Chemioterapia delle infezioni batteriche
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- Feliciano Filippi
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1 Chemioterapia delle infezioni batteriche Antibiotico Era definito una sostanza naturale che prodotta da un microrganismo era in grado di inibire la crescita di altri microrganismi Definizione che oggi è sostituita da: una sostanza prodotta da un microrganismo o una sostanza analoga (prodotta interamente o per sintesi chimica) la quale a basse concentrazioni inibisca la crescita di altri microrganismi.
2 Antibiotici Fonti principali per ottenere gli antibiotici: 1) microrganismi (Penicillium, Cephalosporium, Streptomyces) 2) per sintesi chimica (chinoloni, monobattami, cloramfenicolo etc) 3) Semisintesi (partendo da una struttura base, ottenuta per estrazione (fermentazione) e aggiungendo catene di sintesi
3 Antibiotici Principio della tossicità selettiva: E' la capacità degli antibiotici di risultare tossici esclusivamente nei confronti dei microrganismi e non nei confronti delle cellule eucariotiche.
4 Classificazione secondo lo SPETTRO D'AZIONE Si intende per spettro d'azione, il ventaglio delle specie batteriche nei riguardi delle quali l'antibiotico mostra attività. ampio: Lo spettro d'azione sarà: la molecola è attiva verso batteri Gram positivi e negativi medio: la molecola è attiva ad es. verso batteri Gram positivi e verso taluni Gram negativi ristretto: la molecola è attiva ad es. solamente verso batteri Gram positivi o solo verso Gram negativi
5 Antibiotici Schema razionale di un agente antimicrobico: Selezionare un target appropriato, Identificare la struttura chimica, Modificare il componente per favorirne la potenza, Valutare l attività in vitro, Valutare l attività in vivo e la tossicità, Trials clinici.
6 Antibiotici Classificazione degli antibiotici in base al tipo di attività antibatterica: Antibiotici ad attività battericida: capaci di uccidere la cellula batterica (MCB). Antibiotici ad attività batteriostatica: capaci di inibire la moltiplicazione della cellula batterica (MIC). L'azione batteriostatica o battericida di un antibiotico dipendono dal meccanismo d'azione. Saranno battericidi gli antibiotici che agiscono su strutture fondamentali per la cellula batterica quali: la parete o gli acidi nucleici. Se l antibiotico è battericida i valori di MIC e MBC coincidono. Se l antibiotico è batteriostatico i valori di MIC e MBC sono differenti (MBC>MIC)
7 Antibiotici Proprietà di un nuovo antibiotico: Selettività, Ampio spettro d attività, Attività battericida, Non tossico per l ospite, Emivita lunga nel plasma, Buona distribuzione nei tessuti, Basso legame con le proteine plasmatiche, Somministrazione per via orale e parenterale, Nessuna interferenza con altri farmaci.
8 CARATTERISTICHE IDEALI TOSSICITA SELETTIVA SCARSA O NULLA ATTIVITA SULLA FLORA COMMENSALE ASSENZA DI EFFETTI COLLATERALI LOCALI E/O SISTEMICI ASSENZA DI RESISTENZE NELLA POPOLAZIONE MICROBICA
9 Antibiotici Classificazione degli antibiotici in base al meccanismo d azione: a) Antibiotici che interferiscono con la sintesi dei mucopeptidi della parete cellulare. b) Antibiotici che modificano la permeabilità della membrana citoplasmatica. c) Antibiotici che interferiscono sulla sintesi delle proteine batteriche (a livello extraribosomiale), a livello ribosomiale (subunità 30S, 50S ). d) Antibiotici che interferiscono con il metabolismo degli acidi nucleici. e) Antibiotici che agiscono in quanto antimetaboliti.
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12 SINTESI PARETE CICLOSERINA FOSFOMICINA GLICOPEPTIDI BACITRACINA PENICILLINE CEFALOSPORINE MONOBATTAMI CARBAPENEMI METABOLISMO ACIDO FOLICO SULFAMIDICI TRIMETOPRIM BERSAGLI DEGLI ANTIBIOTICI PABA MEMBRANA POLIMIXINE DNA POLIMERASI NOVOBIOCINA DNA THF DHF DNA GIRASI TOPOISOMERASI CHINOLONI mrna SINTESI PROTEICA trna MUPIROCINA PUROMICINA RNA POLIMERASI RIFAMPICINA SINTESI PROTEICA Inibitori 50S MACROLIDI CLORAMFENICOLO LINCOSAMIDI KETOLIDI SINERGISTINE SINTESI PROTEICA Inibitori 30S TETRACICLINE SPECTINOMICINA STREPTOMICINA AMINOGLICOSIDI NITROFURANI TIGECICLINA
13 1. Antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare Tale inibizione si può verificare: A) a livello terminale (fase di transpeptidizzazione) Penicilline, Cefalosporine. B) nella seconda fase (trasferimento e polimerizzazione del mucopeptide parietale) Vancomicina. C) nella prima fase di sintesi (inibizione della fosfoenolpiruvato transferasi): Fosfomicina oppure (mancata utilizzazione della alanina): Cicloserina.
14 Rosso: inibitori prima tappa Verde: inibitori seconda tappa Blu: inibitori terza tappa
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16 Meccanismi di resistenza antibatterica Con questo termine si indica, in generale, il fenomeno per cui i batteri possono sopravvivere e moltiplicarsi in presenza di un farmaco antibatterico. Dal punto di vista clinico, si parla di chemioresistenza quando i batteri patogeni non sono inibiti da un farmaco antibatterico nella sede d infezione e il farmaco risulta di conseguenza inefficace.
17 Resistenza antimicrobica Cause della resistenza antimicrobica: - Un uso sproporzionato di antibiotici sia nell uomo che negli animali. - Trasmissione favorita dal contatto personale. - Ampia disseminazione attraverso viaggi..
18 Meccanismi di resistenza antibatterica L espressione di un fenotipo di chemioresistenza è dovuta a un meccanismo biochimico che la cellula batterica mette in atto per bloccare l interazione del farmaco con Il bersaglio molecolare. Ogni meccanismo di resistenza è a sua volta dipendente dai determinanti genetici di resistenza.
19 Meccanismi di resistenza antibatterica I principali meccanismi biochimici di resistenza sono rappresentati da: a) Inattivazione del farmaco b) Modificazione del bersaglio molecolare del farmaco c) Impermeabilità al farmaco o efflusso attivo, che ne impediscono l accesso al bersaglio molecolare.
20 Meccanismi di resistenza antibatterica a) Meccanismi di resistenza per inattivazione del farmaco In questo caso l espressione del fenotipo di resistenza consegue alla produzione di enzimi capaci di modificare il farmaco in modo tale da pregiudicarne l interazione con il bersaglio molecolare. Es. resistenza ai beta-lattamici agli aminoglicosidi al cloramfeniclo
21 Meccanismi di resistenza antibatterica Gli enzimi che inattivano i Meccanismi di resistenza antibatterica-lattamici (detti ß-lattamasi) agiscono idrolizzando l anello ß-lattamico, che rappresenta la componente della molecola indispensabile all effetto biologico. L anello ß- lattamico idrolizzato non è più in grado d interagire con il bersaglio molecolare (le PBP)e, di inibire la sintesi della parete cellulare. Le ß-lattamasi appartengono a 2 famiglie principali: ß- lattamasi a serina e metallo ß lattamasi, a seconda delle caratteristiche del sito attivo. Le ß-lattamasi a serina sono le più diffuse tra i patogeni di isolamento clinico; le metallo ß-lattamasi sono più rare anche se sono più temibili per il loro spettro di attività molto ampio, e per la loro insensibilità agli inibitori delle ß-lattamasi a serina usati in terapia.
22 Meccanismi di resistenza antibatterica Nei batteri Gram negativi, le ß-lattamasi rappresentano il più importante meccanismo di resistenza agli antibiotici ß- lattamici. I principali problemi di resistenza causati dalle ß- lattamasi sono rappresentati da: a) resistenza alle cefalosporine di 3 e 4 generazione negli enterobatteri, mediata dalla produzione delle ß-lattamasi a spettro esteso (extended-spectrum beta-lactamases, ESBL) o delle ß-lattamasi di tipo AmpC; b) resistenza ai carbapenemi negli enterobatteri, in P.aeruginosa e in Acinetobacter, mediata dalla produzione di ß-lattamasi attive nei confronti dei carbapenemi (metallo-ß-lattamasi e carbapenemasi a serina).
23 Meccanismi di resistenza antibatterica Gli aminoglicosidi e il cloramfenicolo possono essere inattivati ad opera di enzimi che ne modificano la struttura molecolare mediante l aggiunta di gruppi chimici, impedendo a questi farmaci di interagire con il ribosoma, e conseguentemente di inibire la sintesi proteica. Gli aminoglicosidi possono subire l inattivazione d opera di acetiltransferasi (enzimi AAC), nucleotidil-transferasi (enzimi ANT) e fosfotransferasi (enzimi APH), che aggiungono alla molecola del farmaco rispettivamente gruppi acetili, adenili, fosfati. Anche il Cloramfenicolo può subire l inattivazione mediante l aggiunta di un gruppo acetile ad opera di acetil-transferasi (enzimi CAT). Recentemente è stata scoperta una variante di una aminoglicosideacetil-transferasi che ha acquisito per mutazione, la capacità di acetilare, inattivandoli, non solo gli aminoglicosidi, ma anche alcuni fluorochinoloni. Tale enzima detto AAC(6 )-Ib-cr, rappresenta il primo esempio di enzima in grado di inattivare farmaci antibatterici appartenenti a due classi diverse.
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25 Meccanismi di resistenza antibatterica b) Meccanismi di resistenza dovuti a modificazione del bersaglio molecolare del farmaco In questo caso l espressione del fenotipo di resistenza è conseguente a una modificazione del bersaglio molecolare che non ne compromette la funzione biologica, ma ne previene l interazione con il farmaco antibatterico. Si deve ad eventi mutazionali che riducono l affinità del bersaglio per il farmaco. Esempi sono: le mutazioni dei geni delle DNA topoisomerasi di tipo II che possono determinare resistenza ai chinoloni, e dalle mutazioni del gene della RNA polimerasi (subunità ß) che possono determinare resistenza alla rifampicina.
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27 Meccanismi di resistenza antibatterica Il bersaglio molecolare può anche subire una modificazione biochimica che lo rende insensibile all antibatterico. Es. di questo meccanismo di resistenza sono rappresentati da: - Metilazione di RNA ribosomiale 23S ad opera di metilasi specifiche (codificate da geni erm) che conferisce resistenza i macrolidi e lincosamidi in molti batteri Gram + -Metilazione di RNA ribosomiale 16S ad opera di metilasi specifiche (codificate da geni rmt e arm) che conferisce resistenza agli aminoglicosidi in batteri Gram negativi.
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29 Meccanismi di resistenza antibatterica In altri casi il bersaglio molecolare può essere protetto dall interazione con il farmaco ad opera di specifiche proteine che vi si legano. I principali esempi di proteine che proteggono il bersaglio sono rappresentati da: - fattori di protezione ribosomiale tet (codificati da geni tet)che proteggono i ribosomi dall interazione con le tetracicline e conferiscono resistenza a questi farmaci; - -fattori di protezione Qnr (codificati da geni qnr), che proteggono le DNA topoisomerasi dall interazione con i chinoloni e conferiscono resistenza a questi farmaci.
30 Meccanismi di resistenza antibatterica Una ulteriore possibilità è che il bersaglio molecolare non venga modificato, ma il batterio acquisisca un nuovo enzima, insensibile all inibizione, in grado di svolgere le stesse funzioni biologiche svolte dal bersaglio molecolare bloccato dal farmaco antibatterico. La meticillino-resistenza in S.aureus,ad es. è conseguente all acquisizione del gene meca che codifica per una PBP (PBP2A)insensibile all azione di quasi tutti i beta-lattamici e in grado di vicariare le funzioni di tutte le altre PBP. I ceppi di S.aureus meticillino-resistenti sono indicati con l acronimo MRSA (meticillina resistenti S.aureus) e sono resistenti a quasi tutti gli antibiotici beta-lattamici.
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32 Meccanismi di resistenza antibatterica Un altro esempio di vicariamento del bersaglio molecolare è rappresentato dalla resistenza a sulfamidici e trimethoprim, che consegue all acquisizione di geni codificanti enzimi DHPS o DHFR con bassa affinità per questi farmaci antibatterici (codificate da geni sul e dfr, rispettivamente). Un altro meccanismo dovuto a modificazione del bersaglio molecolare, responsabile dell acquisizione di un fenotipo di resistenza ai glicopeptidi. Questo emccanismo di resistenza è diffuso negli enterococchi (ceppi VRE, vancomicina resistente enterococchi) ed è stato recentemente documentato anche in S.aureus (ceppi VRSA, vancomicina resistente S.aureus).
33 Meccanismi di resistenza antibatterica c)meccanismi di resistenza dovuti a impermeabilità o efflusso attivo. In tale caso l espressione del fenotipo di resistenza è conseguente al ridotto accesso del farmaco antibatterico al bersaglio molecolare, che può derivare dal fatto che il farmaco non riesce a penetrare gli involucri della cellula batterica (resistenza all impermeabilità) oppure dalla presenza di pompe di efflusso in grado di espellere attivamente il farmaco fuori dalla cellula batterica (resistenza per efflusso attivo). Una scarsa permeabilità della membrana esterna è alla base, ad es. della resistenza dei batteri Gram a certi antibatterici (es.i glicopeptidi). Un es. è rappresentato dalla resistenza ai carbapenemi in P. aeruginosa che può manifestarsi come conseguenza di eventi mutazionali responsabili di una diminuita/mancata espressione del canale preferenziale di ingresso di questi farmaci (la porina oprd2)
34 Meccanismi di resistenza antibatterica I sistemi di efflusso attivo sono in grado di espellere determinate classi di farmaci antibatterici della cellula batterica, utilizzando come fonte di energia ATP oppure il gradiente protonico di membrana. In molti batteri sia essi Gram+ che Gram-esistono dei sistemi di efflusso multidrug. Esempi: sono le pompe di tipo Mex di P.aeruginosa (MexA, MexB, Oprm determina una resistenza ai beta-lattamici, cloramfenicolo, macrolidi, chinoloni, tetracicline); NorA in S.aureus( resistenza ai chinoloni e cloramfenicolo).
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36 Meccanismi di resistenza antibatterica Sistemi in grado di espellere specifiche classi di farmaci antibatterici (pompe di efflusso specifiche).a differenza dei multidrug, sono codificati da geni a localizzazione plasmidica e acquisiti per trasferimento genico orizzontale. Esempi: resistenza alle tetracicline (geni tet) Ai fenicoli (geni cmla e flo) Ai macrolidi (codificati da geni mef), Ai chinoloni (geni qepa, oqxab)
37 Resistenza innata e resistenza acquisita Quando un fenotipo di resistenza è espresso da tutti i ceppi di una specie batterica, la specie viene detta naturalmente resistente a quel farmaco antibatterico. Questa resistenza naturale o intrinseca riflette la presenza di un meccanismo biochimico di resistenza evoluto a livello di specie. Esempi: E. coli è naturalmente resistente ai glicopeptidi perché la membrana esterna è impermeabile a questi farmaci; M. tuberculosis è naturalmente resistente a molti farmaci e per l impermeabilità della parete; La P. aeruginosa è naturalmente resistente a molti Meccanismi di resistenza antibatterica-lattamici perché produce una ß- lattamasi a codificazione cromosomica che viene indotta in loro presenza e li degrada.
38 Resistenza acquisita All interno di una specie batterica naturalmente sensibile ad un dato farmaco antibatterico possono emergere ceppi resistenti. Tale resistenza acquisita, riflette una modificazione genetica recente nel genoma del ceppo resistente e costituisce un carattere ereditabile trasmesso alle cellule figlie. Le basi genetiche della resistenza acquisita includono eventi di mutazione/ricombinazione di geni residenti, oppure l acquisizione di nuovi geni (geni di resistenza acquisiti) mediante fenomeni di scambio genetico orizzontale. La resistenza innata o intrinseca, essendo un carattere prevedibile, non pone particolari problemi al clinico nella scelta della terapia antibiotica. Viceversa, la resistenza acquisita può essere la causa di insuccessi terapeutici, qualora venga instaurata una terapia antibiotica senza aver preventivamente saggiato la sensibilità in vitro del patogeno ai farmaci.
39 Antibiogramma La valutazione della sensibilità in vitro che ha un antibiotico nei confronti di un germe patogeno. Nella pratica clinica questo tipo di test, essenziale per una corretta terapia, permette di vedere quali siano i farmaci più efficaci nei confronti di un certo microrganismo patogeno e fornisce, inoltre, una stima della dose terapeutica più opportuna per la cura della malattia infettiva.
40 Antibiogramma In coltura pura. Batterio in fase esponenziale Terapia mirata Va eseguito per evitare l insorgenza della resistenza agli antibiotici. Per evitare l inibizione della flora microbica commensale.
41 TERAPIA ANTIBIOTICA DELLE INFEZIONI EMPIRICA MIRATA EMPIRICA RAGIONATA
42 Studi epidemiologici Considerazioni cliniche (condizioni generali, patologie associate, gravità dell infezione, età, fattori di rischio,... ) Probabile attuale eziologia. Prevalenza locale della antibiotico resistenza Caratteristiche farmacologiche TERAPIA EMPIRICA
43 RUOLO DEL MICROBIOLOGO CONFERMA DIAGNOSI CLINICA ORIENTAMENTO TERAPEUTICO ISOLAMENTO PATOGENI + ANTIBIOGRAMMA TERAPIA MIRATA
44 TERAPIA MIRATA SEDE DELL INFEZIONE PRELIEVO DEL MATERIALE PATOLOGICO INVIO AL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA ISOLAMENTO, IDENTIFICAZIONE E DETERMINAZIONE DELLA SENSIBILITA IN VITRO SCELTA DELL ANTIBIOTICO DA SOMMINISTRARE
45 MIC e MBC Il metodo più corretto per determinare l efficacia di un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico, la concentrazione minima inibente (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC). MIC (Minimal Inhibitory Concentration): la concentrazione minima di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica. MBC (Minimal Bactericidal Concentration): la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere i batteri.
46 Antibiogramma Due sono i metodi per eseguire L antibiogramma: Metodo per diffusione Metodo per diluizione
47 Metodo per diffusione o metodo di Kirby.Bauer Metodo qualitativo Nel metodo dei dischetti di diffusione il microrganismo in esame viene coltivato su piastre di agar in presenza di antibiotici contenuti in dischi: se il microrganismo cresce normalmente significa che è resistente, se invece è sensibile si rende visibile attorno al disco un alone di inibizione. È un metodo quali-quantitativo, semplice, rapido ed economico, valido per microrganismi aerobi a crescita rapida. È il procedimento più comunemente usato in laboratorio, e permette di ottenere una valutazione della MIC. Attualmente il test di diffusione su dischetto più utilizzato è il metodo di Kirby-Bauer, sviluppato agli inizi degli anni 60.
48 ANTIBIOGRAMMA Si allestiscono piastre con idoneo terreno solido inoculate con una quantità di batteri sufficiente a dare uno sviluppo confluente che provochi una patina uniforme sul terreno
49 Subito dopo l inoculo si depongono sulla superficie della piastra una serie di dischetti di carta assorbente sterili imbevuti di adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare. Si divide la piastra in spicchi, uno per ciascun antibiotico, e si deposita al centro di ogni spicchio il dischetto corrispondente, con l aiuto di una pinzetta sterile. Si pongono le piastre in incubatore a 37 C per ore. Si misura il diametro degli aloni di inibizione per ogni antibiotico.
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51 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
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53 Antibiogramma E-test Determinazione della MIC
54 E-test
55 Metodo delle diluizioni progressive Nei test di sensibilità mediante diluizione la sensibilità del microrganismo viene valutata in base alla sua crescita o meno in un terreno di coltura - che può essere solido o liquido - contenente diverse concentrazioni dell'antibiotico. Questo metodo è quantitativo e consente di determinare accuratamente oltre alla MIC anche la MBC (Minimal Bactericidal Concentration), ovvero la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere la totalità dei batteri. Il metodo è valido e preciso, ma purtroppo anche costoso e di lunga attuazione, per cui l'impiego è limitato a pochi casi: trattamenti di affezioni molto serie in cui sia necessario valutare la MBC per determinare il dosaggio dell'antibiotico (es. nelle endocarditi batteriche o osteomieliti); valutazione della sensibilità di microrganismi a lenta crescita (es. micobatteri e actinomiceti);
56 TEST DI DILUIZIONE Nel test di diluizione in brodo di coltura si prepara una serie di provette di terreno contenenti diverse concentrazioni di antibiotico, e le si inoculano con quantità convenzionali dell organismo da testare. La concentrazione più bassa di antibiotico che porta ad assenza di crescita dopo ore di incubazione è la MIC. E invece possibile calcolare la MBC se le provette che non presentano crescita sono sottoposte a subcultura in terreno fresco privo di antibiotico: la concentrazione più bassa di antibiotico alla quale il microrganismo non è in grado di crescere quando viene trasferito in terreno fresco equivale alla MBC. Il metodo di diluizione su agar è molto simile al test di diluizione in brodo di coltura: piastre contenenti quantità variabili di antibiotico si inoculano e, quindi, viene valutata la crescita.
57 La Minimum Inhibitory Concentration (MIC) indica una inibizione della crescita e non che il batterio venga ucciso (sebbene in pratica una lunga inibizione della crescita conduca alla eliminazione del batterio attraverso le difese immunitarie dell ospite. La Minimum Bactericidal Concentration (MBC) è generalmente superiore (2-4 volte) la MIC. Dato che comporta la semina del brodo su agar, il test ha delle limitazioni per il tempo che si perde e i costi.
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60 L antibiogramma Oggi i test di sensibilità ai farmaci antibatterici possono essere eseguiti con apparecchiature semi-automatiche in cui i batteri vengono fatti crescere in terreno liquido, in presenza di dosi prefissate dei farmaci e la lettura dei risultati, eseguita da un fotometro registratore, viene interpretata da un elaboratore elettronico, che fornisce in tal modo il significato finale.
61 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI I valori standard di sensibilità variano per ciascun microrganismo e sono basati sulla concentrazione plasmatica di farmaco che può essere raggiunta senza la comparsa di effetti tossici. Questi consentono di classificare il microrganismo in: "sensibile", quando l'antibiotico risulta efficace ai dosaggi comunemente raccomandati, "intermedio", quando la crescita batterica è inibita solo al dosaggio massimo raccomandato, "resistente", quando l'antibiotico dovrebbe essere utilizzato a dosaggi che risulterebbero tossici nell'organismo.
62 PUO IL DATO IN VITRO DI SENSIBILITA O DI RESISTENZA ESSERE UN INDICE DI ASSOLUTA PREDITTIVITA SE TRASFERITO IN VIVO??
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64 E estremamente importante che si ponga la massima attenzione Infezioni a non delle prescrivere alte vie antibiotici respiratorie quando non si è certi che l eziologia sia batterica E estremamente importante che si ponga la massima attenzione a non prescrivere antibiotici quando non si è certi che l eziologia sia batterica
65 TERAPIA RAGIONATA Anche nella terapia antibiotica è utile mantenere la logica dei farmaci essenziali : ciascun medico si seleziona nel tempo un proprio prontuario di una decina di molecole, di cui conosce tutto, e continua ad usarle fino a quando non trova altre molecole che abbiano dimostrato, in studi controllati, di essere più efficaci, meno tossiche e con un miglior rapporto costo-beneficio.
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