«Aggiornamenti sul controllo igienico-sanitario dell apicoltura» Brisighella 13 settembre 2013

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1 «Aggiornamenti sul controllo igienico-sanitario dell apicoltura» Brisighella 13 settembre 2013 N UOVI APPROCCI DIAGN OSTICI E PROSPETTIVE DI CON TROLLO PER LA PESTE AMERICAN A Stefano Bassi Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia Romagna (Sezione di Modena) 1

2 Indice A spetti generali Diagnosi diretta Diagnosi indiretta Prospettive di Controllo 2

3 Peste americana Malattia batterica causata da Paenibacillus larvae Colpisce solo gli stadi larvali e le pupe di A pis mellifera e degli altri insetti del genere Apis Si può manifestare in qualsiasi periodo dell anno in cui c è covata E altamente contagiosa E in grado di portare al collasso e alla morte l intera famiglia 3 «AGGIORN AMEN TI SUL CO N TRO LLO IGIEN ICO -SAN ITARIO DELL APICO LTURA» - Brisighella 13 settembre 2013

4 Peste americana Le larva si infettano per via orale con le spore presenti nell alimento larvale Massima sensibilità tra le 12 e le 36 ore successive alla schiusa Sensibili solo le larve di età inferiore a 48 ore 4

5 Peste americana Le spore germinano nell intestino medio della larva 12 ore circa dopo l ingestione Le forme vegetative nella prima fase colonizzano l intestino e si replicano intensamente senza provocare danni alla parete intestinale Successivamente attraversano la membrana peritrofica penetrando nell epitelio intestinale 5

6 Peste americana Il superamento della parete intestinale avviene attraverso gli spazi paracellulari Il germe raggiunge l emocele dove continua a replicarsi invadendo l emolinfa Per l azione di proteasi molto attive prodotte da P.larvae i tessuti larvali si disgregano trasformandosi in un materiale bruno di consistenza collosa 6

7 Eziologia Paenibacillus larvae Isolato da G.F.White nel 1903 (Bacillus larvae) Bacillo Gram + sporigeno Il ciclo biologico comprende due fasi: - forma vegetativa - spora 7

8 Paenibacillus larvae Forme vegetative Bacilli sottili di dimensioni molto variabili (0,4 0,6 μm x 1,5 6 μm) Si presentano in forme singole, in catene o filamenti Abbastanza labili sia nell ambiente che in coltura 8

9 Paenibacillus larvae Forme vegetative Foto IZSLER Modena

10 Paenibacillus larvae Spore Forma ovale, 1.3 x 0.6 μm Rappresentano la forma di resistenza del germe e di propagazione della malattia Solo le spore sono in grado di infettare le larve e causare la malattia Estremamente resistenti al calore, ai raggi UV e all essicamento, agli agenti chimici 10

11 Paenibacillus larvae Spore Sopravvivono e possono rimare infettanti per alcuni decenni Sono sufficienti 10 spore o meno per infettare e uccidere una larva di h Nelle larve morte le spore sono presenti in numero elevatissimo (da 2 a 3 miliardi di spore per larva) 11

12 Classificazione P.larvae Paenibacillus larvae subsp. larvae, Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens - H eyndrickx et al Paenibacillus larvae - Genersch et. al. 12

13 Classificazione P.larvae anno

14 Caratteristiche fenotipiche dei genotipi ERIC Genotipo ERIC ERIC ERIC ERIC I II III IV Pigmentazione no sì sì no colonie LT gg 5-7 gg 5-7 gg 5-7 gg 14

15 Decorso dell infezione (LT 100) 15 Ainura Ashiralieva and Elke Genersch - Apidologie 37 (2006)

16 Epidemiologia I dati sulla prevalenza e la distribuzione spaziale dei diversi genotipi sono scarsi In Europa esistono dei dati solo per alcuni Paesi (Germania, Svezia, Austria, Finlandia, Italia e Romania) In questi Paesi circolano i genotipi ERIC I e ERIC II 16

17 Epidemiologia 17

18 Epidemiologia 18

19 Diagnosi diretta Esame clinico Esami di conferma in laboratorio a partire da materiale patologico 19

20 Esame clinico Esame ispettivo del favo Esame delle larve e delle pupe 20

21 Esame ispettivo del favo 21

22 Favo con covata sana Miele Celle di fuchi 22

23 Favo con covata colpita da PA 23

24 Favo con covata colpita da PA 24 Foto IZSLER Modena

25 Favo con covata colpita da PA 25 Foto IZSLER Modena

26 Alterazioni classiche in favi con PA O dore caratteristico (colla falegname, ammoniacale) Covata a mosaico O percoli umidi/ asciutti O percoli scuri O percoli infossati O percoli forati 26

27 Fattori che condizionano insorgenza e sviluppo della PA Fattori legati all ospite: -Comportamento igienico - Hygienic behavior Fattori legati all agente etiologico: -Differente virulenza dei diversi genotipi 27

28 Fattore legato all ospite: Comportamento igienico E un meccanismo di difesa di tipo comportamentale Consiste nella capacità, da parte delle api di casa, di individuare le larve morte toglierle dalle celle ed eliminarle Viene attuato indipendentemente dalla causa di morte della larva 28

29 Fattore legato all ospite: Comportamento igienico Difesa molto efficace contro le malattie della covata, in particolare della Peste Americana e dell Ascosferosi Le famiglie in cui questa caratteristica è più sviluppata hanno una maggiore capacità di bloccare o rallentare lo sviluppo dell infezione Il comportamento igienico è geneticamente determinato 29

30 Fattore legato all ospite: Comportamento igienico We have known for over 50 years that hygienic behavior is the main defense mechanism against American Foulbrood and chalkbrood. Why are we still using antibiotics and chemical solutions? Dr. Marla Spivak 30

31 Fattore legato all agente etiologico: Virulenza dei genotipi Indicatore di virulenza LT 100 = Tempo che impiega un patogeno per uccidere il 100% degli ospiti Infezioni sperimentali eseguite in laboratorio hanno messo in evidenza una diversa LT 100 tra ceppi di P.larvae La LT 100 risulta essere genotipo-specifica 31

32 Infezioni sperimentale con genotipi ERIC I e ERIC II Studio degli effetti del comportamento igienico nelle infezioni sostenute da genotipi di diversa virulenza Studio della virulenza di questi due genotipi a livello della colonia 32

33 Infezione con genotipo ERIC I Nelle larve infettate da P.larvae genotipo ERIC I l infezione ha una progressione lenta Per uccidere il 100% delle larve sono necessari giorni Il 40% circa delle larve muore dopo l opercolatura della cella 33

34 Infezione con genotipo ERIC I Le larve che muoiono dopo l opercolatura vengono individuate e rimosse con più difficoltà La probabilità che le larve morte si trasformino in masse collose e in scaglie è maggiore Il numero di spore che si formano è più elevato e la trasmissione della malattia all interno della colonia è più rapida 34

35 Infezione con genotipo ERIC II Nelle larve infettate da P.larvae genotipo ERIC II l infezione progredisce rapidamente Il 100% delle larve muore dopo 5 7 giorni dall infezione Circa il 90% muore prima dell opercolatura Queste larve possono essere facilmente individuate e rimosse dalle api nutrici 35

36 Infezione con genotipo ERIC II La presenza di larve colliquate e di scaglie sarà minore e la produzione di spore ridotta La diffusione dell infezione all interno della colonia sarà più lenta Per indebolire e provocare, eventualmente, il collasso della colonia sono necessari tempi più lunghi, anche più stagioni 36

37 Correlazione inversamente proporzionale tra la virulenza a livello larvale e la virulenza a livello della colonia Geno type Time (days) to host death Virulence of P. larvae on larval level Proportion of larvae dying after cell capping Level of development of ropy mass and spore production Rate of spreading within the colony Degree of virulence P. larvae on colony level ERIC I Low Large High High High ERIC II 5-7 High Small Low Low Low 37 Rauch S. et al Appl. Environ. Microbiol. 75 (10): modificato

38 Favo con infezione naturale P.larvae ERIC II 38 Elke Genersch (2010)

39 Favo con infezione naturale P.larvae ERIC II 39 Foto IZSLER Modena

40 Esame delle larve e delle pupe 40

41 Evoluzione delle lesioni larvali 41 MA Hornitzky (2010)

42 Lesioni larvali 42 Elke Genersch (2010)

43 Lesioni larvali 43 Foto IZSLER Modena

44 Lesioni larvali 44 Foto IZSLER Modena

45 Scaglie Institut für Bienenkunde - Wien 2 - Foto IZSLER Modena

46 Pupa con ligula estroflessa E. Genersch, Journal of Invertebrate Pathology 103 (2010) S10 S19

47 Lesione patognomonica e quadri clinici atipici La larva filante è la lesione patognomonica della Peste Americana Esistenza di quadri clinici atipici con larve di aspetto e consistenza diversa L assenza di larve filanti non ci consente quindi di escludere, sempre e comunque, la presenza della malattia 47

48 Quadri clinici atipici 48

49 Lesioni larvali atipiche Gli opercoli delle celle non diventano scuri Le larve degenerate possono essere di colore bruno o grigio, di consistenza più acquosa e hanno poca, o nessuna, tendenza a formare filamenti Le larve inizialmente possono assumere un aspetto simile a quello che si osserva nella covata a sacco 49

50 Lesioni larvali atipiche Le larve bianche in posizione a C tendono protrudere dalla cella a Le scaglie sono di colore bruno o grigio e si possono rimuovere con facilità dalle celle 50

51 Lesioni larvali atipiche (121677/ 2012) 51 Foto IZSLER Modena

54 Infezioni miste 54

55 Infezione naturale da P.larvae ERIC II e M.plutonius 55 Foto IZSLER Modena

56 Limiti della diagnosi clinica In presenza di quadri clinici classici è facile fare diagnosi di Peste Americana ma una diagnosi fatta in questa fase è troppo tardiva Per limitare o prevenire la diffusione della malattia la diagnosi deve essere molto precoce 56

57 Limiti della diagnosi clinica N ecessità di controlli frequenti e accurati Rischio che nelle fasi iniziali la malattia non venga diagnosticata (falsi negativi) Impossibilità di diagnosticare le infezioni subcliniche 57

58 Diagnosi indiretta Si esegue in laboratorio ricercando e quantificando le spore di P.larvae su varie matrici prelevate dagli alveari 58

59 Matrici utilizzabili Miele del melario Miele del nido A pi Cera Polline Detriti alveare 59

60 Prelievo miele Miele del melario: Prelievo a livello di apiario. Il campione deve provenire da un solo apiario e contenere del miele di tutti gli alveari di quell apiario Miele del nido: Prelievo a livello di singola famiglia. Si prelevano con un cucchiaio g di miele da più favi del nido 60

61 Prelievo di miele da favi del nido 61

62 Prelievo api Api: Possono essere prelevate indifferentemente dal melario o dal nido in numero di per alveare 62

63 Miele Esame colturale: sensibilità Sensibilità non ottimale (90 95 % circa) Il miele può risultare negativo in apiari o colonie che hanno sintomi di PA («falsi negativi») 63

64 Miele Falsi negativi: cause Infezioni recenti. Prima che nel miele si raggiunga un livello di contaminazione apprezzabile è necessario un certo periodo di tempo Presenza di spore in quantità inferiore alla soglia di sensibilità del metodo 64

65 Miele Esame colturale: specificità Bassa specificità (65 75%) Il miele può risultare positivo in apiari o colonie senza sintomi di PA («falsi positivi») 65

66 Miele Falsi positivi: cause Infezioni pregresse e superate Mancata espressione clinica della malattia dovuta a fattori di resistenza della colonia (comportamento igienico) Ceppi con basso livello di virulenza Saccheggio Volo di deriva Uso di antibiotici 66

67 Miele Valutazioni quantitative Esiste un rapporto tra il numero di spore di P.larvae presenti nel miele e la gravità dell infezione Q uesto dato può essere sfruttato per una valutazione diagnostica dei risultati ottenuti Creazione di classi di grandezza che corrispondono a diversi livelli di infezione 67

68 Spores in food and clinical symptoms of AFB 68

69 Spores in food and clinical symptoms of AFB 100% 80% 88% 98% 60% 40% 20% 0% 12% 2% >5000 < 5000 spores/g food clinic positive clinic negative 69 W. Ritter, Apiacta (38):

70 Api Esame colturale: sensibilità Il campione ideale è costituito da 100 api per alveare N ei campioni prelevati da una singola colonia la sensibilità è del 100% N ei campioni rappresentativi dell apiario la sensibilità dipende da alcune variabili 70

71 Api Falsi negativi: cause Su campioni individuali è altamente improbabile avere dei falsi negativi. Tutte le colonie ammalate vengono identificate A livello di apiario la sensibilità dipende dal numero di alveari che compongono il campione, dal numero delle colonie ammalate, e dal numero di celle colpite. E possibile che un apiario infetto non venga identificato come tale (falso negativo) 71

72 Api Esame colturale: specificità Bassa specificità Percentuale elevata di infezioni subcliniche. Apiari o colonie batteriologicamente positive ma clinicamente negative («falsi positivi») 72

73 Api Falsi positivi: cause Mancata espressione clinica della malattia dovuta a fattori di resistenza della colonia (comportamento igienico) Ceppi con basso livello di virulenza Volo di deriva Uso di antibiotici 73

74 Api Esame quantitativo Nelle colonie ammalate la carica di spore di P.larvae è significativamente più elevata che nelle colonie con infezioni subcliniche Il dato quantitativo può essere impiegato per distinguere, indicativamente, le colonie ammalate da quelle con infezioni subcliniche 74

75 Api Esame quantitativo 75 Gende L. et al Bulletin of Insectology 64 (2):

76 Riassumendo L esame delle api permette di identificare un maggior numero sia di casi di malattia che di infezioni subcliniche rispetto all esame del miele Il punto critico di entrambe le matrici è rappresentato da una scarsa specificità Alla scarsa specificità è possibile ovviare, almeno in parte, con una valutazione quantitativa dei dati 76

77 Impiego della diagnosi indiretta N on può essere del tutto alternativa alla diagnosi clinica bensì complementare a questa Può essere usata come prova di screening per concentrare poi i controlli clinici solo sugli apiari o gli alveari positivi per presenza di spore 77

78 Impiego della diagnosi indiretta L esame clinico permetterà di distinguere le colonie ammalate da quelle con infezioni subcliniche La scelta della matrice da impiegare ( miele o api) e la valutazione dei risultati in senso qualitativo o qualitativo dipenderanno dalle specifiche realtà in cui si opera e dalle finalità che ci si prefigge 78

79 Detriti Matrice di impiego recente Campione semplice da prelevare, pratico da gestire e analizzare L esame dei detriti invernali permette di conoscere il grado di infezione dell alveare quando la famiglia è inattiva Questo consentirà di gestire in maniera adeguata le colonie con livelli elevati di infezione alla ripresa della stagione 79

80 Prelievo detriti Detriti: Vengono raccolti sul fondo dell arnia inserendo un foglio monouso nel cassettino mobile. La quantità sufficiente corrisponde a circa un cucchiaio di materiale 80

81 Prelievo detriti Foto E.Carpana

82 Detriti 82

83 Obiettivi progetto di ricerca IZSLER - CRA -A pi Indicatori di infezione - Studio dell efficienza di vari «indicatori» di presenza dell infezione. Confronto tra miele, api e detriti della stessa colonia Diagnosi predittiva - Capacità di prevedere in base al numero di spore di P.larvae presenti negli «indicatori» l insorgenza della malattia nel breve periodo 83

84 frequenza (alveari) Detriti: anni 2009 e 2011 Livello contaminazione e rischio sviluppo PA Totale alveari = % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% NO PA PA neg < > livello contaminazione (UFC/g) 84

85 Prevenzione e controllo Il controllo della peste americana si basa essenzialmente sull applicazione di adeguate misure di prevenzione e sulla diagnosi clinica precoce 85

86 Prevenzione e controllo A pplicazione delle Buone Pratiche A pistiche Obiettivo Riduzione presenza spore Riduzione prevalenza infezioni subcliniche Riduzione prevalenza forme cliniche 86

87 Prevenzione e controllo Sviluppo di strategie per il controllo della malattia Selezione per la resistenza genetica alla malattia Biocontrollo mediante batteri antagonisti e inibitori di P.larvae Trattamenti con sostanze antibatteriche naturali (oli essenziali di varie piante o propoli) 87

88 Batteri inibitori di P.larvae 88 Foto IZSLER Modena

89 Batteri inibitori di P.larvae da noi isolati nel periodo Bacillus megaterium Bacillus amyloliquefaciens Bacillus pumilus Bacillus circulans Paenibacillus polimixa 89

90 Grazie