Farmaci antibatterici: classificazione, meccanismo di azione, meccanismi di resistenza
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- Sebastiano Timoteo Tucci
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1 Farmaci antibatterici: classificazione, meccanismo di azione, meccanismi di resistenza Valutazione in vitro dell attività antibatterica: saggio di microdiluizione in brodo Giovanni Di Bonaventura, Ph.D. Università G. D Annunzio, Chieti-Pescara
2 Chemioterapia - cenni storici Chemioterapia empirica Corteccia di cinchona vs malaria (indiani peruviani) Muffe vs ferite Mercurio vs sifilide (XVI secolo) Chemioterapia moderna (scientifica) Paul Ehrlich ( ) Concetto di tossicità selettiva Arsfenamina (Salvarsan) vs sifilide (solo in vivo) Domagk (1935) Colorante rosso (Prontosil) vs infezioni batteriche Fleming (1929) Penicillium notatum vs stafilococchi (penicillina)
3 Cos è un farmaco antibatterico? Agente antibatterico: Composto in grado di interferire con la crescita e la moltiplicazione batterica Contrariamente al disinfettante, è attivo solo verso batteri metabolicamente attivi (tranne polimixine) Antibiotico: Sostanza a basso PM prodotta dal metabolismo di un microrganismo: Actinomiceti (Streptomyces), Miceti (Penicillium, Cephalosporium) Chemioterapico: Prodotto di sintesi (analogo strutturale di un antibiotico)
4 Classificazione degli agenti antimicrobici Natura dell inibizione: Battericida: provoca la morte dell agente infettivo (infezioni gravi) Batteriostatica: inibisce la crescita del microrganismo, consentendo lo sviluppo della risposta immunitaria anticorpale Tipologia di microrganismo: Ampio spettro (tetracicline) Spettro ristretto (penicillina) Meccanismo di azione: Inibitori della parete cellulare Inibitori della membrana cellulare Inibitori della sintesi proteica (30S, 50S, trna) Inibitori della sintesi di acidi nucleici Inibitori di enzimi metabolici
5 Caratteristiche desiderabili di un agente antimicrobico Adeguata attività antimicrobica Non interagisce con i meccanismi di difesa dell ospite e con la flora commensale Tossicità selettiva: Attività rivolta verso il batterio ma non verso la cellula ospite Target caratteristico (per struttura od affinità) Indice terapeutico: Concentrazione terapeutica max / concentrazione tox min Attivo a basse concentrazioni Stabile, economico, facilmente somministrabile Previene l insorgenza di varianti resistenti Raggiunge adeguate concentrazioni tissutali Non associato ad effetti collaterali (ipersensibilità)
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7 Inibitori della parete cellulare (β-lattamici, glicopeptidi, bacitracina) Gli antimicrobici più comuni sono i β-lattamici: Penicilline Cefalosporine Altri β-lattamici: Acido clavulanico, tienamicina, sulbactam Moxalactam Monobattamici (aztreonam)
8 Inibitori della parete cellulare Penicilline Prodotte da Penicillium chrysogenum Nucleo fondamentale: acido 6-amino-penicillinanico Naturali: Benzil-penicillina (penicillina G) attiva verso cocchi Gram+ e Gram- Semi-sintetiche: Meticillina + Isossazolilpenicilline (oxa-) Resistenti a β-lattamasi Aminopenicilline (ampi-, amoxi-) Carbossipenicilline (carbeni-, ticar-) Ureidopenicilline (pipera-, azlo-) Sulfossipenicilline (sulbeni-, sun-) notevole penetrazione della membrana esterna dei Gram-; sensibili a β-lattamasi
9 Inibitori della parete cellulare Cefalosporine Presenza del nucleo acido 7-amino-cefalosporanico Spettro di azione esteso ai Gram-negativi resistenti a β-lattamasi; penetrazione della membrana esterna Naturali: Cefalosporina C (Cephalosporium achremonium) Semi-sintetiche: I generazione (cefazolina) II generazione (cefuroxime) III generazione (cefotaxime) IV generazione (cefepime) Cefamicine: Naturali (streptomiceti) Struttura cefalosporina-simile (gruppo metossilico in C 7 ) Esteso spettro di azione (soprattutto verso i batteri anaerobi)
10 β-lattamici Meccanismo di azione Target principale = parete cellulare batterica Bersaglio caratteristico della cellula microbica (tox selettiva) Attività battericida su cellule in attiva divisione Inibiscono la fase finale di polimerizzazione (reazione di transpeptidazione) della sintesi del peptidoglicano, legandosi selettivamente agli enzimi coinvolti nella reazione (Penicillin Binding Proteins PBPs): Arresto crescita batterica Accrescimento oltre i limiti fisiologici Formazione dello sferoplasto e lisi cellulare: Produzione di peptidoglicano lasso Induzione di enzimi endogeni batterici (mureina-idrolasi)
11 Peptidoglicano struttura
12 Sintesi del peptdoglicano transpeptidazione
13 Beta-lattamici Spettro (uso terapeutico) Penicilline: Generalmente attive su gram-positivi aerobi ed anaerobi: Batteriemia, setticemia, faringite, otite media (S. aureus, S. epidermidis) Meningite, polmonite (S. pneumoniae) Alcuni Gram-negativi: UTI (Proteus, E. coli) Gastroenteriti (Salmonella, Shigella) Cefalosporine: Spettro esteso anche ai Gram-negativi Meningiti (Haemophilus influenzae tipo b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis) Resistenza a beta-lattamasi attive su penicilline Maggiore penetrazione attraverso la membrana esterna
14 Beta-lattamici Tossicità Penicilline: Sebbene non associate ad effetti collaterali, possono indurre ipersensibilità (10% dei casi) o neurotossicità (dosaggio> milioni di unità)
15 Inibitori della parete cellulare altri β-lattamici Acido clavulanico, sulbactam Derivato strutturale dell acido 6-amino-penicillanico Azione protettiva nei confronti delle β-lattamasi (in combinazione con penicilline) Moxalactam Derivato strutturale dell acido 7-amino-cefalosporanico Esteso spettro di azione, spiccata resistenza alle β-lattamasi Monobattamici (aztreonam) Chromobacterium violaceum Nucleo fondamentale β-lattamico monociclico Rilevante attività vs Gram-negativi (anaerobi esclusi), spiccata resistenza alle β-lattamasi
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17 Inibitori della funzionalità della membrana citoplasmatica (Polieni, Azoli, Polimixine) Polieni (anfotericina B, nistatina) Legame irreversibile con lipidi di membrana (ergosterolo) e conseguente distruzione di membrana. Fungistatici, infezioni sistemiche (Candida spp) Nefrotossicità Azoli (itraconazolo, fluconazolo, chetoconazolo): Bloccano la sintesi di ergosterolo Fungicidi, infezioni superficiali e sistemiche Disfunzioni epatiche, nausea, vomito Polimixine (polimixina B, colistina): Polipeptidi ciclici prodotti dal genere Bacillus Interagiscono specificatamente con i lipidi di membrana esterna (Gram-negativi) distruggendone il doppio strato fosfolipidico ed alterandone la permeabilità Meccanismo di azione simile ai disinfettanti (elevata nefrotox) Spettro esteso, uso topico (associata a bacitracina)
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19 Inibitori della sintesi proteica (Aminoglicosidi, Tetracicline, Cloramfenicolo, Macrolidi, Lincosamidi) La selettività dell azione di questi antibiotici risiede nelle sostanziali differenze esistenti tra i ribosomi procariotici ed eucariotici e nel processo di sintesi proteica
20 Inibitori della subunità 30 S Aminoglicosidi Naturali (Streptomyces, Micromonospora): Streptomicina Neomicina Kanamicina Gentamicina Tobramicina Sisomicina Semi-sintetici: Amikacina Netilmicina
21 Inibitori della subunità 30 S Aminoglicosidi Meccanismi di azione (attività rapida battericida) 1. Penetrazione dell antibiotico nella cellula dove si lega irreversibilmente alla subunità 30S ribosomiale, con formazione di un prodotto proteico anomalo (non funzionale) 2. Parte della proteina anomala viene inserita a membrana generando dei pori che favoriscono l ingresso di ulteriori quantità di antibiotico 3. Concentrazioni elevate dell antibiotico impediscono il legame all m-rna di tutti i ribosomi, causando il blocco di sintesi proteica Induzione di errori nella lettura dei codoni di RNA-m (streptomicina-dipendenza)
22 Inibitori della subunità 30 S Aminoglicosidi Esteso spettro di azione: Inattivi nei confronti degli anerobi Gram-positivi e Gram-negativi (infezioni gravi da P. aeruginosa, Enterobacter spp) Tossicità: Nefrotossicità Ototossicità (perdita cellule ciliate e danno permanente all organo del Corti) Blocco neuromuscolare
23 Inibitori della subunità 30 S Tetracicline Streptomyces spp. struttura tetraciclica
24 Inibitori della subunità 30 S Tetracicline Meccanismo di azione: Attività batteriostatica Legano reversibilmente la sub-unità 30S ribosomiale batterica, inibendo l attacco dell aminoacil-rna-t met e bloccando la formazione del complesso attivo traslazionale (polisoma). Possono inoltre inibire la sintesi proteica eucariotica, ma raramente raggiungono concentrazioni tossiche
25 Inibitori della subunità 30 S Tetracicline Esteso spettro di azione: Gram-positivi (acne), Gram-negativi (infezioni vie aeree) Ricketsie (trattamento di elezione) Clamidie (trattamento di elezione) Spirochete Alcuni protozoi Tossicità: Superinfezioni (eliminazione flora commensale) Colorazione dei denti in via di sviluppo
26 Inibitori della subunità 50 S Macrolidi, cloramfenicolo, lincosamidi Macrolidi Streptomyces Nucleo lattonico macrociclico con funzione chetonica Eritromicina Roxitromicina Azitromicina Claritromicina Cloramfenicolo Streptomyces venezuelae Lincosamidi (lincomicina, clindamicina)
27 Inibitori della subunità 50 S Macrolidi, cloramfenicolo, lincosamidi Meccanismo di azione: Attività batteriostatica Legano, competendo per lo stesso sito, i ribosomi liberi a livello della sub-unità 50S disaccoppiando il processo di formazione del legame peptidico con l attacco di nuovi ribosomi all RNAmessaggero. Conseguentemente, si assiste al blocco della sintesi proteica.
28 Inibitori della subunità 50 S Macrolidi, Cloramfenicolo, Lincosamidi Spettro di azione: Macrolidi Infezioni da patogeni intracellulari: Chlamydia Campylobacter Mycobacterium spp. Polmonite da Mycoplasma pneumoniae Legionellosi Cloramfenicolo Gram+, Gram- Lincosamidi Anaerobi obbligati (clindamicina)
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30 Rifampina, Rifamicina, Rifampicina, Rifabutina (battericidi) Antibiotici (Nocardia mediterranea) Meccanismo di azione legano la subunità β della RNApolimerasi DNA-dipendente, bloccando l inizio della sintesi di mrna. Tossicità selettiva differenze nella struttura della RNApolimerasi batterica rispetto a quella eucariotica Spettro di azione esteso, ma impiegati soprattutto nel trattamento della tubercolosi
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32 Chinoloni (battericidi) acido nalidixico, ciprofloxacina, ofloxacina, norfloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, sparfloxacina Chemioterapici Meccanismo di azione legano la subunità GyrA della DNA girasi e la subunità ParC della topoisomerasi IV, prevenendo la despiralizzazione del DNA e, quindi, la sua sintesi. Tossicità selettiva differente struttura enzimatica tra procarioti ed eucarioti Spettro di azione Cocchi Gram-positivi ed infezioni delle vie urinarie
33 Novobiocina (battericida) Antibiotico (Streptomyces spheroides, S. niveus) Meccanismo di azione lega la subunità GyrB della DNA girasi (topoisomerasi II), prevenendo la despiralizzazione del DNA e, quindi, la sua sintesi. Tossicità selettiva differente struttura enzimatica tra procarioti ed eucarioti Spettro di azione azione sinergica con quella dei chinoloni
34 Chemioterapici antimetaboliti
35 acido p-aminobenzoico + idrossimetil-diidropteridina Sulfamidici Via biosintetica dei folati acido diidrofolico Trimethoprim Diidropteroatosintetasi acido diidropteroico Diidrofolato- sintetasi Diidrofolatoreduttasi Timidina acido tetraidrofolico Purine Metionina Serina
36 Sulfamidici (batteriostatici) Meccanismo di azione agiscono come analoghi strutturali dell acido p-aminobenzoico inibendo, in maniera competitiva, la formazione di acido diidropteroico. Tossicità selettiva via biosintetica dei folati presente nei soli batteri Spettro di azione Esteso spettro di azione verso Grampositivi e Gram-negativi; usati primariamente nel tratto urinario e nelle infezioni da Nocardia. Terapia combinatoria usati in combinazione con il trimethoprim inibiscono la via dei folati a due differenti livelli, prevenendo l emergenza di ceppi resistenti.
37 Trimethoprim, Metotrexato, Pirimetamina (batteriostatici) Meccanismo di azione legano la diidrofolato-reduttasi, inibendo la formazione di acido tetraidrofolico. Tossicità selettiva sebbene la via metabolica sia comune ai procarioti ed eucarioti, l enzima batterico mostra maggiore affinità per il trimethoprim. Spettro di azione Estesa attività verso batteri Gram-positivi e Gram-negativi; usati primariamente nel tratto urinario e nelle infezioni da Nocardia. Terapia combinatoria - usati in combinazione con i sulfamidici inibiscono la via dei folati a due differenti livelli, prevenendo l emergenza di ceppi resistenti.
38 Resistenza ai farmaci antibatterici Tipologie di resistenza: Resistenza innata Gram-negativi vs penicilline (membrana esterna) Clamidie e Micoplasmi vs β-lattamici (assenza di parete) Resistenza acquisita Mutazione spontanea (resistenza cromosomica) Acquisizione (coniugazione, trasduzione) di determinanti genetici a localizzazione plasmidica o transposonica (Gram-negativi) Significato clinico della resistenza I ceppi resistenti sopravvivono in presenza di concentrazioni raggiunte in vivo a livello sierico dall antibiotico in seguito a somministrazione di normali dosi terapeutiche. La resistenza predice il possibile fallimento della terapia antibiotica.
39 Antibiotico-resistenza Meccanismi Modificazione del bersaglio del farmaco Penicillin-binding proteins (penicilline, cefalosporine) DPS (sulfamidici), DHFR (trimethoprim) Subunità DNA-girasi (chinoloni, novobiocina) Subunità-β della RNA-polimerasi (rifamicine) Subunità 50S (macrolidi, lincosamidi) Inattivazione enzima attivante il profarmaco Mutazione katg (isoniazide) Alterate nitroreduttasi (composti nitroeterociclici) Alterata permeabilità Minore influsso (Pseudomonas vs aminoglicosidi) Maggiore efflusso (tetracicline) Inattivazione enzimatica del farmaco Produzione di trasferasi (aminoglicosidi) Produzione di β-lattamasi (β-lattamine)
40 β-lattamasi Enzimi in grado di idrolizzare, inattivandole, le β- lattamine per apertura del nucleo lattamico: Penicillinasi ( ac. penicilloico) Cefalosporinasi ( ac.cefalosporoico) Localizzazione: Gram-positivi: inducibili, esocellulari Gram-negativi: costitutivi, intracellulari (spazio peripl.) Controllo: plasmidico (S. aureus, P. aeruginosa, H. influenzae) trasposonico (Tn2-Tn3, Enterobacteria/ Pseudomonas) Cromosomico (cefalosporinasi nei Gram-negativi)
41 Resistenza ai β-lattamici
42 Antibiotico-resistenza: il problema medico Meticillino-resistenza negli stafilococchi decessi/anno negli USA Circa il 50% delle infezioni nosocomiali è resistente ad almeno 1 antibiotico Esito infausto per il 90% dei pazienti affetti da tubercolosi multi-resistente
43 abuso / uso non corretto degli antibiotici Lo sviluppo della resistenza è correlato al livello di impiego degli antibiotici L abuso (uso non corretto) ha aumentato l incidenza e la selezione delle mutazioni inducenti resistenza: Profilassi in chirurgia Uso empirico (agente eziologico ignoto) Aumentato uso di antibiotici a spettro esteso Antibiotici (probiotici) nei mangimi animali Uso pediatrico per infezioni virali Scarsa compliance del paziente
44 Come controllare il problema Evitare l impiego ripetuto della stessa molecola Modificare l antibiotico per eludere il meccanismo di resistenza Usare combinazioni antibiotiche Ridurre il consumo di antibiotici educazione sanitaria, limitare l uso di mangimi animali Aumentare la compliance del paziente educazione sanitaria Sviluppo di nuove molecole Peptidi naturali: magainine (da rane e squali) Ottimizzazione delle tecniche per la determinazione dell antibiotico-sensibilità
45 Tests di antibiotico-sensibilità Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-s è di predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica. I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici. I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità dei risultati. I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l esperienza professionale.
46 Tests di antibiotico-sensibilità Definizioni MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura quantitativa dell attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) pubblica i criteri per la interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie interpretative). Categorie Interpretative (Sensibilità, S Intermedia, Resistenza) individuate da valori di MIC detti breakpoints (soglia, limite)
47 Interpretazione dei risultati BREAKPOINTS I breakpoints vengono individuati dalla NCCLS in base a: Livelli raggiunti in vivo (sangue, tessuti) dall antibiotico Correlazione tra risultati in vitro (MIC) ed in vivo (risoluzione del caso clinico)
48 Sensibilità Una infezione sostenuta dal ceppo batterico isolato può essere trattata appropriatamente con il dosaggio usuale dell antibiotico testato e raccomandato per il tipo di infezione clinica. Sensibilità Intermedia Gli isolati batterici mostrano MIC corrispondenti a livelli sierici e tessutali di antibiotico per i quali l efficacia potrebbe essere più bassa di quella registrata per gli isolati sensibili. Questa categoria suggerisce l efficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici sono fisiologicamente concentrati (chinoloni nelle urine) o quando l antibiotico può essere utilizzato a concentrazioni più alte di quelle normali (β-lattamici). Resistenza Questa categoria predice il possibile fallimento dell antibiotico testato. I ceppi resistenti non sono inibiti dalle normali concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo dall antibiotico in seguito a somministrazione di dosi normali.
49 Tecniche per la determinazione in vitro dell antibiotico-sensibilita Brodo diluizione (micro- e macrometodo) Diffusione in agar (Kirby-Bauer) Agar diluizione Sistemi Automatizzati
50 Brodo diluizione Semina inoculo batterico (5 x 10 5 cfu/ml) Incubazione a 37 C per 18 h
51 Brodo diluizione NCCLS-breakpoints ANTIBIOTICO S I R Piperacillina Cefazolina Cefotaxime Cefpodoxime Imipenem Vancomicina Gentamicina S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza
52 Brodo diluizione VANTAGGI: Automatizzata Riproducibile (standardizzata) Quantitativa SVANTAGGI: Laboriosa (allestimento pannelli antibiotizzati) Costi
53 Tecniche per la determinazione in vitro dell antibiotico-sensibilita Brodo diluizione (micro- e macrometodo) Diffusione in agar (Kirby-Bauer) Agar diluizione Sistemi Automatizzati
54 1 Diffusione in agar (Kirby-Bauer) 2 1. Allestimento brodocoltura da coltura pura 2. Semina brodocoltura Apposizione dischetti antibiotizzati 4. Incubazione (37 C, 18-24h) 5. Misurazione diametro alone di inibizione
55 Diffusione in agar Risultati
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57 Diffusione in agar (Kirby-Bauer) VANTAGGI: Tecnica standardizzata (NCCLS) Flessibilità nella scelta degli antibiotici Facilità di esecuzione Economicità Correlazione tra risultati in vitro (antibiogramma) e risoluzione clinica (risultato in vivo) SVANTAGGI: Impossibilità di totale automatizzazione Produce risultati qualitativi (categorie di sensibilità)
58 Attività battericida di un antibiotico Infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi Focolaio di infezione situato in distretti anatomici difficilmente accessibili all antibiotico Concentrazione Minima Battericida (MBC): La più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica di almeno il 99.9% (1 germe su elude l azione antibiotica) della popolazione iniziale.
59 MIC/MBC test (Brodo diluizione)
60 MBC/MIC killing quotient Tasso di uccisione = MBC / MIC 1-4 per antibiotici battericidi (beta-lattamici, chinoloni) >4 per antibiotici batteriostatici (sulfamidici, tetracicline)
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