggio della prima cella corrispondente all'ipotetico appaiamento della in prima posizione della sequenza con la coppia I nella prima posizione dell'allineamento multiplo, sarà la media dei punteggi di sostituzione della con la e della con la I, quindi (I+). o stesso metodo può essere usato per allineare fra di loro due multiallineamenti già esistenti (figura b). In questo caso il punteggio in ogni cella sarà la media dei punteggi di sostituzione fra tutte le coppie posibili di ogni aminoacido presente in una posizione sul primo multiallineamento con ogni aminoacido presente nella posizione corrispondente sul secondo multiallineamento. Nell'esempio della figura il punteggio della prima cella corrispondente all'ipotetico appaiamento di una ed una nella prima posizione del primo multiallineamento con la coppia I nella prima posizione del secondo allineamento multiplo, sarà la media dei punteggi di sostituzione della con la, della con la I, della con la e della con la I, quindi (I++I+). Metodi iterativi Uno dei grossi problemi dell'allineamento progressivo e quello che una volta che due sequenze sono state allineate, questo allineamento non può più essere più modificato. Quindi se in qualche momento si allineano due sequenze in modo non ottimale fra di loro, un errore che divenisse evidente con l'aggiunta di nuove sequenze non potrà comunque più essere corretto. Rispetto ai metodi progressivi un secondo tipo di petodi per costruire allineamenti multipli chiamati iterativi, permettono di porre rimedio a questi errorri di allineamento consentendo durante il processo di allineamento di rivedere più volte l'allineamento costruito. Per fare questo i metodi iterativi continuano a modificare gli allineamenti multipli prodotti, aggiungendo e riallineando le stesse sequenze più volte, sino a quando il punteggio complessivo dell'allineamento continua a migliorare.