di campionamento A cura di Cecilia Costa, Emanuele Carpana, Marco Lodesani, Antonio Nanetti Unità di ricerca di Apicoltura e Bachicoltura (CRA-API)

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1 PATOLOGIE E AVVERSITA DELLE API: tecniche diagnostiche e di campionamento A cura di Cecilia Costa, Emanuele Carpana, Marco Lodesani, Antonio Nanetti Unità di ricerca di Apicoltura e Bachicoltura (CRA-API) Difficoltà nel riconoscimento delle cause di malattia dell alveare Diverse patologie producono una sintomatologia non caratteristica o generica A volte gli effetti dei patogeni sulla salute dell alveare sono latenti o comunque indiretti Molte infezioni sono diffuse a livello sub-clinico Nell alveare sono presenti più agenti patogeni, con effetti a volte collegati o sinergici I fattori esterni possono interferire nella determinazione del quadro clinico

2 Tecniche diagnostiche IN CAMPO Esame dei sintomi Ricerca del parassita e verifica del livello di presenza (es. n. varroe sul fondo diagnostico) Applicazione di Kit diagnostici a scopo di conferma Tecniche diagnostiche IN LABORATORIO Esame microscopico Prove microbiologiche: isolamento dei microrganismi, identificazione mediante esami colturali, biochimici. Prove sierologiche (ID, ISEM, ELISA, ) Analisi di genetica molecolare (PCR, ecc.)

3 Malattie parassitarie: provocate da batteri, virus, miceti, protozoi, acari, causa d infezioni ed infestazioni più o meno gravi e contagiose [RPV 1954, Capo XXIX Malattie delle api ;OM 31/3/1978; OM 8/8/1981] Principali patologie parassitarie di Apis mellifera Agente eziologico Nome comune malattia Stadio colpito Paenibacillus larvae Peste americana Covata BATTERI Melissococcus plutonius e altri secondari (P. alvei, Str. faecalis ecc..) Peste europea Covata Pseudomonas apiseptica ecc.. Setticemia Adulti MICETI Ascophaera apis Aspergillus spp Nosema spp (apis e ceranae) Ascoferosi (covata calcificata) Aspergillosi(covata pietrificata) Nosemiasi Covata Adulti/ Covata Adulti VIRUS CPV (virus della paralisi cronica) SBV (virus della covata a sacco) APV (virus della paralisi acuta) DWV (virus delle ali deformi) Paralisi cronica (mal nero, mal della foresta) Covata a sacco Paralisi acuta (in associazione con la varroasi) Adulti Covata Adulti/ Covata PROTOZOI Malpighamoeba melleficae Amebiasi Adulti ACARI Acarapis woodi Acariosi (respiratoria) Adulti Varroa destructor Varroasi Adulti/ Covata -Peste americana (Paenibacillus larvae) -Peste europea (Melissococcus, Bacillus ecc) -Micosi (covata calcificata da Ascosphaera apis) -Covata a sacco e altre virosi -Varroosi (Varroa destructor) -Nosemiasi (Nosema apis) -Acariasi (Acarapis woodi) -Varroosi (Varroa destructor)

4 Peste americana Paenibacillus larvae Batterio sporigeno Gram + Forma infettiva: le spore (35 anni) Larve suscettibili h Sintomi I sintomi si manifestano ad uno stadio relativamente avanzato dell infezione. Sono caratteristici e consentono una diagnosi di campo generalmente attendibile covata irregolare odore caratteristico

5 Peste americana (Paenibacillus larvae) Aprile-Ottobre (tutti i mesi con covata) Opercoli depressi e forati

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7 Trasformazioni delle larve

8 Consistenza viscosa, 3-4 settimane dalla morte

9 Scaglia, 6-7 settimane dalla morte

10 Identificazione agente eziologico Paenibacillus larvae spore forme vegetative Ispezioni diagnostiche a scopo preventivo Ricerca delle spore di P. larvae nelle matrici dell alveare Attraverso la ricerca delle spore in miele, api, residui invernali è possibile: Evidenziare l infezione allo stato sub-clinico (diagnosi precoce per la prevenzione) Monitorare lo stato sanitario di un azienda o di un territorio nell ambito di piani di risanamento

11 Metodi diagnostici Manuale Oie Esame delle api (100 api per campione) n medio spore -prevalenza PA in azienda 100 r 2 = 0,87 prevalenza % UFC/ape Da: Pernal e Melathopoulos - Canada (Apiacta 2006)

12 Esame del miele n medio spore -prevalenza PA in azienda 100 r 2 = 0,39 80 prevalenza % UFC/g Da: Pernal e Melathopoulos - Canada (Apiacta 2006) Esame dei residui: metodo predittivo Buona correlazione tra livello di contaminazione dei detriti raccolti in inverno e il rischio di sviluppo della malattia nella stagione primaverile-estiva Inserire per due settimane (Aprile o Settembre-Ottobre) 2 g di residuo Livelli: <<10 2 ± 10 2 =>10 3

13 Virus della paralisi acuta (ABPV) Infezione latente Varroa Infezione clinica adulti e covata Sintomi paralisi acuta mortalità api e larve Effetti subclinici sulle api adulte (longevità e comportamento)

14 ABPV Principali vie di trasmissione Tramite la varroa: inoculo nell emolinfa di api e larve Per ingestione: dalle api (gh. salivari) alle larve giovani

15 Virus delle ali deformate (DWV) Infezione latente Varroa Infezione clinica adulti e covata DWV Sintomi mortalità pupe api nascenti deformi effetti subclinici sulle api adulte (longevità)

16 Correlazione varroa-virus Francis et al., 2013 ABPV DWV Francis et al., 2013

17 Virus della cella reale nera (BQCV) Infezione larve di regina e raramente di operaia infezione api adulte in associazione con Nosema apis amplificazione effetti N. apis: riduzione longevità, mortalità invernale

18 Virus israeliano della paralisi acuta (IAPV) Scoperto nel 2004 negli USA, successivamente isolato anche in Australia Associato in modo significativo con la sindrome CCD (colony collapse disorder) Provoca paralisi e mortalità delle api adulte, con effetti di evidente spopolamento delle colonie Può essere trasmesso dalla varroa Virus Kashmir (KBV) infezione normalmente inapparente molto virulento in laboratorio Effetti patologici in campo non ben chiariti USA: sindrome da acari (associazione con varroasi) NZ: KBV associato con nosema o peste europea Europa: mortalità invernali non chiaramente attribuite a KBV. Isolato in Germania, Francia, Spagna e Lussemburgo e UK

19 Virus X (BVX) infezione intestino api vecchie (soprattutto invernali), spesso in associazione con l amebiasi, di cui condivide la via di trasmissione a sviluppo lento, potenzialmente dannoso solo per le api svernanti, con effetti di riduzione della durata di vita Virus delle ali opache (CWV) molto diffuso, soprattutto a livello latente infezione di api adulte e larve non è associato a effetti patologici particolari, ma si ipotizza il suo concorso in casi di indebolimento e collasso di colonie infette

20 Identificazione dei virus Metodi diversi per sensibilità e specificità Microscopia elettronica Metodi immunologici Metodi molecolari Miceti di interesse patologico per le api Specie Individui colpiti Comportamento Ascosphaerales Ascosphaera apis covata parassita (covata calcificata) Ascosphaera major covata parassita facoltativo Bettsia alvei - saprofita: muffa del polline Aspergillus Aspergillus flavus Aspegillus fumigatus adulti e covata saprofita / parassita (covata pietrificata) Microsporidi Nosema sp Intestino adulti parassita obbligato Lieviti Torulopsis spp intestino adulti patogeni occasionali Altri Fungo non identificato organi riproduttori ape regina patogeni occasionali (melanosi api regine) Miceti vari - saprofiti, patogeni occasionali

21 Covata calcificata Sintomi Mummificazione - calcificazione La malattia rimane inosservata se l infezione non supera il 12%.

22 Identificazione agente eziologico Nosemiasi Effetti e sintomi Nosema apis Nosema ceranae Ridotta longevità api Mortalità invernale Orfanità Lento sviluppo primaverile Riduzione della produzione Diarrea Maggiore suscettibilità ad altri patogeni (Malpighamoeba mellificae, virus)

23 Sintomi e diagnosi Ventricolo gonfio e biancastro Esame microscopico ( x) del ventricolo e/o residuo fecale. Spore: 6 x 3 micron, riflettono la luce Tecniche biomolecolari Raccolta e preparazione campione

24 Estrazione canale alimentare Esame microscopico contenuto intestinale Valutazione dell entità dell infezione

25 Spore Nosema spp VARROOSI DISTRIBUZIONE Barriere geografiche fra Apis mellifera e A. cerana Equilibrio con patogeni e parassiti rispettivi (es.: A. cerana è varroa-tollerante) Le api europee sono state favorite (più produttive) Contatto con nuovi patogeni e parassiti: - Varroa destructor - Nosema ceranae (forse) Apis mellifera A. Nanetti Apis cerana

26 Varroosi Effetti sulle api Depauperamento emolinfa pupe e api adulte Riduzione peso api operaie (6-25%) Riduzione longevità (34-68%) Interferenza con sistema immunitario Infezioni secondarie (specialmente virali) Interazioni varroa-virus tramite sistema immunitario Nazzi et al, 2012

27 A. Nanetti Ciclo biologico Fase foretica alcuni giorni / alcuni mesi Fase riproduttiva giorni Cella da operaia: -1 Cella da fuco: -2 Covata da fuco (opercolatura: 15gg) MAGGIOR FERTILITÀ Consanguineità M + F + F A. Nanetti

28 Attività riproduttiva della varroa mediamente 3-4 uova per cella. Max: 6 nelle celle da operaia 7 nelle cella da fuco. Potenzialmente fino a 7 cicli di covata. In pratica mediamente < 2. Tasso riproduttivo = n di varroe figlie mature prodotte da una madre in un ciclo riproduttivo: 1-1,7 in cella da operaia; 2-3 in cella da fuco La progenie sopravvive solo se raggiunge lo stadio adulto prima dello sfarfallamento dell'ape.

29 Dimorfismo sessuale FEMMINA 1,1-1,3 x 1,5-1,8 mm tegumento sclerificato, bruno-rossiccio MASCHIO 0,75 x 0,80 mm tegumento poco sclerificato, chiaro A. Nanetti Uova, larve e protoninfe Da Nannelli A. Nanetti

30 Deuteroninfe e maschi adulti Da Nannelli A. Nanetti

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32 Sintomi Spopolamento o indebolimento delle colonie Agitazione Api emergenti deformi o di dimensioni ridotte Paralisi api adulte Mortalità anomala api adulte Mortalità covata Pupe: Sottrazione emolinfa Inoculo saliva Api: Ridotta longevità Alterazioni ormonali Immunosoppressione

33 Dinamica di sviluppo della popolazione di varroa La popolazione di acari aumenta nel corso di un anno con una progressione geometrica, secondo un tasso di incremento che in Italia settentrionale è circa n acari T = 2, n iniziale = 50 2, feb mar apr mag giu lug ago Una variazione modesta del tasso di incremento può avere un effetto sensibile sulla crescita annuale della popolazione di varroa e quindi sulla efficacia della lotta. Evoluzione dell infestazione secondo la regola del raddoppio mensile nel periodo di allevamento della covata. Febbraio Marzo Aprile Maggio Giugno Luglio Agosto Limite critico = varroe = % popolazione api

34 Tecniche diagnostiche per valutare la consistenza numerica della popolazione di acari Rimozione e conteggio degli acari da campioni di api adulte Rimozione e conteggio degli acari dalle celle di covata opercolata Valutazione in campo infestazione da varroa 2 cucchiai di zucchero a velo e scuotere il contenitore per un paio di minuti Attendere qualche minuto

35 Kit controllo varroa Vasetto raccolta api Tappo con rete anti-varroa Zucchero a velo Setaccio/piatto di plastica Cucchiaio Sopravvivenza in funzione dei livelli d infestazione nelle api Api luglio 5,5% Box & Whisker Plot: var api II pre 5,0% infestazione var api II camp (pre-t) 4,5% 4,0% 3,5% 3,0% 2,5% 2,0% 1,5% 1,0% 0,5% viva stato alv prim % m orta Stato alv Marzo 2011 Mean Mean±SE Mean±1,96*SE

36 Campione raccolto Numero Analisi da effettuare Api vive BeeNet: Analisi delle matrici raccolte 10 api/alveare Nosema (qualitativa) api/alveare Nosema (quantitativa) 10 api/alveare Virologiche (qualitativa) api/alveare Varroa (quantitativa) 30 api api/alveare o 300 api/apiario Analisi dei residui (pesticidi e acaricidi) Favo con covata 1 campione/alveare Peste americana/europea (qualitativa) Polline da favo 1 campione/apiario Analisi palinologica Valore nutrizionale + Analisi dei residui (pesticidi e acaricidi) Cera d opercolo 1 campione/apiario Analisi dei residui (pesticidi e acaricidi) Miele 1 campione/apiario Spore di peste americana Nosema + Analisi dei residui (pesticidi e acaricidi) Grazie per l attenzione!