Polifenoli come potenziali modulatori di ammino ossidasi in adipociti: studi preliminari

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA FACOLTÀ DI FARMACIA DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA CORSO DI LAUREA IN CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICA Tesi di Laurea Polifenoli come potenziali modulatori di ammino ossidasi in adipociti: studi preliminari RELATRICE: Prof.ssa Raffaella Filippini CORRELATRICE: Dott.ssa Maria Luisa Di Paolo Laureanda: Claudia Bademer Anno Accademico

2 1. RIASSUNTO Numerosi studi sui polifenoli evidenziano come questi composti, ad attività antiossidante ed abbondanti nella nostra dieta, esercitino molteplici attività biologiche e benefiche per la salute. Fra le diverse attività ricordiamo, ad esempio, quella antinfiammatoria, epatoprotettiva e anticancerogena; recenti studi riportano inoltre di effetti positivi nella prevenzione dell obesità e della neurodegenerazione. In questo lavoro di tesi si è valutata la possibile azione di alcuni polifenoli su dei nuovi possibili bersagli: l ammino ossidasi umana sensibile alla semicarbazide (SSAO/VAP-1) e le monoammino ossidasi (MAO). I polifenoli utilizzati per questo studio sono: malvidina-3-glucoside, transresveratrolo, epigallocatechina-3-gallato, acido caffeico e quercetina. Essi sono stati scelti per valutare l effetto di composti appartenenti a diverse classi, e quindi con diversa struttura, ed in base alla loro biodisponibilità. Sono state inoltre utilizzate due tinture di propoli, ricche in polifenoli e con note proprietà antinfiammatorie. La SSAO/VAP-1 è una glicoproteina transmembrana, che catalizza la deamminazione ossidativa di ammine primarie ad aldeidi, con rilascio di perossido d idrogeno e ione ammonio. Il suo ruolo fisiologico non è ancora del tutto chiaro ma nell endotelio vascolare è coinvolta nell extravasazione dei leucociti al sito d infiammazione, mentre negli adipociti (presente costituzionalmente a livello della membrana) mima l effetto dell insulina promuovendo quindi l assorbimento di glucosio. Aumenti dei livelli plasmatici della forma solubile di questo enzima sono inoltre stati correlate a diverse patologie, quali il diabete, la cirrosi epatica ed il morbo di Alzheimer. Le monoammino ossidasi (MAO A e MAO B) sono enzimi, situati nella membrana mitocondriale esterna, che catalizzano la degradazione di monoammine, principalmente neurotrasmettitori. Per questo motivo 3

3 sono molto importanti nella regolazione della neurotrasmissione sinaptica e quindi sono coinvolte in patologie quali la depressione ed il morbo di Parkinson. Recenti studi hanno proposto i polifenoli come composti di partenza per lo sviluppo di inibitori reversibili delle MAO. La prima parte di questo studio di tesi è stata dedicata alla valutazione del possibile effetto dei polifenoli sull attività ammino ossidasica. I saggi enzimatici utilizzati sono stati scelti dopo aver verificato le possibili interferenze dei polifenoli sui metodi. I risultati ottenuti dall analisi degli effetti dei polifenoli sui parametri cinetici, velocità massima (Vmax) ed efficienza catalitica (Vmax/Km) delle due diverse ammino ossidasi, suggeriscono che la quercetina è il composto più efficace nell inibire l attività enzimatica sia di VAP-1 che di MAO, ma è molto più efficace su MAO A. In questo caso la costante di inibizione è stata stimata attorno ai 30 micromolare, confermando quanto riportato in letteratura. La VAP-1, in generale, non sembra essere un buon bersaglio per questi polifenoli, in qualità di inibitori. Nella seconda parte di questo studio è stato analizzato l effetto dell EGCG, della malvidina-3-glucoside, del trans-resveratrolo e di due diverse tinture di propoli (una della Farmacia San Lorenzo di Abano Terme e l altra della Ditta Pharbenia) sui livelli cellulari in adipociti umani delle due ammino ossidasi e di due parametri di difesa da stress ossidativo : la catalasi ed il glutatione ridotto (GSH). Gli adipociti, preparati da tessuto adiposo ottenuto da interventi di chirurgia plastica, sono stati incubati quattro ore con i diversi composti, sia in assenza che in presenza di insulina. Al termine, le cellule recuperate sono state lisate e sono stati eseguiti i dosaggi della VAP-1, della MAO, della catalasi e del GSH. I livelli cellulari di questi parametri sono stati valutati normalizzando le attività enzimatiche e la concentrazione di GSH al contenuto proteico di lisati cellulari (in termini cioè di attività specifica). 4

4 I risultati fino ad ora ottenuti, evidenziano come i polifenoli inducano un aumento significativo dei livelli cellulari di catalasi. Questo risultato conferma studi riportati in letteratura, secondo i quali, i polifenoli agirebbero attivando la via del fattore di trascrizione Nrf2 per gli elementi ARE (antioxidant-response element) che codificano per enzimi coinvolti nelle difesa da stress ossidativo e detossificazione. Il GSH sembrerebbe invece aumentare solo in presenza di propoli. L effetto dei polifenoli sui livelli delle AO è diverso e coinvolge probabilmente altre vie di segnale. L EGCG, la malvidina-3-glucoside e la propoli inducono un aumento di VAP-1, si comportano cioè come il desametasone, composto antinfiammatorio. Nel caso dei polifenoli però l effetto si osserva solo se è attivata la via dell insulina, suggerendo quindi il coinvolgimento della via associata al recettore dell insulina e che probabilmente coinvolge alcune chinasi. Per quanto riguarda li livelli cellulari della MAO A (la MAO A principalmente espressa in adipocita), la risposta al trattamento con i polifenoli è diversa e sembra essere indipendente dall insulina. Infatti si è osservato un effetto solo con EGCG che sembra indurre una riduzione dei livelli cellulari dell enzima. Al contrario, la propoli sembra indurre un aumento delle MAO. Questi dati preliminari dovranno in futuro essere ulteriormente confermati. E da notare che l effetto delle le due diverse tinture di propoli sui vari parametri è indipendente dalla ditta produttrice (Farmacia San Lorenzo e Ditta Pharbenia). Da questo lavoro di tesi possiamo quindi concludere preliminarmente che anche le AO sono fra i bersagli, fino ad ora non considerati, degli effetti biologici dei polifenoli (incluso la propoli), ma ulteriori studi saranno necessari per capire quali siano i meccanismi d azione e le vie di segnale cellulare coinvolte. 5

5 2. INTRODUZIONE 2.1 I POLIFENOLI: CLASSI E BIODISPONIBILITA I polifenoli di origine vegetale rappresentano una delle classi più importanti di metaboliti secondari; sono presenti in quantità consistenti nella frutta, verdura, cereali, ma anche in alcune bevande come il té, il caffè ed il vino (D Archivio et al., 2007). Il ruolo fondamentale degli antiossidanti è quello di proteggere le cellule dai danni dello stress ossidativo, riducendo di conseguenza il rischio di insorgenza di malattie degenerative ad esso correlabili. Studi sperimentali hanno dimostrato infatti che i polifenoli possono aiutare nella prevenzione di malattie cardiovascolari, cancro, osteoporosi, diabete mellito e malattie neurodegenerative. Negli ultimi decenni l interesse e gli studi su questi composti sono quindi notevolmente aumentati Classificazione dei polifenoli e propoli I polifenoli sono sostanze che presentano nella loro struttura uno o più anelli aromatici al quale sono legati più gruppi ossidrilici. Questi composti si possono raggruppare nelle seguenti classi, in base al numero degli anelli aromatici presenti nella struttura e ai sostituenti: fenoli acidi, flavonoidi, stilbeni e lignani. 6

6 Figura 2.1: Strutture chimiche dei polifenoli. Di seguito sono descritte le classi di polifenoli oggetto di studio in questo lavoro di tesi. 7