Difese dell organismo

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1 Difese dell organismo Gli organismi hanno essenzilmente tre tipi di difese, disposte sequenzialmente, che il patogeno deve superare: Barriere fisiche Immunità innata Immunità adattativa Fig pag 7 sampayrac

2 Barriere fisiche La cute è una barriera quasi impenetrabile per un virus, a causa della presenza dello strato cheratinizzato, formato da cellule morte. Molti virus invece riscono a passare le barriere mucosali (respiratoria, digestiva, riproduttiva), che sono costituite da poche strati di cellule vive. Mucosa respiratoria: presenza di muco, che ricopre le cellule, ed impedisce l attacco al recettore M. digestiva: i virus devono sopravvivere alla saliva (contiene sostanze antivirali), le condizioni acide dello stomaco, la degradazione da parte degli enzimi digestivi. Inoltre i sali biliari prodotti dal fegato distruggono l envelope. M. riproduttiva: la vagina è protetta da un epitelio stratificato di cellule non proliferanti i virus replicano meglio in cellule attive. In realtà i virus che infettano per questa via sfruttano piccole lesioni che consentono di raggiungere le cellule proliferanti degli strati inferiori. inoltre i batteri presenti acidificano l ambiente (~ph5), e molti virus sono ph-sensibili

3 La risposta dell ospite all infezione virale In seguito all infezione virale l ospite sviluppa una serie di risposte protettive, che si dividono in due grandi categori: L immunità acquisita, o inducibile, è l espressione della risposta dell individuo all azione di agenti estranei (antigeni) che si sviluppa in seguito al loro contatto. Le sue caratteristiche fondamentali sono la specificità, dovuta agli anticorpi prodotti dalle plasmacellule, e la memoria, dovuto al clone di cellule memoria che serve a prevenire successive infezioni, rendendo la risposta più forte e rapida. L immunità innata (I.I.), o costitutiva, è invece un meccanismo di difesa preesistente all incontro con l antigene. L I.I. rappresenta la prima linea di difesa dell organismo e viene attivata da molecole espresse solo dal patogeno (e non dall ospite) e da segnali di stress. E caratterizzata da: -assenza di specificità, in quanto è attiva contro un largo spettro di microorganismi; -assenza di memoria; -velocità di risposta; -assenza di un meccanismo del riconoscimento del "self. L I.I. è importante non solo per combattere l infezione, ma anche perchè innesca e prepara molte risposte dell immunità adattativa. Nota: Ci limitiamo a fornire un idea generica delle risposte importanti per il controllo dei virus, la trattazione completa dei fenomeni verrà svolta nel corso di Immunologia

4 PAMPs e TLRs L I.I. viene innescata da PAMPs (pathogen associated molecular pattern, assenti nelle cellule dell ospite), che si legano ai TLRs (Toll-like receptor), specifici recettori espressi sulla membrana delle cellule effettrici dell I.I. (es. cell. dendritiche) TLRs e loro ligandi Recentemente, sono stati scoperti nel topo 2 nuovi TLRs, di cui ancora non si sa niente

5 TLRs e PAMPs Quando il TLR lega un PAMP si verificano molte risposte: Fagocitosi Chemiotassi e infiammazione Secrezione di citochine (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, ecc.) Attivazione di cellule dendritiche upregolazione di molecole costimolatorie necessarie per l attivazione di cellule T (CD80, CD86) TLRs importanti per le infezioni virali: TLR9: riconosce motivi CpG non metilati (es. DNA di herpesvirus) TLR3: riconosce dsrna (intermedio replicativo virus a RNA) TLR7, 8: riconoscono ssrna tipici virali Mentre i TLRs che riconoscono batteri e miceti sono all esterno della membrana, quelli che riconoscono gli acidi nucleici virali sono sulle membrane intracellulari

6 Pathway dei TLRs: si tratta di fenomeni complessi e diversificati: un fattore importante è MyD88, che interviene in molti punti, ma ci sono diverse vie alternative MyD88-indipendenti

7 Cellule dell Immunità Innata L I.I. è effettuata principalmente da macrofagi e cellule dendritiche (entrambe esprimono TLRs), e da cellule NK Le cellule dendritiche agiscono sia direttamente (producendo citochine e interferon), che indirettamente (attivando le cellule T nell immunità adattativa) Schema del ruolo delle cellule dendritiche nell I.I.

8 Cellule dell Immunità Innata Le cellule NK non hanno TLRs, ma altri recettori. Le cellule NK hanno dei recettori inibitori che, se occupati, le inibiscono (KIRs). I KIR riconoscono molecole MHC di classe I, e non lisano le cellule che esprimono questi antigeni self. Cellule con bassi livelli di MHC-I non attivano i KIR, e sono lisate (NK attive rilascono granuli che contengono perforina). Alcuni virus downregolano MHC I, e quindi le cellule infettate sono lisate prima che venga prodotto virus - però alcuni virus codificano proteine che mimano MHC I

9 Cellule dell Immunità Innata In altre parole, la risposta delle NK dipende da un complesso equilibrio fra segnali attivatori (che inducono il rilascio di segnali che innescano la citotossicità verso cellule infettate o dannggiate) e segnali inibitori (che proteggono dal lisare cellule normali). Alcuni virus sono in grado di attivare i segnali inibitori per evadere l attivazione delle cellule NK Fields fig 9.4 II parte + -

10 Schematizzando: MHC classe I inibisce le NK, ma se presenta un Ag non self, attiva il killing Ma ci sono virus che downregolano MHC-I, ed in questo caso non ci sarebbe attivazione del killing Però le NK vedono l assenza di MHC-I, non sono inibite e si attivano Alcuni virus codificano proteine che mimano MHC-I (es. citomegalovirus umano e animali)

11 Interferon Componente fondamentale dell immunità innata (tipo I) e dell immunità adattativa (tipo II). Viene descritto nelle diapositive successive

12 Defensine Corti peptidi antimicrobici prodotti da leucociti, NK, neutrofili e cell. epiteliali, in seguito a vari stimoli (fra cui anche attivazione di TLR). Hanno 2 diversi ruoli nelle difese antivirali, agendo sia sul virus che sulla cellula. Klotman & Chang Nat Rev Immunol. 2006, 6: Inattivano virus con inviluppo, rompendo le membrane o interagendo con le glicoproteine (es. gp120 di HIV) Interagiscono con recettori di membrana delle cellule ed alterano il signaling intracellulare. Causano diversi effetti, es. bloccano la trascrizione dell RNA virale o il trasferimento dell ac. nucleico virale nel nucleo In diversi virus (es influenza) bloccano il processo di spoliazione negli endosomi

13 Complemento Fra tutte le proteine di questo sistema, ha particolare importanza la componente C3b. Diverse componenti (C3b, C1q) si possono legare alla superficie del virus, con 2 effetti: 1) opsonizzazione : i fagociti hanno recettori per il C, ed i virus legati al C vengono fagocitati più facilmente 2) Per i virus con inviluppo, il legame di C3b innesca reazioni biochimiche che portano alla formazione di pori sulla membrana, inattivando il virus ( virolisi ).

14 Interferenza da RNA E il processo con cui una molecola di RNA a doppia elica provoca la degradazione degli mrna con sequenze nucleotidiche omologhe. Le cellule eucariote hanno una RNAsiIII ( dicer ) che taglia il dsrna in corti oligonucleotidi di basi. Gli oligo prodotti agiscono come small interfering RNAs (sirnas). I sirnas vengono srotolati e ridotti a ss, si legano all RNA virale, viene sintetizzato dsrna, che viene degradato. I sirna formano complessi con molecole di mrna omologo (virale), e lo degradano. FIG NATHANSON 5.8 Questo fenomeno sembra confinato in larga misura alle piante ed ai virus vegetali. Recenti studi indicano che anche i linfociti T applicano l interferenza da RNA per proteggersi contro l infezione da HIV. L applicazione dei sirna mediante biotecnologia è attualmente molto usata per silenziare geni eucariotici

15 Schema delle cellule associate all immunità innata e a quella adattativa

16 Decorso di una tipica infezione virale acuta

17 Paragone fra immunità innata ed acquisita DC = cellule dendritiche

18 Cinetica delle risposte immunitarie all infezione virale Le risposte innate non specifiche precedono l induzione delle risposte antigene-specifiche. Le due risposte agiscono in modo sinergico e complementare Il diagramma mostra la sequenza della comparsa di Interferoni, attività NK, CTL virus-specifici e anticorpi nell infezione col virus murino della coriomeningite linfocitaria.

19 Immunità Adattativa Umorale Gli anticorpi antivirali specifici hanno diverse funzioni: Legano il virione e lo neutralizzano rendendolo non infettante (è impedito l assorbimento ai recettori) (NB non tutti gli anticorpi sono neutralizzanti, e non sempre l attività neutralizzante in vivo correla con quella in vivo) Legano complemento (C1q), attivando la cascata e causando la lisi del virione Legano i recettori Fc presenti sui macrofagi, aumentando la fagocitosi dei complessi ATG/ATC Mediano la ADCC (Antibody dependent cell-mediated citolysis) operata dalle NK, che distruggono cellule che esprimono antigeni virali Un piccolo virus è di poco più grande delle molecole di anticorpo Hansma H G PNAS 1999;96:

20 Immunità Adattativa cellulo-mediata I linfociti T CD8 sono cellule effettrici che lisano le cellule bersaglio e secernono citochine. Quando i CD8 sono attivati (mediante interazione con le antigen-presenting cells), rilasciano perforina, che produce pori nelle cellule bersaglio (=che esprimono l Ag presentato alle CD8) Secernono anche serin esterasi che innescano l apoptosi della cellula bersaglio. Producono citochine (IFNg, TNFa, IL2) che possono indurre apoptosi, mediare riposte infiammatorie, Schema semplificato dell induzione dei CD8 citotossici. Una APC (antigen presenting cell) espone sulla superficie l antigene presentato da MHC classe I. Il CD8 naive lega il peptide attraverso il T cell receptor e, attraverso ulteriori segnali, prolifera. Poi differenzia in CD8 maturo capace di riconoscere e uccidere le cellule che espongono lo stesso antigene esposto originariamente dalla APC

21 Immunità mucosale Particolarmente importante, visto che le mucose sono uno dei migliori siti di entrata per i virus. E importante soprattutto nelle reinfezioni, e utilizza sia le risposte umorali che cellulo-mediate. Le mucose contengono molte plasmacellule, che secernono IgA. Sono presenti anche IgG, che escono per diffusione dai capillari. Le mucose contengono anche cellule CD4 e CD8, in grado di montare riposta cellulomediata con diversa distribuzione di attività CTL rispetto alla presentazione sistemica, che sembra proteggere meglio Le immunità mucosale e sistemica inducono diverse distribuzioni di CTL, e diversa protezione Topi sono stati immunizzati con un peptide virale per via sottocutanea o intrarettale. La milza aveva CTL specifici in entrambi i casi, ma nei siti mucosali erano presenti solo con l immunizzazione rettale. Quando poi i topi sono stati infettati per via rettale con un virus che partava lo stesso Ag, il titolo virale era significativamente più basso con l immunizzazione rettale

22 Immunopatogenesi virale Le risposte immunitarie che servono per difenderci, contenendo ed eliminando l infezione virale, a volte possono essere responsabili della patologia Infatti sintomi di molte malattie sono la conseguenza dell azione di citochine o di una risposta immune troppo intensa. I sintomi tipici dell influenza e di molte altre infezioni virali sono il riultato dell azione dell IFN e di altre citochine indotte dal virus. L interazione fra Ab e grandi quantità di virus presenti nel sangue può causare malattie da immunocomplesso. L esantema del morbillo e il danno tissutale dell epatite B sono il risultato della risposta immune cellulo-mediata. Quello che può sembrare un paradosso riflette semplicemente l equilibrio dinamico fra virus e ospite: Se la risposta immune elimina l infezione distruggendo un piccolo numero di cellule infettate, i sintomi sono assenti o molto lievi, e l ospite guarisce senza danni. e invece prima dall attivazione immune sono infettate un gran numero di cellule, la distruzione stessa delle cellule infettate può causare gravi conseguenze.

23 Elusione virale delle risposte immunitarie - 1 Un fattore importante della virulenza di un virus è la sua capacità di sfuggire all eliminazione da parte del sistema immunitario Blocco della produzione V. influenzale Proteina NS1 lega dsrna e lo rende irriconoscibile a PKR

24 Elusione virale delle risposte immunitarie - 2

25 Scoperta dell interferone Virus dell influenza inattivato al calore Virus attivo Fattore che interferisce con la replicazione virale, costituisce la prima difesa attiva dell organismo contro le infezioni virali, ha anche azione antitumorale Interferon

26 Interferon Il sistema degli interferoni (IFNs) è una delle più importanti difese antivirali. Sono un gruppo di proteine sintetizzate in risposta all infez. virale ed a altri stimoli. Hanno un effetto transiente, anche in presenza continua dello stimolo induttore. Gli IFNs non producono il loro effetto direttamente, ma sono secreti sia localmente che sistemicamente, ed inducono le cellule a produrre una serie di proteine che causano molteplici effetti (blocco replicazione virale, inibizione crescita cellulare specie tumorale -, attivazione macrofagi, linfociti, NK, upregolazione molecole istocomptibilità, ecc.) Interferon

27 caratteristiche dell IFN Oltre che dai virus, gli IFNs sono indotti da: morganismi intracellulari (batteri, miceti, protozoi) Attivatori dei TLRs o mitogeni Polimeri sintetici (polifosfati, ecc.) Antibiotici (es kanamicina) vari composti sintetici a basso PM Gli IFNs sono specie-specifici, ma non virus specifici. Il loro effetto è limitato nel tempo (1-2 giorni). Spesso sono responsabili dei sintomi aspeifici che associamo alle malattie virali (febbre, dolori muscolari, malessere, ecc.) Interferon

28 Ci sono due tipi di IFN, fra loro non correlati, con funzioni diverse: il tipo 1, stimolato dall infezione virale, viene prodotto da molti tipi cellulari all inizio dell infezione, è può essere indotto anche da batteri e parassiti; i più importanti sono a e b il tipo 2, o IFN-g immune fa parte sia delle risposte innate che adattative, è prodotto da linf T e NK, in risposta a citochine, soprattutto IL-12, ed attiva la risposta immunitaria e aumenta il riconoscimento della cellula infetta da parte dei linf T IFN umani ed alcune delle loro proprietà. IFN di tipo 1 di solito sono secreti in risposta ad infezione virale. IFN tipo 2 è secreto da linf T e NK dopo stimolazione con IL-12 che, a sua volta, è secreta da macrofagi e cellule dendritiche in seguito alla presentazione dell Ag Interferon

29 Caratteristiche essenziali degli IFN Interferon

30 1 2 Gli IFNs di tipo 1 inducono oltre 100 proteine, ed hanno molti effetti. I due principali (ma non unici!) effetti antivirali sono: l induzione di 2-5 oligoadenilato sintetasi e di protein chinasi R. 1) La 2-5A sintetizza delle adenine anomale, che attivano RNAsi che degradano l mrna. 2) PKR fosforila e inattiva eif-2, un importante fattore di inizio ribosomiale. Viene così bloccata la sintesi proteica Aumentano anche l espressione di molecole MHC di classe I, con incremento della capacità della cellula di presentare l antigene, e quindi maggiore attività T citotossica Interferon

31 Inoltre gli IFN agiscono anche attraverso le proteine Mx, delle GTPasi che interferiscono con la replicazione virale in stadi diversi a seconda del virus. es. v. influenza: Mx inibisce il trasporto nucleare del complesso ribonucleoproteico e la trascrizione Gli IFNs inducono anche l espressione di una particolare famiglia di geni (ISG56: P56, P54, P60, ec.) che inibiscono le funzioni di eif-3, un importante fattore di inizio della traduzione Interferon

32 Pathway degli IFNs Una via importante, ma non esclusiva, è il pathway JAK-STAT. Il legame dell IFN col suo recettore causa un segnale intracellulare che attiva una tirosinkinasi (JAK), la quale fosforila STAT (un attivatore trascrizionale) STAT fosforilato migra nel nucleo dove promuove la trascrizione di specifici geni

33 IFN-g IFN-g è un modesto induttore di attività antivirale, ma potenzia diversi meccanismi dell immunità cellulo-mediata Inoltre attiva le NK, favorisce la proliferazione di precursori linfocitari, attiva fagocitosi e produzione di citochine Tutti gli IFN hanno azione antiproliferativa, anche antitumorale con diverse applicazioni terapeutiche Interferon

34 Azione sequenziale degli IFNs IFN-b, prodotto da cellule epiteliali e fibroblasti, diffonde scarsamente dalla sede di produzione, e raggiunge facilmente alte concentrazioni locali, efficaci nel proteggere le cellule vicine a quella infettata. Se l infezione progredisce e raggiunge il circolo, può venire in contatto con i diversi tipi leucocitari che producono IFN-a. IFN-a è molto diffusibile, raggiunge tutti gli organi e contrasta efficacemente la diffusione dell inf. Continuando l infezione, si attiva la risposta adattativa con la produzione di IFNg, che potenzia la risposta cellulo-mediata. Interferon

35 Esempio dell importanza dell IFN Topi knockout senza il recettore per IFN di tipo 1 sono estremamente suscettibili all infezione da virus. I topi sono stati infettati con bassa carica (100 PFU) di virus Sindbis. Interferon