INFEZIONI RENALI: OLTRE LA BATTERIURIA. Altamura 27-VI-2014 Dott Gianluca Gessoni

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1 INFEZIONI RENALI: OLTRE LA BATTERIURIA Altamura 27-VI-2014 Dott Gianluca Gessoni

2 Schema della Relazione Generalità sulla diagnosi delle UTI Nitriti ed Esterasi Gli analizzatori automatici del sedimento e la diagnostica delle UTI Sysmex UF-1000i Sysmex UF-1000i e time course analysis B-FSC e B_FLH e differenziazione tra batteri Gram+ e Gram-

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4 Diagnosi delle IVU Diagnosi Clinica Disuria, Stranguria, Pollachiuria Dolore sovrapubico o lombare Febbre Diagnosi di Laboratorio Batteriuria e Leucocituria Esame colturale

5 IVU perché diagnosi rapida Grande numero di campioni con alta percentuale (70%) di negativi Gran parte delle IVU è sostenuta da un numero limitato di specie batteriche Tipologia di campione particolarmente adatta ad uno screening e disponibile in quantità elevata Ulteriori campioni ottenibili con minimo disagio per il paziente Utilità di un rapido rule-out

6 Etiologia delle IVU Batteri Gram - Escherichia coli 50,3% 53,7% 57,4 62,4 58,9 42,3 Klebsiella spp 9,4% 7,9% 9,7 6,8 3,7 4,2 Pseudomonas spp 5,2% 5,1% 3,2 2,9 8,4 Proteus mirabilis 4,4% 5,7% 4,5 4,7 4,7 Enterobacter spp 3,6% 3,7% 7,0 2,5 7,4 Serratia spp 1,1% 1,5% 2,2 Citrobacter spp 0,8% 0,8% 5,1 Batteri Gram + Enterococcus spp 9,2% 14,8% 1,9 2,2 8,7 13,4 Streptococcus spp 2,6% 1,6% 3.1 3,4 Staphyloc. spp 2,2% 2,1% 4.1 2,0 14,8 Miceti Candida albicans 5,1% 0,4% 13,5 Altri 6,1% 2.9% 1,1 16,5 3,1 9,3 Riferimento Pezlo 1988 Gessoni 2004 Rasoul 2009 Wilson 2004 DaSilva 2007 Juarez 2007

7 Etiologia delle IVU Molto Comuni >10% Meno Comuni 1-10% Rari < 1% Rarissimi < 0.1% C lasse I Patogeni Primari Escherichia coli S. aureus S. saprophyticus Salmonella spp Leptospira Mycobatterium spp Classe II Patogeni Secondari Enterococcus spp Enterobacter spp Klebsiella spp Serratia spp P. mirabilis Pseudomonas spp M. Morganii P. vulgaris Acinetobacter spp Corynebacteri Haemophilus spp Pneumococci Classe III Patogeni Dubbi S. agalactiae CNS Miceti S. maltophilia Classe IV Flora Uretrale o Genitale Streptococchi Gardnerella Lattobacilli Bifidobacterium

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9 Esterasi Laboratorio nelle IVU La attività esterasi caratterizza i granuli citoplasmatici dei neutrofili (granulazioni azurofile) Non è presente nelle cellule mononucleate e negli eosinofili Inibizione delle reazione da parte di agenti ossidanti, basso ph, proteine, glucosio, antibiotici (cefalosporine)

10 Nitriti Laboratorio nelle IVU I nitriti derivano dalle riduzione dei nitrati introdotti con la dieta (verdure) ad opera di batteri dotati di attività nitrato reduttasi Carenza di nitrati con la dieta, batteri non riducenti i nitrati (Enterococchi), ridotto tempo di permanenza in vescica (<4h), inibizione della reazione (ascorbato) Urine ipercromiche (falsi positivi)

11 Nitriti ed Esterasi Abbiamo esaminato 2432 urinocolture Di queste 634 erano positive all esame colturale (26%) Esterasi e Nitriti si confermano dotati di un ruolo nel rule-in dei pazienti con IVU Ruolo in un setting non ospedaliero Nitriti Esterasi SE SP VPP VPN CCI

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13 Automazione dell esame della frazione corpuscolata Microscopia automatizzata Sedimax /UriSed Cattura di Immagine Iris iq200 Citofluorimetria Sysmex UF-1000i In tutti i casi il principio è quello della valutazione della batteriuria e della leucocituria

14 SediMax / UriSed Con cut-off a 85 batteri e 13 WBC / microl. SE 0.52, VPP 0.99 Karakukcu C. Clin Lab. 2012;58: Con cut-off a 44 batteri e 14 WBC / microl. SE 0.47; SP 0.91 Huysal K. Biochem Med 2013;23:211-7 Con cut-off a 12 batteri e 6 WBC / microl. SE 0.97; SP 0.59, VPP 0.27, VPN 0.98 Martinez MH. Clin Chim Acta. 2013;425:77-9

15 Iris iq200 Utilizzando cut-off a 2 WBC/HPF e qualsiasi batterio in un setting pediatrico si è osservata SE 0.75 e PPV 0.84 Shah A. Pediatr Infect Dis J. 2014;33:272-5 Utilizzando cut-off a 6 WBC/HPF e ASP a si è osservata SE 0.88 Parta M. Diagn Microbiol Infect Dis. 2013;75:5-8

16 Sysmex UF-1000i Con cut-off a 125 batteri e 40 WBC/microl. SE 0.95; SP 0.88 Manoni F. Diagn Microbiol Infect Dis 2009;65: Con cut-off a 95 batteri e 24 WBC/microl. SE 0.99; SP 0.82 Dai Q. Clin Lab 2014;60: Con cut off a 289 batteri e 32 WBC/microl. SE 0.89; SP 0.68 Giesen C. Clin Biochem 2013;46:

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18 Sysmex UF-1000i Cut-off batteriuria Munoz batteri microlitro Kodkhoda batteri microlitro Broeren batteri microlitro Pieretti batteri microlitro Manoni batteri microlitro Camporese batteri microlitro Saccani batteri microlitro

19 Analisi citofluorimetrica Cristalli WBC EC RBC Spermatozoi FLUORESCENZA 19

20 Debris Canale conteggio Batteri Impiego di fluorocromo dedicato, che colora specificatamente gli acidi nucleici dei batteri La soluzione, a ph dedicato, elimina colorazioni non specifiche di altre cellule BATTERI Fluorescenza 20

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22 Conteggio Batteri UF-1000i vs. esito esame colturale Differenze statisticamente significative tra campioni Negativi e Positivi (p<0.0001) Cut-off UFC/mL 22

23 Curve ROC Batteri UF-1000i Positività Esame Colturale >=10^5 UFC/mL 23

24 Conteggio Leucociti UF-1000i vs. esito esame colturale Differenze statisticamente significative tra campioni Negativi e Positivi (p<0.01) Cut-off UFC/mL e tra gruppi a diversa carica UFC/mL (p<0.0001) 24

25 True positive rate (Sensitivity) Rate Curve ROC Leucociti UF-1000i Positività Esame Colturale >=10^5 UFC/mL ROC Plot ROC Decision Plot 1 1 0,9 0,9 0,8 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 False positive rate (1-Specificity) 0,1 No discrimination True negative WBC UF-1000i (Positive test: WBC UF-1000i >= cutoff) (Specificity) 25 True positive (Sensitivity)

26 Sysmex UF-1000i Sembra che la quantificazione della batteriuria con analizzatore Sysmex UF- 1000i costituisca un utile presidio nella diagnostica rapida delle UTI. La leucocituria aumenta di poco la SE riducendo la SP e dovrebbe essere considerata solo per valori di WBC elevati.

27 Sysmex UF-1000i La adozione in Laboratorio di una metodica di diagnostica rapida delle UTI basata su di un analizzatore automatico del sedimento presenta il vantaggio di non richiedere strumentazione e personale dedicati. Batteriuria e Leucocituria sono dati ottenibili all interno di ECMU senza bisogno di risorse aggiuntive. I risultati negativi sono disponibili entro poche ore dall arrivo dei campioni in Laboratorio permettendo un rapido rule-out e la valutazione di nuove ipotesi diagnostiche.

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29 UF-100 e monitoraggio IVU Abbiamo valutato la possibilità di predire l esito ella terapia empirica delle UTI mediante quantificazione a t0 e t24 di WBC e batteri mediante uno studio caso - controllo Sono state valutate 79 coppie di pazienti costituite da un responder e da un non responder alla terapia Gessoni G. Case-control time course study of urinary leukocytes and bacterial counts in patients with acute urinary tract infections responsive and not responsive to antibacterial therapy. Chimica Clinica Acta Manoni F. Cutoff values for bacteria and leukocytes for urine flow cytometer Sysmex UF- 1000i in urinary tract infections. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2009; 65: Manoni F. Quantificazione della batteri e dei leucociti urinari mediante Sysmex UF-1000i: confronto con la coltura quantitativa. Rivista Italiana di Medicina di Laboratorio 2009; 5: 44 Manoni F. Field evaluation of a second generation cytometer UF-100 in diagnosis of acute urinary tract infections in adult patients. Clinical Microbiology and Infections 2002; 8: 662

30 WBC in RP e NRP

31 Batteri in RP e NRP

32 Variazioni in RP e NRP

33 UF-100 e monitoraggio UTI Time-curse analysis conclusioni Sulla base di quanto schematicamente ricordato possiamo ritenere che la quantificazione della batteriuria dei WBC dopo 24 ore dall inizio della terapia, possano giocare un ruolo nella predizione dell outcome della stessa Tali dati, estremamente preliminari, necessitano di conferme mediante studi ulteriori in setting diversi.

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35 Discriminazione tra G+ e G- Trattamento per 5 con sodio dodecil solfato Lisi G- ma non G+ Conta con UF Wang PLOS 2012 Trattamento per 5 con sodio dodecil solfato Lisi G- ma non G+ Conta con UF Wang PLOS 2012

36 Discriminazione tra G+ e G- Evaluation of B_FSC and B_FLH parameters from bacteria histograms seems to be useful for the distinction of bacterial strains detected (Gram-negatives versus Gram-positives). When B_FSC was less than 30 ch, it allowed the distinction of Gram-negative bacteria in 97% of the samples. Camporese et al. CCA 2010;411:1137

37 B_FSC - Dimensione La nostra esperienza Saccani G et al. Bichimica Clinica. In Press Oltre al conteggio dei Batteri, UF-1000 visualizza i risultati di due parametri relativi all analisi dimensionale (B_FSC) e di intensità di fluorescenza (B_FLH) emessa dalle cellule nel canale di lettura Batteri B_FLH - Fluorescenza

38 Esempi di citogrammi UF-1000 nella casistica esaminata: Gram NEGATIVI Klebsiella P. 10^6 UFC/ml E. Coli 10^6 UFC/ml Proteus M. 10^7 UFC/ml E. Coli 10^6 UFC/ml Le infezioni delle vie urinarie: utilità diagnostica della citofluorimetria - G. Saccani

39 Esempi di citogrammi UF-1000 nella casistica esaminata: Gram POSITIVI Staph. Haem.10^6 UFC/ml Ent. Faecium 10^6 UFC/ml Strepto. Aga. 10^5 UFC/ml Staph. Epid. 10^6 UFC/ml Le infezioni delle vie urinarie: utilità diagnostica della citofluorimetria - G. Saccani

40 Esempi di citogrammi UF-1000 nella casistica esaminata Gram NEG+POS, Miceti, Flore Miste E.Coli + Ent. Faecium 10^5 UFC/mL Candida Alb. 10^5 UFC/mL Prevalenza di E. Coli Flora Mista Le infezioni delle vie urinarie: utilità diagnostica della citofluorimetria - G. Saccani

41 B_FSC[ch] B_FSC La nostra esperienza Saccani G et al. Bichimica Clinica. In Press NEG POS NEG + POS MICETI FLORA MISTA GRAM POS/NEG

42 B_FLH[ch] B_FLH La nostra esperienza Saccani G et al. Bichimica Clinica. In Press NEG POS NEG + POS MICETI FLORA MISTA GRAM POS/NEG

43 La nostra esperienza Saccani G et al. Bichimica Clinica. In Press

44 Parametro B_FSC I risultati del nostro studio confermano che il parametro B_FSC è fortemente correlato alla morfologia dei batteri, con valori significativamente diminuiti nei germi gram-negativi A valori di B_FSC <25, nel 93.3% dei campioni è stato identificato un germe Gram NEG e soltanto nel 2.7% dei casi solo germi gram-positivi Specie identificate nei campioni con valore B_FSC <=25 Nr. e % campioni B_FSC <25 Nr. % Gram NEG Gram POS Gram NEG+NEG Gram NEG+POS Miceti 0 0 Flora Mista Le infezioni delle vie urinarie: utilità diagnostica della citofluorimetria - G. Saccani

45 Conclusioni Efficace selezione dei campioni negativi, refertabili in tempo reale, con eccellente Sensibilità e Valore Predittivo Negativo Efficace riduzione dei campioni da avviare all esame colturale: i positivi allo screening possono essere seminati immediatamente, senza ritardare i processi e i tempi di risposta dell esame Disponibilità di ulteriori parametri (conteggio Leucociti e Lieviti) di particolare importanza nella diagnostica delle infezioni urinarie Le infezioni delle vie urinarie: utilità diagnostica della citofluorimetria - G. Saccani

46 GRAZIE DELLA CORTESE ATTENZIONE